专利名称：：一种枳壳的炮制方法
技术领域：
：本发明涉及中药炮制领域，特别是一种枳壳的炮制方法。
背景技术：
：枳壳为芸香科柑橘属植物酸橙(CitrusaurantiumL.)及其栽培变种的干燥未成熟果实。性温，味苦、辛、酸，归脾、胃经，具有理气宽中，行滞消胀之功效，主治胸胁气滞，胀满疼痛、食积不化，痰饮内停，胃下垂，脱肛，子宫脱垂等。现代研究表明，枳壳中主要含有挥发油、黄酮类、生物碱类成分。黄酮类成分是评价枳壳饮片质量的主要指标。柚皮苷和新橙皮苷是反映枳壳饮片内在质量的定量指标(王发英，徐欢，杨武亮等.枳壳质量标准研究[J].中成药，2009，31(12):1897-1901)，《中国药典》2010版第一部规定枳壳的质量控制的检测指标是柚皮苷和新橙皮苷的含量，采用HPLC法同时控制枳壳药材中柚皮苷和新橙皮苷的含量，该方法简便、准确、重现性好。枳壳在临床上多以炮制品入药。历代医书中记载的炮制方法多达23种炮制方法，如净制、切制、麸炒、炒制、炎制、醋制、制炭、酒制、桨水制、滑制、面炒制、火炮制、煨制、米炒制、萝卜制、巴豆制、巴豆醋制、苍术萝卜子干漆茴香制、槐花制、蒸制、盐制、蜜制等。从炮制方法的变革上看，早期是只去除瓤；而后期是在去除瓤的基础上再采用其他的辅料炮制，是由生制熟的过程。《中国药典》2010版第一部229-230页规定的枳壳的炮制方法是取枳壳，除去杂质，洗净，润透，切薄片，干燥后筛去碎落的瓤核即得。除上述临床上常用"药典法"外，还有独具特色的"樟帮法"炮制的枳壳饮片。中国发明专利申请公开说明书(公开号CN101612234A，公开日2009年12月30日)记载了典型"樟帮法"炮制枳壳的方法先用刀挖去枳壳原料的内囊，洗净泥沙，水浸6-24小时，用铁质的压件挤压浸润后得到枳壳原料；再将枳壳原料上木架，在30-35t:、相对湿度60-80%的环境中放置6-8天或14-20天使其自然发酵，取出洗干净表面，切片；最后晒干得到枳壳饮片，俗称凤眼片。在上述过程中，枳壳经特定的某种真菌发酵可产生具有药理活性的橙皮素。但上述自然发酵工艺很不容易掌握，易造成炮制品合格率低，炮制过程中受污染的枳壳照片见图1。另外，该方法对温度、湿度要求高(温度30-35t:，湿度60-80%)，秋、冬、春季生产需用控温控湿的特殊设备，时间长(6-8天或14-20天)；上述诸多原因造成樟帮法炮制的枳壳生产效率低、成本高，质量难以控制。
发明内容本发明的目的是提供一种快速、简便的枳壳炮制方法，利用该方法能够确保炮制后枳壳的质量。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是—种枳壳的炮制方法，取枳壳原药材，去除内囊，洗净泥沙，得到枳壳净药材，水润6-12小时，压制后上木架，人工接种枳壳净药材重量0.005-0.3%的毛霉，在16-35t:、相对湿度60-99%的环境中放置24-120小时，取出，切片，干燥即得枳壳饮片。本发明所述毛霉优选自总状毛霉、鲁氏毛霉、高大毛霉中的一种或几种；更优选自总状毛霉和鲁氏毛霉中的一种或两种；最优选的是总状毛霉。本发明所述人工接种毛霉的量优选为枳壳净药材重量的0.01-0.03%。本发明所述环境的相对湿度优选为77-95%。本发明优选的一种实施方案是取枳壳原药材，去除内囊，洗净泥沙，得到枳壳净药材，水润6-12小时，压制后上木架，人工接种枳壳净药材重量0.01%的总状毛霉，在28°C、相对湿度92%的环境中放置48小时，取出，切片，干燥即得枳壳饮片。典型樟帮法炮制枳壳的过程实际上是在一定温度、湿度条件下，一方面保证其成型，形成凤眼片，同时使枳壳经过某种特定真菌的发酵作用。枳壳上真菌的种类和数量是决定炮制后枳壳质量的关键因素。只有使上述因素可控，才能保证炮制品的合格率。毛霉，又叫黑霉、长毛霉，拉丁名Mucor，接合菌亚门接合菌纲毛霉目毛霉科真菌中的一个大属。以孢囊孢子和接合孢子繁殖。菌丝无隔、多核、分枝状，在基物内外能广泛蔓延，无假根或匍甸菌丝。不产生定形菌落。菌丝体上直接生出单生、总状分枝或假轴状分枝的孢囊梗。各分枝顶端着生球形孢子囊，内有形状各异的囊轴，但无囊托。囊内产大量球形、椭圆形、壁薄、光滑的孢囊孢子。孢子成熟后孢子囊即破裂并释放孢子。有性生殖借异宗配合或同宗配合，形成一个接合孢子。某些种产生厚垣孢子。毛霉菌丝初期白色，后灰白色至黑色，这说明孢子囊大量成熟。毛霉菌丝体每日可延伸3厘米左右，生产速度明显高于香菇菌丝。毛霉广泛分布于酒曲、植物残体、腐败有机物、土壤、粪便、禾草及空气中，在高温、高湿度以及通风不良的条件下生长良好。代表种如总状毛霉(M.racemosush高大毛霉(M.mucedoh鲁氏毛霉(M.rouxia皿s)等(魏景超.真菌鉴定手册[M].上海上海科学技术出版社，1979)。毛霉的用途很广，常出现在酒药中，能糖化淀粉并能生成少量乙醇，产生蛋白酶，有分解大豆蛋白的能力，许多毛霉还能产生草酸、乳酸、琥珀酸及甘油等，有的毛霉能产生脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等。毛霉具有重要工业应用，比如高大毛霉能产生了羟基丁酮、脂肪酶；鲁氏毛霉不仅用于酿造工业，还可用于做豆腐乳；总状毛霉用于制造豆豉。，总状毛霉(M.racemosus)、高大毛霉(M.mucedo)、鲁氏毛霉(M.rouxia皿s)等可以从中国工业微生物菌种保藏管理中心、或河南省焦作市调味品研究所菌种曲精厂等地购买。本发明的发明人通过对典型樟帮法炮制的枳壳饮片进行分离，鉴定，发现优势菌是总状毛霉。具体的试验过程如下(—)真菌的分离取典型樟帮法炮制过程中上架长霉的枳壳，用消毒后的剪刀剪取适量长霉枳壳，研碎稀释混悬。混悬液涂布接种于玫瑰红钠培养基，恒温培养箱中活化培养；在培养基经过经3次纯化后，获得优势单菌落菌株。(二)真菌菌落形态观察及分离鉴定2.1、菌落形态观察分别在在霉菌培养基上划线接种上述获得的优势单菌落菌株，28t:恒温培养，连续几天观察菌落外观形态、颜色、菌丝生长情况等。菌丝体在基质和基质里广泛蔓延，菌丝白色透明，孢子囊初期无色，后为灰褐色。2.2、显微形态观察将单菌落的菌株制片后在显微镜下观察菌丝形态、孢子形状，记录观察结果并拍照，照片见图2。显微镜下观察，发现菌丝体均为无隔膜的单细胞多核，以孢子囊孢子繁殖，有假根和葡匍枝，孢子囊梗直接由菌丝体生出，单生分枝少，有的不分枝，分枝顶端有膨大的孢子囊，囊轴与孢囊梗相连处无囊托。2.3、鉴定综合上述菌落形态和菌株显微形态，对菌株进行鉴定，确定所分离得到的优势菌为总状毛霉(Mucorracemosus)。下面通过试验具体说明本发明方法的建立1.典型樟帮法条件的确定首先对中国发明专利申请公开说明书(公开号CN101612234A，公开日2009年12月30日)记载的典型樟帮法炮制枳壳的方法的温度、湿度、时间条件进行了优选以柚皮苷含量、橙皮苷含量、新橙皮苷含量、霉变性状、成型性状为评价指标。1.1正交实验因素水平确定表l因素水平表a温度rc)b相对湿度(％)c时间(天)~~1Ii^i2208533.24924_^_^_22_^_1.2实验评价指标1.2.1样品含量测定取炮制好的枳壳样品粉末0.5g，，采用《中国药典》2010版第一部229-230页收载的高效液相法测定枳壳中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的含量。1.2.2样品霉变性状得分根据样品的霉变程度和成型性进行评分，评分标准见表2、表3:表2外观霉变评分表外观性状霉变性状评分分值白色霉斑、霉菌黑色或绿色5白色霉斑、霉菌稍有黑色或绿色7.5布满白色霉斑、菌丝(最好)10白色霉斑、菌丝较多7.5白色霉斑、菌丝较少5略见霉斑、菌丝2.55_表3外观成型评分表_评分分值外观性状_10成型性好6成型性良好0不成型_1.2.3正交实验及结果取药材按樟帮法要求上架后，按正交设计表进行实验。以时间、湿度、温度为考察因素，以柚皮苷含量、橙皮苷含量、新橙皮苷含量、霉变性状、成型性状为评价指标。正交实验安排及结果见表4。分析结果如下，表4樟帮法生枳壳饮片正交实验表温度湿度时间柚皮苷含量橙皮苷含量新橙皮苷含量成型霉变性状。C%沃)(mg/g)(mg/g)_(mg/g)分值分值111134.292.23631.1302.5211225.661.65723.9402.5311327.341.92327.3107.5411428.48L84823.0907.5522132.652.47935.4802.56612234.062.18129.9905.012328.181.38821.5407.5812425.581.56120.9605.091136.942.62931.4907.51013231.032.14428.3607.5111334.613.05636.24610.0121431.291.59226.12107.51314125.371.80324.2107.51414227.851.82723.5407.51514328.792.02824.3565.01614436.782.25531.58107.51721141.382.83236.5205.01821222.65L50621.3605.01921338.612.29033.9607.52021422.681.71720.6307.52122123.401.51018.9605.02222220.201.44517.7605.02322318.981.46218.8107.52422426.651.42622.9707.52523127.301.71422.5205.02623231.061.68825.9705.027223.581.64922.8907.52823425.561.75321.9907.52924126.641.57124.0205.03024225.721.49923.9905.03124323.241.62320.0907.53224429.942.04426.7707.53331122.151.41618.7205.03431235.111.71926.55010.03531329.852.60530.97010.0361427.591.43923.1805.03732122.721.56119.8302.53832226.751.85827.5107.5392330.181.53524.9807.54032426.421.65822.62010.04133124.841.72922.3205.04233226.001.67322.4205.043328.571.88323.44107.54433425.471.64821.74105.04534121.751.68620.0505.04634224.641.55419.8207.5474322.891.34317.59610.04834427.10l.謝21.091010.04941123.511.44319.7205.05041234.131.77324.63010.05141325.721.45221.41010.05241437.531.80134.9207.55342127.526.79321.5207.55442236.812.02331.23010.0554228.512.24524.09010.05642432.731.72930.0307.5574132.661.57528.401010.0584229.451.97925.331010.0594331.351.45024.911010.060443謹1.77632.24107.56144133.002.03631.0465.086244232.391.56526.87105.06344332.222.03730.13107.56444445.451.89339.52107.51.2.4实验结果分析以不同工艺的因素为自变量，饮片的柚皮苷含量，橙皮苷含量，新橙皮苷含量、成型和霉变性状的标准化值为评判指标，用13.0版SPSS统计软件进行相关性和方差分析，结果见表5至表6。表5方差分析表(n=64)因素离差平方和临界值自由度方差显著差总和0.923119.3475.00050.0000.000A0.6252.73415.000156.0000.001B0.5212.18815細156,0000，C0.6022.61215.000156.0000.0026变量分析表(n=64)指标A平均值B平均值C平均值误差16°C0.4372天0.36077%0.4080.04620°C0.2933天0.37784%0.3250.046彻汉百24°C0.2794天0.35292%0.4110.04628°C0.5135天0.43499%0.3780.04616°C0.1272天0.15577%0.0940.033鹏依荘20°C0.0723天0.07684%0.0300.033位反百24°C0.0644天0.09792%0.0970.03328°C0.1385天0.07499%0.0810.03316°C0.4502天0.35577%0.3890.056宰f裕由存20°C0.2793天0.35684%0.3040.056祈但议百24°C0.2324天0.34692%0.3850.05628。C0.4695天0.39399%0.3520.05616°C0.2002天0.10077%0扁0.07020°C0.0033天0.12584%0細0扁P乂坐24°C0.2254天0.30092%0.4750.07028°C0.4755天0.37599%0.4750.07016°C0.5002天0.37577%0.5620.059霉变性状20°C0.5003天0.56284%0.5630.05924°C0.6044天0.77192%0.6460.05928°C0.7505天0.64699%0.5830.059表4显示在炮制工艺中，温度、时间、湿度对工艺有显著影B向，影响程度依次是温度>时间>湿度。综合分析，典型樟帮法枳壳炮制的最佳工艺为A4B2C3，即温度28°C，时间3天，湿度92%工艺为佳。另取枳壳进行了3批验证实验。结果说明正交设计筛选出工艺稳定。2在此最佳工艺条件的中的湿度、温度条件下分别人工接种占枳壳净药材重量0.01%、0.02%、0.03%的总状毛霉，于接种后2天与3天分别取样，进行相关质量指标的检测，结果见表7。表7人工接种条件筛选<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>从上可以看出，采用人工接种霉菌，在2天的成型性、霉变性状良好，且含量和3天相比无明显差异，故人工接种发酵时间定为2天，即48小时。因此，本发明方法最佳工艺为:即温度28°C，时间2天，湿度92%，接种量0.01%。以上述最佳工艺条件，按照本发明所述方法制备9批枳壳饮片，同时平行地按照中国发明专利申请公开说明书(公开号CN101612234A)记载的方法制备典型樟帮法枳壳饮片；测定两种方法制备的枳壳饮片中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量，结果见表8。表8本发明方法和典型樟帮法制备的枳壳饮片含量比较<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>本发明最优选方案所述炮制方法制备的枳壳饮片与典型樟帮法炮制的枳壳饮片无区别，见图3和4。通过对典型樟帮法饮片与新方法制得樟帮法饮片的高效液相色谱分析(高效液相图谱见图5和6)，本发明方法所得的枳壳饮片与典型"樟帮法"制得的枳壳饮片的化学成分一致。典型"樟帮法"制备的枳壳饮片的柚皮苷含量平均为46.9mg/g，橙皮苷含量平均为2.03mg/g，新橙皮苷含量平均为33.96mg/g;本发明方法制备的枳壳饮片柚皮苷含量平均为54.56mg/g，橙皮苷含量平均为2.134mg/g，新橙皮苷含量平均为38.55mg/g，表明本发明方法制备的枳壳饮片柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量都高于典型樟帮法制备的枳壳饮片。本发明方法生产周期短，一年四季均可生产，无需特定的恒温恒湿设备，稳定可控，适合大生产等特点。本发明改变了传统"樟帮法"炮制枳壳基本依赖自然条件的状况，从而使炮制过程可控，保证了饮片质量。图1是炮制过程中受污染的枳壳饮片的照片图2分离出的毛霉单菌落的菌株显微照片图3是典型樟帮法炮制的枳壳饮片的照片图4是本发明方法制备的枳壳饮片的照片图5是典型"樟帮法"炮制的枳壳饮片的HPLC图谱，其中1为柚皮苷峰，2为橙皮苷峰，3为新橙皮苷峰。图6是本发明方法炮制的枳壳饮片的HPLC图谱，其中1为柚皮苷峰，2为橙皮苷峰，3为新橙皮苷峰。具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明做具体说明，但本发明并不限于下述实施例。炮制后枳壳含量测定的方法采用《中国药典》2010版第一部229-230页收载的高效液相法测定枳壳中柚皮苷、新橙皮苷含量的方法，其中柚皮苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号110722-200309)、新橙皮苷(由江西中医学院重点实验室杨武亮教授提供，归一法测定含量为99.34%)。实施例1取枳壳原药材10Kg，用刀挖去枳壳原药材的内囊，洗净泥沙，水润6-12小时，压制后上木架，人工接种lg毛霉，在28°C、相对湿度92%的环境中放置48小时，切片，干燥即得枳壳饮片。通过高效液相法测定柚皮苷含量5.611%，新橙皮苷含量为3.833%。实施例2取枳壳原药材10Kg，用刀挖去枳壳原药材的内囊，洗净泥沙，水润6-12小时，压制后上木架，人工接种2g毛霉，在16°C、相对湿度60%的环境中放置120小时，切片，干燥即得枳壳饮片。通过高效液相法测定柚皮苷含量5.465%，新橙皮苷含量为3.752%。实施例3取枳壳原药材10Kg，用刀挖去枳壳原药材的内囊，洗净泥沙，水润6-12小时，压制后上木架，人工接种lg毛霉，在28°C、相对湿度80%的环境中放置72小时，切片，干燥即得枳壳饮片。通过高效液相法测定柚皮苷含量5.%，新橙皮苷含量为3.786%。实施例4取枳壳原药材1Kg，用刀挖去枳壳原药材的内囊，洗净泥沙，水润6-12小时，压制后上木架，人工接种lg毛霉，在16°C、相对湿度77%的环境中放置36小时，切片，干燥即得枳壳饮片。通过高效液相法测定柚皮苷含量5.412%，新橙皮苷含量为3.674%。实施例5取枳壳原药材1Kg，用刀挖去枳壳原药材的内囊，洗净泥沙，水润6-12小时，压制后上木架，人工接种3g毛霉，在30°C、相对湿度80%的环境中放置24小时，切片，干燥即得枳壳饮片。通过高效液相法测定柚皮苷含量5.406%，新橙皮苷含量为3.619%。权利要求一种枳壳的炮制方法，其特征在于取枳壳原药材，去除内囊，洗净泥沙，得到枳壳净药材，水润6-12小时，压制后上木架，人工接种枳壳净药材药材重量0.005-0.3％的毛霉，在16-35℃、相对湿度60-99％的环境中放置24-120小时，取出，切片，干燥即得枳壳饮片。2.根据权利要求l所述的一种枳壳的炮制方法，其特征在于所述毛霉选自总状毛霉、鲁氏毛霉、高大毛霉中的一种或几种。3.根据权利要求1所述的一种枳壳的炮制方法，其特征在于所述毛霉选自总状毛霉和鲁氏毛霉中的一种或两种。4.根据权利要求3所述的一种枳壳的炮制方法，其特征在于所述毛霉为总状毛霉。5.根据权利要求1至4所述的一种枳壳的炮制方法，其特征在于所述人工接种毛霉的量为枳壳净药材重量的0.01-0.03%。6.根据权利要求1至4所述的一种枳壳的炮制方法，其特征在于所述环境的相对湿度为77-95%。7.根据权利要求5所述的一种枳壳的炮制方法，其特征在于所述环境的相对湿度为80-95%。8.根据权利要求1所述的一种枳壳的炮制方法，其特征在于取枳壳原药材，去除内囊，洗净泥沙，得到枳壳净药材，水润6-12小时，压制后上木架，人工接种枳壳净药材重量0.01%的总状毛霉，在281:、相对湿度92%的环境中放置48小时，取出，切片，干燥即得枳壳饮片。全文摘要本发明公开了一种枳壳的新炮制方法取枳壳原药材，去除内囊，洗净泥沙，得到枳壳净药材，水润6-12小时，压制后上木架，人工接种枳壳净药材药材重量0.005-0.3％的总状毛霉，在16-35℃、相对湿度60-99％的环境中放置24-120小时，取出，切片，干燥即得枳壳饮片。本发明方法是对典型樟帮法炮制枳壳的改进。与典型樟帮法制备的枳壳饮片相比，本发明方法制备的枳壳饮片柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量都高于前者。本发明改变了传统樟帮法炮制枳壳基本依赖自然条件的状况，从而使炮制过程可控，保证了饮片质量；而且本发明方法生产周期短，一年四季均可生产，无需特定的恒温恒湿设备，稳定可控，适合大生产。文档编号A61P15/00GK101780168SQ201010119769公开日2010年7月21日申请日期2010年3月8日优先权日2010年3月8日发明者何敏,姚冬琴,张的凤,张金莲,朱卫丰,谢一辉申请人:江西中医学院