专利名称：用于抑制胶质瘤增殖并促其凋亡的小分子干扰rna及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种小分子干扰RNA(即shRNA)，尤其涉及一种用于抑制胶质瘤增殖并促其凋亡的小分子干扰RNA;另外，本发明还涉及该小分子干扰 RNA的制备方法和应用。
背景技术：
STAT3蛋白作为信号转导和转录激活因子家族(STATs)的一个重要成员，对细胞的存活，侵袭和凋亡及血管生成起到了重要的调控作用，并与多种恶性肿瘤密切相关。胶质瘤是发生于神经外胚层的肿瘤，故亦称神经外胚层肿瘤或神经上皮肿瘤。肿瘤起源于神经间质细胞，即神经胶质、室管膜、脉络丛上皮和神经实质细胞，即神经元。大多数肿瘤起源于不同类型的神经胶质，但根据组织发生学来源及生物学特征类似，对发生于神经外胚层的各种复查肿瘤病，一般都称为神经胶质瘤。胶质瘤的分类方法很多，临床工作者往往采用的是分类比较简单的Kernohan分类法。各型胶质瘤中，以星形细胞瘤最多，其次为胶质母细胞瘤，其后依次为髓母细胞瘤、室管膜瘤、少枝胶质瘤、松果体瘤、混合性胶质瘤、脉络丛乳头状瘤、未分类胶质瘤及神经元性肿瘤。各型胶质瘤的好发部位不同，如星形细胞瘤成人多见于大脑半球，儿童则多发在小脑；胶质母细胞瘤几乎均发生于大脑半球；髓母细胞瘤发生于小脑蚓部；室管膜瘤多见于第4脑室；少枝胶质瘤大多发生于在脑半球。胶质瘤以男性较多见，特别在多形性胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤，男性明显多于女性。各型胶质母细胞瘤多见于中年，室管膜瘤多见于儿童及青年，髓母细胞瘤几乎都发生在儿童。胶质瘤的部位与年龄也有一定关系，如大脑星形细胞瘤和胶质母细胞瘤多见于成人， 小脑胶质瘤(星形细胞瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤)多见于儿童。胶质瘤大多缓慢发病，自出现症状至就诊时间一般为数周至数月，少数可达数年。 恶性程度高的和后颅窝肿瘤病史较短，较良性的或位于静区的肿瘤病史较长。肿瘤若有出血或囊变，症状会突然加重，甚至有类似脑血管病的发病过程。胶质瘤的临床症状可分两方面，一是颅内压增高症状，如头痛、呕吐、视力减退、复视、精神症状等；另一是肿瘤压迫、浸润、破坏脑组织所产生的局灶症状，早期可表现为刺激症状如局限性癫痫，后期表现为神经功能缺失症状如瘫痪。胶质瘤的诊断，根据其生物学特征、年龄、性别、好发部位及临床过程进行分析，在病史及体征基础上，采用电生理、超声波、放射性核素、放射学及核磁共振等辅助检查，定位正确率几乎是100%，定性诊断正确率可在90%以上。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指由双链RNA介导的细胞内与其序列同源的mRNA发生特异性降解，从而导致基因表达沉默的现象，这是一种转录后水平的基因沉默机制。RNA干扰(RNAi)的基本原理是利用具有同源性的双链RNA(dsRNA)迅速阻断序列特异的目标基因的表达活性，是实验室中是一种有效的阻断基因表达的工具。
目前，尚未见有关用于抑制胶质瘤增殖并促其凋亡的STAT3基因的小分子干扰 RNA的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种用于抑制胶质瘤增殖并促其凋亡的小分子干扰RNA。本发明要解决的技术问题之二是提供该小分子干扰RNA的制备方法。本发明要解决的技术问题之三是提供该小分子干扰RNA的应用。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案在本发明的一方面，提供一种用于抑制胶质瘤增殖并促其凋亡的小分子干扰RNA， 其对应的序列为正义链5，-ACACCG AGT CAA GGA GAC ATG CAA TTG CTT GAA TTG CAT GTCTCC TTG ACT CT-3，，如 SEQ ID NO. 1 所示；反义链5，-AAAAAG AGT CAA GGA GAC ATG CAA TTC AAG CAA TTG CAT GTCTCC TTG ACT CG-3，，如 SEQ ID NO. 2 所示。在本发明的另一方面，提供一种制备上述用于抑制胶质瘤增殖并促其凋亡的小分子干扰RNA的方法，该方法的具体步骤为步骤一、根据SilenCircle TM RNAi Transcription Kit中载体设计的具体要求， 设计对应于STAT3基因780-798位，即GAG TCA AGG AGA CAT GCA A的shRNA的寡核苷酸序列(各为53bp)并进行合成；所述的shRNA的寡核苷酸序列为如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的碱基序列；步骤二、根据SilenCircle TM RNAi Transcription Kit基因质粒构建试剂盒中载体设计的具体要求，将设计的shRNA的寡核苷酸序列引物和SilenCircle质粒进行连接， 得到用于抑制胶质瘤增殖并促其凋亡的小分子干扰RNA。在本发明的另一方面，提供一种上述小分子干扰RNA在制备抑制胶质瘤增殖及促其凋亡的药物中的应用。本发明设计对胶质瘤增殖与凋亡有关联的基因STAT3基因的RNAi，并应用胶质瘤细胞模型研究其对抗胶质瘤增殖并促其凋亡的促进作用，为RNAi在胶质瘤的治疗应用提供了一种新方法。经实验验证，转染Mat3RNA干扰质粒组中的肿瘤生长受到抑制，细胞凋亡显著增加，该实验结果表明，本发明的小分子干扰RNA能下调胶质瘤中的Mat3基因表达，能够明显抑制胶质瘤的生长并促进诱导胶质瘤的凋亡。
图1是本发明shRNA的寡核苷酸序列引物和质粒的连接示意图。图2是本发明实施例中Mat3-RNAi对脑胶质瘤细胞增殖的影响示意图，其中， Control表示转染空载体组；Stat3 RNAi表示转染Mat3 RNA干扰质粒组。图3是本发明实施例中Mat3_RNAi对脑胶质瘤细胞凋亡的影响示意图，其中， mock表示未转染组；empty vector表示转染空载体组；Stat3 RNAi表示转染Mat3 RNA干扰质粒组。
具体实施例方式以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1一、胶质瘤细胞的培养胶质瘤细胞U251细胞系(购买自中国科学院上海生命科学院细胞资源中心)培养于37°C，5% CO2恒温培养箱。对数生长期的细胞用胰酶消化脱壁，之后加入适量培养液并反复吹打以混勻细胞；将得到的细胞悬液移入15ml离心管中，1500rpm离心^iin ；去上清； 用5ml无菌IXPBS将细胞悬起，吹打混勻；加约Iml细胞悬液于装有5ml新鲜培养基的新培养瓶中，放入37°C，5% CO2培养箱中培养，约2天左右传代1次(主要查看细胞有无铺满培养瓶)。二、人脑胶质瘤细胞的分离取人脑胶质瘤手术标本，浸入4°C的KRBB溶液(普通Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液)中，清洗二次，然后将标本剪成小块，转移至盛有5mL消化酶液的三角瓶中，于恒温摇床中37°C保温，摇床转速lOOr/min，每IOmin玻璃管反复吹打一次，放置30min。将该悬液离心500-1000rpm，5min，最后剩下为胶质瘤细胞。用细胞培养液悬起沉淀，在黑背景的显微镜下观察可发现到呈圆形的胶质瘤细胞。三、STAT3-RNAi质粒的设计和转染1. STAT3-RNAi 质粒的设计根据 SilenCircle TM RNAi Transcription Kit (购自 Allebe Biotechnology 公司)中载体设计的具体要求，设计对应于STAT3基因780-798位，即GAG TCAAGG AGA CAT GCA A的shRNA的寡核苷酸序列，各为5!3bp，送生工生物工程(上海)有限公司进行合成。STAT3-RNAi对应的序列为Sense (正义链)5，-ACA CCG AGT CAA GGA GAC ATG CAA TTG CTT GAATTG CAT GTC TCC TTG ACT CT-3，，如 SEQ ID NO. 1 所示；Anti-sense (反义链)5，_AAA AAG AGT CAA GGA GAC ATG CAA TTC AAG CAATTG CAT GTC TCC TTG ACT CG-3，，如 SEQ ID NO. 2 所示；*艮据 SilenCircle TM RNAi Transcription Kit (购自 Allebe Biotechnology 公司)中载体设计的具体要求，将设计的STAT3-RNAi的干扰片段和SilenCircle质粒 (购自Allebe Biotechnology公司)连接，参见图1，然后转染进胶质瘤细胞。图1为 SilenCircle 质粒原理的图解，它使用基于RNA的U6聚合酶III启动子和优化的终止子， 从而在靶细胞内可精确地形成小分子干扰RNA (shRNA)。shRNA的表达质粒是一个预切好的备用载体。通过质粒上携带的筛选标记，进行哺乳动物细胞的共转染，建立shRNA表达的稳定细胞系。通过两个Silencircle 质粒各自与正义的DNA插入片段及反义的DNA插入片段相连接，便可介导shRNA的产生。或者单个质粒与一个具有发夹结构的DNA插入片段相连接，也可介导shRNA的产生。无论哪种方法，首先必须合成两段互补的DNA片段。而TO启动子(U6 Promoter)则控制着shRNA的生成(参见图1)。对于需要进行干扰的目的基因，选择一段靶序列为A2GN17C的DNA片段(靶序列的正义序列)，其GC含量(在DNA4种碱基中，鸟嘌呤和胞嘧啶所占的比率称为GC含量)接近50 %。2. STAT3-RNAi 质粒的转染转染前一天，在含有5ml无抗生素的DMEM生长培养基(DMEM生长培养基是一种在MEM培养基的基础上研制的，含各种氨基酸和葡萄糖的细胞培养基)的60-mm培养皿里种上2X106个胶质瘤细胞(胶质瘤细胞由上述一、培养得到)。铺板后第二天准备转染首先用500 μ 1无血清的培养基(DMEM)溶解8. 0μ g的STAT3_RNAi表达载体， 用 500 μ 1 培养基(DMEM 或 RPMI1640)溶解阳离子脂质体 Lipofectamine 2000 (20 μ 1)， 轻轻地混勻，室温孵育5分钟。孵育后，为促使shRNA表达载体与Lipofectamine^OOO 充分结合，将它们轻轻混勻，室温孵育20分钟，以形成DNA-LipofectamineTM2000的复合物。将DNA-LipofectamineTM2000复合物加入到60mm培养皿，之后将含有 DNA-Lipofectamine 2000复合物的细胞培养皿放入37°C，5% CO2培养箱内培养6小时，换上正常细胞培养液。四、实验分组与检测指标正常对照组胶质瘤细胞，培养液为胶质瘤细胞培养液；RNAi组转染过STAT3_RNAi的胶质瘤细胞，培养液为胶质瘤细胞培养液。胶质瘤细胞增殖与凋亡的检测将ImL用于转染的各组细胞悬液置于M孔板中， 置于37°C，5% CO2的培养箱中培养，采用MTS实验检测3d后各组细胞增殖的情况，如图2 ； 转染3d后用TUNEL法检测各组细胞凋亡的情况，如图3。图2表示Mat3_RNAi对脑胶质瘤细胞增殖的影响，图2为统计学分析图。由图 2可知，转染Mat3RNA干扰质粒组的细胞增殖显著低于转染空载体组的细胞增殖率(**p < 0. 01)。图2中Control-转染空载体组；Stat3RNAi_转染Mat3RNA干扰质粒组。图3表示Mat3对脑胶质瘤细胞凋亡的影响，图3为统计学分析图。由图可知，转染乂站3 RNA干扰质粒组的细胞凋亡率高于未转染组和转染空载体组的细胞凋亡率(**p <0.01)。图3中mock-未转染组；empty vector-转染空载体组Jtat3 RNAi-转染Mat3 RNA干扰质粒组。五、实验结果转染Mat3 RNA干扰质粒组中的肿瘤生长受到抑制，细胞凋亡显著增加。该实验结果表明，通过RNAi技术下调胶质瘤中的Stat3基因表达，能够抑制胶质瘤的生长并促进诱导胶质瘤的凋亡。序列表<110>上海生博生物医药科技有限公司<120>用于抑制胶质瘤增殖并促其凋亡的小分子干扰RNA及其制备方法和应用<130>NP-10-14597<160>2<170>PatentIn version 3. 4<210>1<211>53
<212>RNA<213>人工序列<220><221>misc_RNA<222>(1). . (53)<223>shRNA<400>1acaccgagtc aaggagacat gcaattgctt gaattgcatg tctccttgac tct 53<210>2<211>53<212>RNA<213>人工序列<220><221>misc_RNA<222>(1). . (53)<223>shRNA<400>2aaaaagagtc aaggagacat gcaattcaag caattgcatg tctccttgac tcg 5权利要求
1.一种用于抑制胶质瘤增殖并促其凋亡的小分子干扰RNA，其对应的序列为 正义链5’ -ACA CCG AGT CAA GGA GAC ATG CAA TTG CTT GAA TTG CAT GTCTCC TTGACT CT-3，，如 SEQ ID NO. 1 所示；反义链5’ -AAA AAG AGT CAA GGA GAC ATG CAA TTC AAG CAA TTG CAT GTCTCC TTG ACT CG-3，，如 SEQ ID NO. 2 所示。
2.一种根据权利要求1所述的小分子干扰RNA的制备方法，其特征在于，该方法的具体步骤为步骤一、根据SilenCircle TM RNAi Transcription Kit中载体设计的具体要求，设计对应于STAT3基因780-798位，即GAG TCA AGG AGA CAT GCA A的shRNA的寡核苷酸序列并进行合成，所述的shRNA的寡核苷酸序列序列为如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的碱基序列；步骤二、依据SilenCircle TM RNAi Transcription Kit中载体设计的要求，将设计的 shRNA序列和SilenCircle质粒进行连接，得到用于抑制胶质瘤增殖并促其凋亡的一种小分子干扰RNA。
3.根据权利要求1所述的小分子干扰RNA在制备抑制胶质瘤增殖与促其凋亡的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种用于抑制胶质瘤增殖并促其凋亡的小分子干扰RNA、其制备方法及其应用。该小分子干扰RNA为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的碱基序列。本发明设计对抑制胶质瘤增殖并促其凋亡有作用的基因的小分子干扰RNA，应用胶质瘤细胞模型研究其对胶质瘤增殖的抑制作用和其对胶质瘤凋亡的促进作用，为胶质瘤的基因治疗提供了一种新方法。
文档编号A61K48/00GK102433336SQ20101029650
公开日2012年5月2日 申请日期2010年9月29日 优先权日2010年9月29日
发明者夏清梅, 潘讴东, 赵俊玲, 郑大 申请人:上海生博生物医药科技有限公司