透膜肽介导的抗细菌RNA聚合酶σ₇₀因子基因rpoD的反义肽核酸的制作方法

专利名称：透膜肽介导的抗细菌RNA聚合酶σ₇₀因子基因rpoD的反义肽核酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及一组透膜肽介导的抗细菌RNA聚合酶σ 因子基因rpoD的反义肽核 酸抗菌序列及其制备方法和治疗多重耐药菌感染的应用。
背景技术：
面对耐药细菌的迅速蔓延，感染性疾病的致死率继续攀高的严峻形势，控制耐药 细菌的感染造成的危害已经成为各国政府高度关注的焦点，寻找和研制有效控制耐药细菌 感染的新策略和新药物，已成为当今世界各国科学家当务之急的研究目标。经典的抗生素研发重要策略之一是从已有各种类别抗生素中研发新的衍生物。伴 随着抗生素的广泛应用，越来越多的细菌对现有抗生素产生交叉耐药，采用结构修饰和改 造研发新型抗生素受到限制，抗生素研发速度明显减慢。与此同时，新药研发成本越来越 高，研发周期日益延长，许多制药公司逐步退出这一研发领域。美国FDA近20年来新申报 和批准的抗生素数量减少了 56%，在过去的40年中，全球仅有噁唑烷酮类的利奈唑胺和脂 肽类的达托霉素上市成为药品。而且这些新型抗生素应用于临床后，并未避免耐药性的产 生，细菌很快对这些抗生素产生了新的耐药性。当前抗生素耐药菌株的出现速度已经远远 超过了研发新抗生素的速度。为了有效对抗日益严重的细菌耐药，必须寻找新的突破口。反义抗菌剂突破以细菌蛋白为靶点的经典研究思路，根据致病菌体内基因组学相 关信息、以细菌体内增值、致病性、耐药相关基因为靶点，从阻断相关基因的表达入手，进而 达到抑制或杀灭细菌的作用，为抗耐药菌治疗带来了新的希望。与经典的抗生素相比较，反 义抗菌剂具备以下突出的优点①以细菌基因为靶点，选择性高；②应用过程中细菌生存 选择压力低，不易产生耐药性；③靶点为致病基因，其作用不受基因点突变的影响，不会产 生交叉耐药性；④靶点明确，研发成本低。因而反义抗菌剂被认为是被对抗耐药细菌最有希 望的突破口，代表着21世纪分子治疗领域革命性的进展。在硫代反义寡合苷酸、脱氧核酶、肽核酸(ρ印tide nucleid acid，PNA)、磷酰二胺 吗啉代寡核苷酸(PMO)等众多反义分子中，第三代反义分子PNA是较理想的反义抗菌剂先 导化合物。PNA具有特异性强、与靶mRNA亲和性高、通透性好、体内和细胞内稳定性、半衰 期长和毒性低等优点。新近的研究显示，由透膜肽(cell penetrating peptide,CPP)介导 的靶向特定基因的PNA能够选择性抑制大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、肠球 菌、分枝杆菌等细菌体内生存相关基因aCpP、gyrA、rnpB、fmhB、inhA和rRNA，以及耐药相关 基因blaZ、vanA等的表达，进而抑制或杀灭细菌，其抗菌作用可以持续11个小时，细胞内半 衰期可长达48小时。细菌RNA聚合酶(RNAP)是催化转录合成RNA的重要酶，关闭该基因表达，细菌就 会死亡，因而RNAP是很多抗生素作用的靶点。然而目前几乎所有临床常用的作用于RNAP 的抗生素均出现耐药，一些以RNAP为靶点的新型药物尚在研究阶段便出现天然耐药细菌。 细菌RNAP由α 2 β β，4个亚基和σ因子组成。目前几乎所有以RNAP为靶点的抗生素均作用于β或β ’亚基，而β和β ’亚基又是最易发生突变的亚基，这两个亚基突变是导致 多数抗生素耐药，以及不同种类抗生素间发生交叉耐药的主要机理机制。σ 7(|因子广泛分 布于细菌体内，主要功能识别启动子，促使DNA解链，启动RNA转录等重要功能，σ因子缺 失会导致转录停止，进而细菌死亡。σ γο因子的基因序列高度保守，除位于1. 2和2. 1区域 之间的非保守区域外，其各区域的基因序列很少发生突变，因此是理想的反义药物的靶点， 目前尚选择性无作用于O7tl因子抗菌剂。采用反义策略，设计针对Oto因子基因的反义药 物，将是反义抗菌剂研究领域新的突破口。

发明内容
本发明需要解决的技术问题之一是提供一组新型透膜肽介导的抗细菌RNA聚合 酶σ 70因子基因rpoD的反义肽核酸序列。本发明需要解决的技术问题之二是提供一组新型透膜肽介导的抗细菌RNA聚合 酶σ 因子基因rpoD的反义肽核酸序列的制备方法。本发明需要解决的技术问题之三是公开所述透膜肽介导的抗细菌RNA聚合酶ο 7Q 因子基因rpoD的反义肽核酸序列的应用。本发明的构思是这样的针对目前感染中最常见，耐药性发生率高，临床危害性大 的革兰氏阴性菌(包括敏感及多药耐药的临床致病性大肠埃希氏菌、沙门氏杆菌、肺炎克 雷柏杆菌和铜绿假单胞菌)或革兰氏阳性菌(包括敏感及多药耐药的金黄色葡萄球菌)为 攻击目标，依据致病细菌基因组学信息，应用反义策略，以编码细菌RNA聚合酶σ 因子的 基因rpoD的mRNA为靶点分别设计革兰氏阴/阳性菌可共享的具有广谱抗菌效力的肽核酸 反义序列，将其与能够促进细菌胞膜通透性的透膜肽通过肽键直接连接或通过作为空间间 隔的甘氨酸以肽键相连，得到具有高效转运和特异阻断细菌致病基因表达的广谱反义抗菌 剂——透膜肽介导的抗细菌RNA聚合酶σ因子基因rpoD的反义肽核酸。本发明提供的肽核酸-透膜肽反义抗菌序列是在对mRNA 二级结构的预测和分析 基础上选取最优能量结合区域设计并合成的，可特异性与编码细菌RNA聚合酶ο 7(|因子的 基因rpoD的mRNA的不同区域结合，阻断基因表达，此系列序列被命名为anti-G+/-rpoD PNA-CPP，序列如下表所示。所述的透膜肽介导的抗细菌RNA聚合酶σ因子基因rpoD的反 义肽核酸序列为10或12个肽核酸单体与10个氨基酸通过肽键直接连接或通过作为空间 间隔的甘氨酸以肽键相连得到，羧基末端全部酰胺化修饰。上述所有肽核酸_透膜肽的羧 基末端均进行酰胺化。 中英文数字缩写表示G_革兰氏阴性细菌，G+革兰氏阳性细菌，PNA-CPP肽核 酸_透膜肽，Gly甘氨酸，K赖氨酸，F苯丙氨酸，R精氨酸，X6-氨基己酸，B β -丙氨酸，A腺 嘌呤肽核酸单体，T胸腺嘧啶肽核酸单体，C胞嘧啶肽核酸单体，G鸟嘌呤肽核酸单体，5’肽 核酸_透膜肽序列羧基末端，3’肽核酸-透膜肽序列氨基末端。本发明提供的一组透膜肽介导的抗细菌RNA聚合酶07(|因子基因rpoD的反义 肽核酸序列，其制备方法是固相化学合成，用RP-HPLC色谱仪对其粗品进行分离纯化，再用 MALDI-T0F质谱仪测定纯品的分子量。设计及优化改造的主要思路是1.针对编码革兰氏阴性菌(包括敏感及多药耐药的临床致病性大肠杆菌、沙门氏 杆菌、肺炎克雷柏杆菌和铜绿假单胞菌)RNA聚合酶ο 7(|因子的基因rpoD的不同位点为起 始点设计反义其对应mRNA序列的共享肽核酸_透膜肽抗菌序列(按照列出顺序1-5分别 以1、2、3、11、58位基因为起始点)，序列均由相同长度肽核酸反义序列(12个肽核酸单体) 和透膜肽序列(KFF) 31(通过肽键直接连接而组成；对anti-G-rpoD PNA-CPP 1进行负向移 位和截短2种优化设计，所得序列均由不同长度肽核酸反义序列(10-12个肽核酸单体)和 不同透膜肽序列((KFF)3K或(RXR)4XB)通过作为空间间隔的甘氨酸以肽键相连或直接以 肽键相连，但整体保持或对换肽核酸序列和透膜肽序列在肽链上的位置，且前者肽核酸反 义序列均包含基因rpoD的1位起始编码子AUG的对应反义序列TAC，分别以基因rpoD的 1、-1、-3位为起始位点，正向延伸11个碱基长度，后者肽核酸反义序列以基因rpoD的1位为起始位点，正向延伸9个碱基长度。2.针对编码革兰氏阳性菌(包括敏感及多药耐药的金黄色葡萄球菌)RNA聚合酶 σ 70因子的基因rpoD的不同位点为起始点设计反义其对应mRNA序列的共享肽核酸_透膜 肽抗菌序列(按照列出顺序1-5分别以36、123、159、233、312位基因为起始点)，序列均由 相同长度肽核酸反义序列(12个肽核酸单体)和透膜肽序列通过肽键直接连接而组成。对 anti-G+rpoD PNA-CPP 4进行负向移位的优化设计，所得序列由肽核酸反义序列(12个肽核 酸单体)和透膜肽序列通过作为空间间隔的甘氨酸以肽键相连，但整体对换肽核酸序列和 透膜肽序列在肽链上的位置，且该序列以基因rpoD的231位为起始位点，正向延伸11个碱 基长度。经过设计和优化改造后筛选到17条序列具有良好的透膜递送效率和不同的抗菌 活性，且无毒性，非常有希望用于治疗细菌感染的新药开发。通过药效学实验证明，本发明所述的互补于基因rpoD序列的反义肽核酸均具有 抑制敏感和耐药细菌生长的特性，在抗耐药菌治疗方面显示出广阔的应用前景。


现结合附图和实施例对本发明的内容作进一步说明。图1是肽核酸-透膜肽anti-G-rpoD PNA-CPP 10纯品的RP-HPLC色谱图；图2是肽核酸-透膜肽nti-G-rpoD PNA-CPP 10纯化的MALDI-T0F质谱图；图3是不同剂量肽核酸-透膜肽anti-G-rpoD PNA-CPP 10和anti_G+rpoD PNA-CPP 4分别与E. coli MG1655和MRSAATCC29213作用的浓度效应关系测定结果；图4是不同剂量肽核酸-透膜肽anti-G-rpoD PNA-CPP 10和anti-G+rpoD PNA-CPP 4 分别与E. coli MG1655和MRSAATCC29213作用后平板克隆形成实验结果的统计图；图 5 是 anti-GYpoD PNA-CPP 1 和 anti-G+rpoD PNA-CPP 4 分别对Ε· coli MG1655 和MRSAATCC29213rpoD mRNA表达的影响图示。
具体实施例方式细菌耐药性的产生使得临床上计多曾经有效的抗生素失效，因此本发明的研究目 的是寻找新的反义抗菌药物靶点。为此，本发明根据细菌的分子生物学信息，以细菌生存必 需的RNA聚合酶σ γο因子的编码基因rpoD为靶基因，利用连接透膜肽形成共轭物的方法将 反义肽核酸药物导入敏感或耐药菌体内，用功能学实验来评估以rpoD为靶基因的反义肽 核酸药物能否抑制或阻断rpoD的表达，从而抑制或杀死细菌，进而证实RNA聚合酶ο 7(|因 子可以作为反义抗菌药物的新靶点。实施例1透膜肽介导的抗细菌RNA聚合酶σ 因子基因rpoD的反义肽核酸的设 计在GENBANK 中检索到的大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655)的RNA聚合酶σ 7(1因子的编码基因rpoD的序列(基因编号gi =49175990)，该序列 全长1842bp，该序列的Ibp至613bp之间是RpoD的有效序列，其中Ibp至65bp编码RpoD 的1. 1区域，95bp至126bp编码RpoD的1. 2区域，137bp至348bp编码RpoD的非必需区域，379bp至449bp编码RpoD的2. O区域，453bp至535bp编码RpoD的3. O区域，541bp至 599bp编码RpoD的4. O区域。在 GENBANK 中检索到的肠炎沙门氏杆菌(Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi A str.)的RNA聚合酶σ 7(1因子的编码基因rpoD的序列(基因编号 gi :56412276)，该序列全长1983bp，该序列的46bp至660bp之间是RpoD的有效序列，其中 46bp 至 IlObp 编码 RpoD 的 1. 1 区域，142bp 至 173bp 编码 RpoD 的 1. 2 区域，184bp 至 395bp 编码RpoD的非必需区域，426bp至496bp编码RpoD的2. O区域，505bp至582bp编码RpoD 的2. O区域，588bp至646bp编码RpoD的4. O区域。在GENBANK 中检索到的肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78578)的RNA聚合酶σ 7(1因子的编码基因rpoD的序列(基因编号gi 152968582)，该序列全长1842bp，该序列的Ibp至613bp之间是RpoD的有效序列，其中Ibp 至65bp编码RpoD的1. 1区域，95bp至126bp编码RpoD的1. 2区域，137bp至348bp编码 RpoD的非必需区域，379bp至449bp编码RpoD的2. O区域，453bp至535bp编码RpoD的3. O 区域，541bp至599bp编码RpoD的4. O区域。在GENBANK 中检索到铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa PAO1)的 RNA 聚合 酶σ 因子的编码基因rpoD的序列(基因编号gi =882038)，该序列全长1854bp，该序列 的Ibp至617bp之间是RpoD的有效序列，其中6bp至61bp编码RpoD的1. 1区域，97bp至 128bp编码RpoD的1. 2区域，139bp至352bp编码RpoD的非必需区域，383bp至453bp编码 RpoD 的 2. O 区域，462bp 至 539bp 编码 RpoD 的 3. O 区域，545bp 至 623bp 编码 RpoD 的 4. O 区域。在 GENBANK 中检索至Ij金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus subsp. aureus Mu 50)的RNA聚合酶σ m因子的编码基因rpoD的序列(基因编号gi :57634611)，该序列全 长1107bp，该序列的9bp至368bp之间是RpoD的有效序列，其中14bp至94bp编码RpoD的 1. 1区域，96bp至132bp编码RpoD的1. 2区域，135bp至205bp编码RpoD的的2. O区域， 214bp至291bp编码RpoD的3. O区域，297bp至355bp编码RpoD的4. O区域。根据碱基互补原则，从DNA序列得到rpoD的mRNA，应用RNAstructure 4. 5计算机 软件进行辅助设计，筛选出一系列反义核酸作用靶位点，根据这些靶位点设计出相应的反 义肽核酸，再根据自由能最低原理、反义寡聚核苷酸与靶序列结合的净能量、反义寡聚核苷 酸与直链靶序列结合所需要的能量、反义寡聚核苷酸_靶序列结合后碱基从靶序列断裂需 要的能量、反义寡聚核苷酸分子内结合所需要的能量、反义寡聚核苷酸分子间结合所需要 的能量、核酸_靶序列解链的温度等参数，各挑选出5条件较优的反义核酸序列，同时设计 了随机对照的错配和无关反义核酸序列(mismatch/unrelated anti-G+/-rpoD-PNA_CPP)。 经BLAST软件验证实验所用的反义核酸序列均具有高度特异性，并为增加其溶解性、稳定 性、以及与靶基因序列的亲和力采用第三代反义核酸修饰结构肽核酸，并在末端连接透膜 肽以达到高效透细菌外膜、递送反义肽核酸的目的，anti-G-rpoD PNA-CPP 1-10是以编码革兰氏阴性菌(包括敏感及多药耐药的 临床致病性大肠杆菌、沙门氏杆菌、肺炎克雷柏杆菌和铜绿假单胞菌)RNA聚合酶O7tl因 子的基因rpoD的mRNA为靶点设计的共享肽核酸-透膜肽反义抗菌序列。anti-G—rpoD PNA-CPP 1-5是针对rpoD的不同位点为起始点设计的反义其对应mRNA序列的共享肽核酸-透膜肽抗菌序列(按照列出顺序1-5分别以1、2、3、11、58位基因为起始点正向延伸)， 且均由相同长度肽核酸反义序列(12个肽核酸单体)和透膜肽序列通过肽键直接连接而 组成。anti-GYpoD PNA-CPP 6-10是对anti-GYpoD PNA-CPP 1的优化设计，均由不同长 度肽核酸反义序列(10-12个肽核酸单体)和透膜肽序列通过作为空间间隔的甘氨酸以肽 键相连，且肽核酸反义序列均包含基因rpoD的1位起始编码子AUG的对应反义序列TAC ； anti-G_rpoD PNA-CPP 6 与 anti_G_rpoD PNA-CPP 1 在肽核酸反义序列上相同，anti_G_rpoD PNA-CPP 7-10整体对换肽核酸序列和透膜肽序列在链上的位置，anti—G-rpoD PNA-CPP 7 与antrG-rpoD PNA-CPP 1在肽核酸反义序列上相同，anti_G>poD PNA-CPP8的肽核酸反 义序列是对anti-G_rpoD PNA-CPP 1的的肽核酸反义序列负向移位设计，分别以基因rpoD 的-1、-3位为起始位点，正向延伸11个碱基长度，anti-G>poD PNA-CPP10的肽核酸反义 序列是对anti-G_rp0D PNA-CPP 1的肽核酸反义序列的截短设计，以基因rpoD的1位为起 始位点，正向延伸9个碱基长度。anti-GYpoD PNA-CPP 10 的错配序列5' -GTTTCTCTTCAG-Gly-KFFKFFKFFK-3 ‘anti-GYpoD PNA-CPP 10 的无关序列5' -GTCGGATCAATT-Gly-KFFKFFKFFK-3 ‘anti-G+rpoD PNA-CPP 4 的错配序列5' -GGTTTTGCTCCA-KFFKFFKFFK-3 ‘anti-G+rpoD PNA-CPP 4 的无关序列5' -GGTCAGATAGCC-KFFKFFKFFK-3 ‘下面通过具体实施例，以肽核酸-透膜肽anti-G—rpoD PNA-CPP 10和 anti-G+rpoDPNA-CPP 4为例，进一步详述本发明。实施例2肽核酸_透膜肽的制备及分离纯化在本实施例中，按上述序列制备所有肽核酸-透膜肽，同时制备错配和无关肽核 酸_透膜肽序列作为对照。本实施例以HATU/DIEA为缩合剂，在MBHA-Rink树脂上，采用 Fmoc保护α -氨基酸，从C-端(羧基端)向N-端(氨基端)手动/自动固相合成C-末端 酰胺化的肽核酸_透膜肽链。合成的肽核酸_透膜肽经过高浓度TFA剪切后，用RP-HPLC 色谱仪对其粗品进行分离纯化，再用MALDI-T0F质谱仪测定纯品的分子量。具体试验步骤如下。第一步，肽核酸-透膜肽的固相合成(以anti-G-rpoD PNA-CPP 10样品为例)。 制备的肽核酸-透膜肽从C端到N端逐个进行。首先称量0.025g MBHA-Rink树脂装柱， 加2. Oml 二氯甲烷(CHCl2)，使其溶胀，20%哌啶/ 二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱保护，DMF清 洗。以1 1 2的摩尔比将9-笏甲氧羰基(Fmoc)保护的第一个氨基酸或肽核酸单体、 2_ (7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N' ,N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和N，N-二异丙基乙 胺(DIEA)溶解于适量二甲基甲酰胺(DMF)，活化后与脱保护后的树脂在柱上循环偶合反应 2 6h，DMF洗涤。以后连接的氨基酸重复以上活化、缩合、脱保护和洗涤的过程，直到制备 结束。第二步，肽核酸-透膜肽的剪切(以anti-G-rpoD PNA-CPP 1样品为例)。取下反 应后的树脂，加入切割液(95 %三氟乙酸，5 %间甲酚)，室温反应1. 5-2小时，过滤，滤出液 中加入10倍体积的预冷无水乙醚，3500转/分钟离心5分钟，收集沉淀并室温干燥。第三步，肽核酸-透膜肽的RP-HPLC纯化(以anti-G-rpoD PNA-CPP 1样品为例)。 称量一定量干燥后的多肽，溶于0. 三氟乙酸，样品处理后经反向柱梯度分离(洗脱液为 含0. 三氟乙酸的20% -80%的乙腈)，收集260nm处洗脱峰。
第四步，抗菌肽的RP-HPLC分析(以1号样品为例)。称量一定量干燥后的多 肽，溶于0. 三氟乙酸，样品处理后经反向色谱柱梯度分析(洗脱液为含0. 三氟乙 酸的20% -80%的乙腈)，计算多肽纯品的纯度。结果如图2所示，纯化后的anti-G_rpoD PNA-CPP 10经过RP-HPLC分析，在色谱图中显示其纯度为达到90%以上。第五步，肽核酸-透膜肽纯品的MALDI-T0F质谱鉴定(以1号样品为例)。取 0. 5 μ 1多肽样品溶液的氧化铁分散液点于MALDI靶板上，再点上0. 5 μ L的有机基质溶液， 待靶板上的点样液干燥、结晶后，将靶板放进质谱仪，进行质谱测定。结果如图1所示，制备 的USl经过MALDI-T0F分析，在质谱图中显示的分子量测定值(4122. 7KD)与anti-GYpoD PNA-CPP 10序列计算出的理论值(4121. 4KD) 一致，说明制备的肽核酸-透膜肽即为设计的 肽核酸_透膜肽。实施例3肽核酸-透膜肽的MIC测定第一步，取无菌96孔板1个，取非边缘的10行X6列=60孔，每行分别标记为 “抗生素对照、肽核酸-透膜肽1、2、3、4、5”。每孔分别加入50μ1 M-H营养肉汤。第二步，在每行第一列孔中对应标记分别加入50 μ 1浓度为2048ug/ml的抗生素 和浓度为100 μ M的肽核酸-透膜肽1、2、3、4、5。第三步，充分混勻每行第一孔后吸出50 μ 1加入第二孔，充分混勻后吸出50 μ 1加 入第三孔，依此类推，2倍倍比稀释至第十孔，弃去最后吸出的50 μ 1含药M-H营养肉汤。第四步，挑受试菌株生长于M-H琼脂平板上的单克隆于2ml LB肉汤中摇菌至对 数生长期，吸取适量菌液用M-H营养肉汤按2倍倍比稀释至OD62tl约为0. 1 (0. 5麦氏比浊标 准)，此稀释倍数下细菌浓度约为5X 107 8个/ml，再稀释500倍后按50 μ 1/孔加入96孔 板中。第五步，微孔震荡器上充分振荡Imin后置于37°C培养12 16h后肉眼观察各 孔菌液清亮程度，肉眼可见清亮的最低药物浓度对应孔浓度即为此药物的MIC。结果见表 1-3。表lanti-G+rpoD PNA-CPP对金黄色葡萄球菌的MIC测定结果；Table 1 MICof anti-rpoD PNA-peptides for quality control and dinical strains of MRSA in M-H broth culture
MlCfbr MRSVstrains(MU)
PNA desi^iation and sequence%gorV9te at σ faclor
AT0C29213 Mu 50 WHO-2 XIJNG
Anti-rpoD PNA-pept ides (without spacer between PNA and peptide)ff^gtcggatcaatt-WmfWmyσ70_Γ .136-47S'-a^ttttcagca-KFWWFKa'σ70_Γ .2123-133S'-tcatocatttga-WTWWFK^'σ70_Γ2159-160S'H^cccaatttct-WTWWR^'σ70一4312-3135'-^ttctoc|tcal·KFWWTK■3,a70_r3233-244
Mismatch 233 5’ ^ggttttgctaa-WTM=FM=BM' Mismatch 233 5'-KFFWTMFFK-ay-tttgctccrt-3' Freepeptide
>25>25>25 >2525>2525 >25>25>25>25 >25>25>25>25 >2512.52512.5 >25>25>25>25 >25>25>25>25 >25>30>30>30 >30forpeptidesequences Srudures shown in uppercase letters a lowercase letters are for PNA sequenoe. The PNAs are written from their N totheir Oterminus,and the N terminus corresponds to the 5V end of a conventional oligonucleotide·表2anti_G>poD PNA-CPP对大肠杆菌的MIC测定结果； 表3anti-G_rp0D PNA-CPP对沙门氏菌、肺炎克雷伯杆菌和铜绿假单胞菌的MIC测 定结果； 实施例4肽核酸-透膜肽的浓度效应关系测定第一步，取无菌96孔板1个，取非边缘的10行Χ6列=60孔，每行分别标记为“受试菌生长对照、肽核酸-透膜肽高、中、低剂量组”。第二步，每组取5个复孔，受试菌生长对照组每孔分别加入50 μ 1 M-H营养肉汤， 肽核酸_透膜肽高、中、低剂量组分别加入50 μ 1 2倍于对应剂量浓度的含药M-H营养肉 汤。第三步，挑受试菌株生长于M-H琼脂平板上的单克隆于2ml LB肉汤中摇菌至对 数生长期，吸取适量菌液用M-H营养肉汤按2倍倍比稀释至OD62tl约为0. 1 (0. 5麦氏比浊标 准)，此稀释倍数下细菌浓度约为5X 107 8个/ml，再稀释500倍后按50 μ 1/孔加入96孔 板中。第四步，微孔震荡器上充分振荡Imin后置于37°C培养，每Ih于酶标仪测定OD62tlI 次至16h，取5孔OD值平均值和对应时间绘制浓度效应关系曲线。结果如图3所示，与各自对应的正常对照组相比，anti-G-rpoD PNA-CPlO组和 anti-G-rpoDPNA-CP10 组均可剂量依赖性的抑制 E. coli MG1655 和 MRSA ATCC29213 的生 长，且三个剂量组(40、20 和 10 μ Μ)的 anti-G-rpoD PNA-CP10 和 anti-G-rpoD PNA-CP10 在作用3-6h即可明显抑制E. coli MG1655和MRSA ATCC29213的生长。实施例5不同剂量肽核酸_透膜肽作用后平板克隆形成实验第一步，取无菌96孔板1个，取非边缘的10行X6列=60孔，每行分别标记为 “受试菌生长对照、肽核酸-透膜肽高、中、低剂量组”。第二步，每组取5个复孔，受试菌生长对照组每孔分别加入50 μ 1 M-H营养肉汤， 肽核酸-透膜肽高、中、低剂量组分别加入50 μ 1 2倍于对应剂量浓度的含药M-H营养肉 汤。第三步，挑受试菌株生长于M-H琼脂平板上的单克隆于2ml LB肉汤中摇菌至对 数生长期，吸取适量菌液用M-H营养肉汤按2倍倍比稀释至OD62tl约为0. 1 (0. 5麦氏比浊标 准)，此稀释倍数下细菌浓度约为5X 107 8个/ml，再稀释500倍后按50 μ 1/孔加入96孔 板中。第四步，微孔震荡器上充分振荡Imin后置于37°C培养培养12 16h后，充分混 勻每孔菌液后吸取10μ 1至适量无菌去离子水中，均勻涡旋15s，同上法100倍比连续稀释 IO2 IO6倍后，分别取0. Iml菌液接种于M-H琼脂平板上(各接种三份)，35°C孵育过夜 后，取菌落数在30-300之间的平板计数，并取其平均数。第六步，CFU =三块板的菌落平均数X稀释倍数，即为原液中每毫升菌液中的活 菌数。肉眼计数菌落数，并求其平均值，从而在对数坐标纸绘制不同剂量药物组CFU统计数 据图。结果如图4所示，与各自对应的正常对照组相比，anti-G—rpoD PNA-CP10组和 anti-G-rpoDPNA-CP10组均可剂量依赖性的降低CFU，且三个剂量组(40、20和10 μ M)的 anti-G>poDPNA-CP 10 和 anti-GYpoD PNA-CP 10 可降低 CFU2-6 个数量级。实施例6PCR引物的设计与合成依据 GeneBank 中报道的 Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655、 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi A str. ATCC9150、Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniaeMGH 78578>Pseudomonas aeruginosa PAOl 以及MRSA Mu50 的rpoD及16S rRNA的基因序列，用软件PrimerPremier5. 0设计了 rpoD及16S rRNA的10
12对特异性扩增引物。引物均经BLAST软件验证具有高度特异性，并由Invitrogen生物工程
技术服务有限公司合成，序列见下表。
实施例7RT-PCR法检测反义靶基因rpoD的mRNA表达变化1、提取细菌总RNA:(1)冰浴5min后的菌液5000rpm离心lOmin，弃去上清，收集细菌沉淀；(2)细菌沉淀中加入100 μ 1裂解液，37°C孵育30min，每隔IOmin振荡1次，以充
分裂解细菌；(3)加入 Iml Trizol reagent,室温放置 5min 后加氯仿 0. 2ml/ml Trizol reagent,盖紧离心管，用手轻柔混勻离心管；(4)吸取水相上清转移至一新的离心管中，加入异丙醇0. 5ml/ml Trizol reagent，盖紧离心管，用手轻柔混勻，室温放置20min，13000rpm、4°C离心20min ；(5)弃去上清，加入75%乙醇lml/ml Trizol reagent，用手剧烈摇荡使RNA充分 溶解，8000rpm、4°C离心 IOmin ；(6)弃去上清，然后置于清洁环境挥干乙醇lOmin，但不要干燥过分，以免降低RNA 的溶解度。将RNA溶于DEPC处理过的水中作为RT模板(必要时可在55 60°C孵育助 溶)，或于-20°C冻存。2、RT 用DU800核酸蛋白分析仪测总RNA的浓度及纯度。反应体系20 μ 1 :5 X RT bufferlOy 1(含 Mg2+)，2. 5mmol/l. 28ml dNTP 5 μ 1，随机引物 1 μ 1，模板 RNA 1 μ g, RNaseinhibitor 1 μ 1，IOU/μ d反转录酶AMV 1 μ 1，用DEPC处理过的水补足20 μ 1。反应 条件30°C 15min，85°C 30sec，25°C lmin，冰浴后进行 PCR 或 _20°C保存 cDNA。3、PCR 反应体系 25μ 1 :Takara Premix Taq 12. 5 μ 1,0· 1 μ mol/L 弓 |物各 1 μ 1, 模板cDNA 1 μ 1，用DEPC处理过的水补足25 μ 1。反应条件95°C变性30sec，55°C退火 30seC，72°C延伸45sec，循环数取32，最后一个循环的延伸条件为72°C 7min。4、PCR产物分析取5 μ 1 PCR反应产物加入含0. 5 μ g/ml溴化乙啶的1. 0%的琼 脂糖凝胶的点样孔中，5V/cm进行电泳。电泳结束后用凝胶成像仪进行观察照相并进行光 密度扫描，测条带密度值(Integral density value，IDV)。因为16SrRNA在细菌中稳定表达，所以本发明以16srRNA作为内参照。结果如图5所示，E. coli MG1655和MRSA ATCC29213 的rpoD和 16S rRNA 的RT-PCR 的扩增产物的电泳结果显示，各组分别在219bp、398bp、242bp、437bp处出现特异性扩增条 带。与各自对应的正常对照组相比，anti-G-rpoD PNA-CP10组和anti-G-rpoD PNA-CPlC^i 均可剂量依赖性的降低rpoD mRNA的表达。本发明的研究结果提示，以RNA聚合酶σ 因子的编码基因rpoD为靶点设计的反 义肽核酸可以有效的抑制靶基因的转录、表达，抑制或杀死细菌。上述的反义肽核酸具有开 发为抗耐药菌的反义核酸药物的前景。
权利要求
一组透膜肽介导的抗细菌RNA聚合酶σ70因子基因rpoD的反义肽核酸序列(anti G rpoD PNA CPP 1 11及anti G+rpoD PNA CPP 1 6)，其特征在于，其序列为anti G rpoD PNA CPP 15′ GTTTTGCTCCAT KFFKFFKFFK 3′anti G rpoD PNA CPP 25′ GGTTTTGCTCCA KFFKFFKFFK 3′anti G rpoD PNA CPP 35′ GGGTTTTGCTCC KFFKFFKFFK 3′anti G rpoD PNA CPP 45′ GTGACTGCGGGT KFFKFFKFFK 3′anti G rpoD PNA CPP 55′ GGTCAGATAGCC KFFKFFKFFK 3′anti G rpoD PNA CPP 65′ GTTTTGCTCCAT Gly KFFKFFKFFK 3′anti G rpoD PNA CPP 75′ KFFKFFKFFK Gly GTTTTGCTCCAT 3′anti G rpoD PNA CPP 85′ KFFKFFKFFK Gly TTTTGCTCCATT 3′anti G rpoD PNA CPP 95′ KFFKFFKFFK Gly TTGCTCCATTCA 3′anti G rpoD PNA CPP 10 5′ KFFKFFKFFK Gly TTTGCTCCAT 3′anti G rpoD PNA CPP 11 5′ (RXR)4XB TTTGCTCCAT 3′anti G+rpoD PNA CPP 15′ GTCGGATCAATT KFFKFFKFFK 3′anti G+rpoD PNA CPP 25′ AGTTTTTCAGCA KFFKFFKFFK 3′anti G+rpoD PNA CPP 35′ TCATCCATTTGA KFFKFFKFFK 3′anti G+rpoD PNA CPP 45′ GTTTCTCGTCAG KFFKFFKFFK 3′anti G+rpoD PNA CPP 55′ CGCCCAATTTCT KFFKFFKFFK 3′anti G+rpoD PNA CPP 65′ KFFKFFKFFK Gly TTCTCGTCAGTA 3′中英文数字缩写表示G 革兰氏阴性细菌，G+革兰氏阳性细菌，PNA CPP肽核酸 透膜肽，Gly甘氨酸，K赖氨酸，F苯丙氨酸，R精氨酸，X6 氨基己酸，Bβ 丙氨酸，A腺嘌呤肽核酸单体，T胸腺嘧啶肽核酸单体，C胞嘧啶肽核酸单体，G鸟嘌呤肽核酸单体，5’肽核酸 透膜肽序列羧基末端，3’肽核酸 透膜肽序列氨基末端。
2.根据权利要求1所述的肽核酸-透膜肽序列，其特征在于以编码细菌RNA聚合酶 σ因子的基因rpoD的mRNA为靶点设计的共享肽核酸_透膜肽反义抗菌序列，由不同长度 肽核酸反义序列(10-12个肽核酸单体)和共用透膜肽序列通过肽键直接连接或通过作为 空间间隔的甘氨酸以肽键相连，所涉及的肽核酸_多肽以固相化学合成方法产生，且3’末 端均进行酰胺化。
3.根据权利要求2所述的肽核酸-透膜肽序列，其特征在于anti-G_rp0DPNA-CPP 1-11是以编码革兰氏阴性菌(包括敏感及多药耐药的临床致病性大肠杆菌、沙门氏杆菌、 肺炎克雷柏杆菌和铜绿假单胞菌)RNA聚合酶ο 7(|因子的基因rpoD的mRNA为靶点设计的 共享肽核酸-透膜肽反义抗菌序列，anti-G+rpoD PNA-CPP 1_6是以编码革兰氏阳性菌(包 括敏感及多药耐药的金黄色葡萄球菌)RNA聚合酶σ 因子的基因rpoD的mRNA为靶点设 计的共享肽核酸_透膜肽反义抗菌序列。
4.根据权利要求3所述的肽核酸-透膜肽序列，其特征在于anti-G_rp0DPNA-CPP 1-5是针对编码革兰氏阴性菌(包括敏感及多药耐药的临床致病性大肠杆菌、沙门氏杆菌、 肺炎克雷柏杆菌和铜绿假单胞菌)RNA聚合酶Q7tl因子的基因rpoD的不同位点为起始点设 计的反义其对应mRNA序列的共享肽核酸_透膜肽抗菌序列(肽核酸_透膜肽按照列出顺 序1-5分别rpoD的1、2、3、11、58位基因序列为起始点正向延伸)，且均由相同长度肽核酸反义序列(12个肽核酸单体)和透膜肽序列(KFF)3K通过肽键直接连接而组成。
5.根据权利要求4所述的肽核酸-透膜肽序列，其特征在于anti-G_rp0DPNA-CPP 6-11是对anti-G_rp0D PNA-CPP 1的优化设计，均由不同长度肽核酸反义序列(10-12个肽 核酸单体)和透膜肽序列通过肽键相连，且肽核酸反义序列均包含基因rpoD的1位起始编 码子AUG的对应反义序列TAC ；anti-G>poD PNA-CPP 6-10的肽核酸反义序列与透膜肽序 列(KFF)3K通过G作为空间间隔的甘氨酸以肽键相连，anti-G_rp0D PNA-CPP 11的肽核酸反 义序列与透膜肽序列(RXR)4XB通过肽键直接相连；anti-G—rpoD PNA-CPP 6与anti-G—rpoD PNA-CPP 11在肽核酸反义序列上相同，antiOpoD PNA-CPP 7_11整体对换肽核酸序列和 透膜肽序列在链上的位置，antiOpoD PNA-CPP 7与anti-GYpoD PNA-CPP 1在肽核酸反 义序列上相同，anti-G_rpoDPNA-CPP8的肽核酸反义序列是对anti-G_rpoD PNA-CPP 1的的 肽核酸反义序列负向移位设计，分别以基因rpoD的-1、-3位为起始位点，正向延伸11个碱 基长度，anti-GYpoD PNA-CPP 10和11的肽核酸反义序列是对antiOpoD PNA-CPP 1的 肽核酸反义序列的截短设计，以基因rpoD的1位为起始位点，正向延伸9个碱基长度。
6.根据权利要求3所述的肽核酸-透膜肽序列，其特征在于anti-G+rpoDPNA-CPP 1-5是针对编码阳性菌(包括敏感及多药耐药的金黄色葡萄球菌)RNA聚合酶O7tl因子的 基因rpoD的不同位点为起始点设计的反义其对应mRNA序列的共享肽核酸-透膜肽抗菌序 列(按照列出顺序1-5分别以36、123、159、233、312位基因为起始点正向延伸)，且均由相 同长度肽核酸反义序列(12个肽核酸单体)和透膜肽序列(KFF) 31(通过肽键直接连接而组 成。
7.根据权利要求6所述的肽核酸-透膜肽序列，其特征在于anti-G+rpoDPNA-CPP 6 是对anti-G+rpoD PNA-CPP 4的负向移位优化设计，由肽核酸反义序列(12个肽核酸单体) 和透膜肽序列通过作为空间间隔的甘氨酸以肽键相连，但整体对换肽核酸序列和透膜肽序 列在肽链上的位置，且肽核酸反义序列以基因rpoD的231位为起始位点，正向延伸11个碱基长度。
8.根据权利要求2、4、5所述的肽核酸-透膜肽序列，应包括所有含编码革兰氏阴性菌 (包括敏感及多药耐药的临床致病性大肠杆菌、沙门氏杆菌、肺炎克雷柏杆菌和铜绿假单胞 菌)RNA聚合酶σ 70因子的基因rpoD的1位起始编码子AUG对应反义序列TAC的不同长度 的共享肽核酸_透膜肽抗菌序列(包括截短和移位方式而得到的肽核酸序列以及其它氨基 酸序列的透膜肽与此肽核酸序列连接的肽核酸_透膜肽序列)，且肽核酸序列和透膜肽序 列可通过肽键直接连接或通过作为空间间隔的甘氨酸以肽键相连。
9.根据权利要求2、6、7所述的肽核酸-透膜肽序列，应包括所有含编码革兰氏阳性菌 (包括敏感及多药耐药的金黄色葡萄球菌)RNA聚合酶ο 70因子的基因rpoD的231-245位 序列的不同长度的共享肽核酸-透膜肽抗菌序列(包括截短和移位方式而得到的肽核酸序 列以及其它氨基酸序列的透膜肽与此肽核酸序列连接的肽核酸_透膜肽抗菌序列)，且肽 核酸序列和透膜肽序列可通过肽键直接连接或通过作为空间间隔的甘氨酸以肽键相连。
10.根据权利要求书1所述的肽核酸-透膜肽序列，其特征在于所述的透膜肽介导的 抗细菌RNA聚合酶O 因子基因rpoD的反义肽核酸序列用于制备抗敏感及多重耐药菌药 物的用途。
全文摘要
本发明提供了一组以细菌基因rpoD为靶点的肽核酸-透膜肽反义抗菌序列。透膜肽介导的以编码细菌RNA聚合酶σ70因子的基因rpoD为特异性靶点的反义核酸能够选择性抑制革兰氏阴性菌(包括敏感及多药耐药的临床致病性大肠埃希氏菌、沙门氏杆菌、肺炎克雷柏杆菌和铜绿假单胞菌)或革兰氏阳性菌(包括敏感及多药耐药的金黄色葡萄球菌)菌体内rpoD基因的表达，继而抑制细菌生长繁殖，具有抗菌效果好、毒性低、稳定性好及不易耐药的优点。本发明还公开了该组肽核酸-透膜肽的固相化学制备的方法，本发明合成的抗菌肽可用于制备抗多重耐药菌感染的反义药物，具有开发为高效转运和特异阻断细菌致病基因表达的广谱反义抗菌剂的潜力。
文档编号A61P31/04GK101891804SQ20101020602
公开日2010年11月24日 申请日期2010年6月21日 优先权日2010年6月21日
发明者侯征, 周颖, 孟静茹, 桑国军, 白卉, 罗晓星, 薛小燕 申请人:中国人民解放军第四军医大学