专利名称：人参有效部位及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种中药人参有效部位及其提取分离的制备工艺和在制备治疗白血 病和肿瘤药物中的应用。
背景技术：
白血病属造血系统常见的恶性肿瘤，国内十大高发恶性肿瘤之一，是严重威胁人 类生命的凶险性疾病，居35岁以下人群肿瘤发病的首位，并呈逐年上升的趋势。其特征 是造血干/祖细胞恶性克隆性增生并广泛浸润骨髓、肝、脾和淋巴结，最终破坏全身器官组 织，导致贫血、出血、感染等症状。虽然治疗方法有造血干细胞移植、诱导分化、免疫治疗等， 还有新开辟的针对性靶向治疗正在研究中，但化疗仍是治疗的主要手段。在杀灭癌细胞的 同时，化疗药物因其毒副作用很大而使患者难以承受，同时易产生耐药性而导致治疗失败 和复发，均是迫切需要解决的难题。当前国内外肿瘤学专家特别强调研制抗癌药的新策略 是减毒增效，及提高患者生活质量，而不同于传统化疗药，即抑制恶性细胞增殖、诱导分化、 促进凋亡、增强化疗药敏，及阻断癌细胞的恶性信号传递，但对正常细胞毒性低。第42届美国临床肿瘤学会参会的专家们充分强调提高肿瘤患者的生活质量，特 别指出治疗须放弃以往“以毒攻毒”的战斗模式，改变传统化疗放疗杀灭肿瘤细胞的疗法， 而用分子靶向药物来控制癌细胞，成为治疗白血病的新策略。国外研究抗白血病新药的重 点是诱导白血病细胞分化，促进凋亡，以减小抗肿瘤药物对人体的毒副作用。瑞士诺华公司 推出治疗慢性粒细胞白血病(CML)的新药格列卫，就是直接针对染色体易位的Bcr-Abl融 合基因产物-酪氨酸激酶“靶点”，阻断癌细胞的信号传递途径，治疗CML慢性期可以达到血 液学缓解。但缺点是停药后会复发，并出现耐药性，且对生存期的影响还需要更长期用药才 能评价。还有目前格列卫尚需依赖进口，其价格昂贵，治疗一年需20余万元。中药是开发 天然药物与前导化合药物的重要资源，已受到国内外高度重视，由于某些中药具有抗白血 病作用，而对正常细胞损伤小的优点，很多国内外研究者致力于研制抗白血病有效且低毒 中药新药。国内从三尖杉植物提取分离的三尖杉酯碱，是中国人自行研制成功的第一个抗肿 瘤药物(已化学合成)，成为治疗急性髓细胞白血病的一线药物；从砒霜提取分离的三氧化 二砷成为治疗急性早幼粒细胞白血病有效的药物，但上述两药仍属于化疗药。来自人参的 “参一胶囊”(Rg3单体)与化疗药物合用，有助于原发性肺癌、肝癌的疗效，但该药体内抗肿 瘤的作用较弱。其它的研究如冬虫夏草、苦参、白花蛇舌草、冬凌草、葛根、白藜芦、大黄、雷 公藤、天花粉等，均报道具有抗白血病作用，但多数尚停留在实验阶段，并且其作用机制及 途径均未明确。因此，提取和分离出中药中起治疗作用的有效部位或有效成分，用现代医学 的方法研究其作用和机制，并推向国际医学界是当前迫切需要解决的难题。虽然，中药直接杀灭肿瘤细胞的功效有限，但具有多靶点的作用，对于抑制肿瘤细 胞，提高患者生活质量等具有重要价值。中药治疗白血病主要作用点是促进白血病细胞凋 亡，诱导分化和成熟，协同化疗和减轻化疗药的毒副反应，促进正常造血功能的恢复，增强机体免疫力，及延长生存期。研究发现某些中药具有双向调节的独特优势，人参就是扶正固本药，增加机体的非特异性抵抗力，对各种有害应激皆有保护作用，一方面通过补益人体 正气，促进正常造血，另一方面抑制白血病细胞增殖，并诱导其凋亡而起到治疗白血病的作 用。在白血病中医辨证治疗中人参是不可缺的药物，具有扶助正气，提高机体免疫力，调整 脏腑功能，减轻化疗药物对机体的损害，增强和巩固疗效等功效。人参的主要有效成分为人参总皂苷，已确定结构的有四十余个皂苷单体，按皂苷 元所含羟基数量不同分为人参二醇组皂苷(Panaxadiol)、人参三醇组皂苷(Panaxatriol) 和齐墩果酸三类。其中二醇、三醇组皂苷占大多数，是人参中最主要的活性成分。二醇组皂 苷主要为 Ra、Rb” Rb2, Rb3> Re、RcU F4, Rg3> Rg5> Rh2, Rh4, Rk1, Rk3 和 Rs 等单体；三醇组皂苷 主要为Re、Rf、Rg” Rg2和Rh1等单体。发明人已报道自行提取的人参总皂苷抗白血病的论文6篇，应用白血病克隆增殖 试验显示人参总皂苷50 100mg/L显著地抑制白血病粒系HL-60、巨核系Meg-Ol细胞集 落的增殖。增强化疗药敏作用，使高三尖杉、阿糖胞苷、阿霉素和足叶乙苷对急性髓系白血 病患者原代祖细胞集落的杀伤作用增强1. 84 2. 23倍，并对耐药的白血病细胞也有抑制 和增强化疗药敏的作用。人参总皂苷还具有诱导HL-60细胞凋亡作用，出现Armexin V阳 性细胞和DNA降解梯形条带，流式细胞术分析DNA含量可见G0/G1期细胞减少，S期和G2/ M期细胞增多，同时直方图上呈现特征性的亚二倍体凋亡峰。其他作者对人参提取物抗肿瘤的研究较多，但均停留在实验阶段。有报道人参总 皂苷处理K562细胞后癌基因产物Bcl-2、c-myc蛋白表达明显降低，Fas表达增高，与诱导 白血病细胞凋亡有关。MTT法观察到人参皂苷单体Rbl抑制HL-60细胞增殖，RbpRb2和Rc 可使细胞色素C从线粒体内释放，通过激活凋亡效应酶Caspase-3而诱导HL-60细胞凋亡。 P-糖蛋白(P-gp，ATP结合膜糖蛋白)能将白血病细胞内的化学药物泵出胞外而使得细胞 耐药，有报道Rbl能够抑制P-gp的表达，而提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。还有报道 Rh2抑制慢粒K562细胞、早幼粒HL-60细胞、T淋巴Jurkat细胞等白血病细胞的增殖，诱导 其凋亡，并呈浓度和时间依赖效应等。综上所述，中药提取物已成为当前抗肿瘤新药研究的 一个重要方向。发明人采用生物学活性筛选与制备工艺相结合的先进方法，首先从多种中药提取 物中筛选出人参总皂苷，再进一步从人参总皂苷分离出多个提取物，经反复生物学活性研 究，从多个人参提取物中筛选出抑制白血病细胞作用最佳，且对正常造血祖细胞损害小的 有效部位。采用液相色谱_质谱联用分析方法，该人参有效部位主含人参皂苷Rd、Rg6, F4、 Rk3、Rh4, F2、Rg3, Rk1, Rg50这些单体本身在人参原料中含量不高，是提取分离制备后大量富 集。与传统的化疗药作用机制不同，具有抗白血病有效而无明显毒副作用的优势。设想在 白血病化疗期，与细胞毒药物联合应用，发挥其协同化疗作用而提高疗效；化疗间歇期，单 用而发挥其抑制白血病细胞增殖、促进凋亡和诱导分化的功效，以维持和巩固疗效等。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种抗白血病和实体肿瘤有效而无明显 毒副作用的人参有效部位。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案
一种人参有效部位，所述的人参有效部位的制备包括如下步骤(1)提取取人参切制成小段，以含水乙醇或含乙醇水进行提取，所得提取液浓缩 至80°C时相对密度为0. 8 1. 3，记为A液；
(2)A液通过醇沉或水沉处理，分离得到的上清液浓缩至浓缩液生药比达 1 0. 25 2. 5 (即每公斤浓缩液中约含相当于人参药材0. 25 2. 5kg)，记为B液；⑶层析3. 1第一次分离取B液，将其配制成生药含量为25% 150%的药液，加入氢氧 化钠，使药液中的氢氧化钠浓度达0. 1 2. Omol · L—1，充分搅拌，静置0. 5 3. 0小时，离 心或过滤，得透明液，记为C液；取C液，上大孔吸附树脂柱，所述的大孔吸附树脂为弱极性 或非极性，依次用碱液、水、5 % 45 %的乙醇洗涤，然后用45 % 80 %乙醇洗脱，收集过柱 液，记为D液；取D液，减压回收乙醇，残液浓缩至流浸膏状，干燥，获一次分离干燥物，记为 甲；3. 2第二次分离取甲，将其按0.01 0. lg/ml的浓度溶解到5% 35%的乙醇 中，充分搅拌溶解，离心或过滤，得透明液，记为E液；取E液，上大孔吸附树脂柱，所述的大 孔吸附树脂为弱极性或非极性，然后用10% 50%的乙醇洗涤，再用50% 80%乙醇洗 脱，收集过柱液，记为F液；取F液，减压回收乙醇，残液浓缩至流浸膏状，干燥，获二次分离 干燥物，即人参有效部位。本发明制得的人参有效部位主要含有下列重量份的化合物原人参二醇型皂苷Rd 3 43份原人参二醇型皂苷Rg6 4 11份原人参二醇型皂苷F4 6 17份人参三醇型皂苷Rk3 2 9份人参三醇型皂苷Rh4 5 16份人参三醇型皂苷F213 18份人参三醇型皂苷Rg3 0. 5 4份人参二醇型皂苷RK1 2 20份人参二醇型皂苷Rg5 1 30份本发明要解决的第二个技术问题是提供一种具体的制备上述人参有效部位的方 法，采用的技术方案如下一种所述的人参有效部位的制备方法，包括如下步骤(1)提取取人参切制成小段(如切成3 5mm小段)，以含水乙醇或含乙醇水进 行提取(煎煮、热回流或渗漉)，充分提取后离心或静置，得离心液或上清液，浓缩至80°C时 相对密度为0. 8 1. 3，记为A液；(2) A液采用2. 1或者2. 2所述的方法进行处理2. 1醇沉取A液，加入适量乙醇，使其含醇量达40% 80%，静置醇沉，然后吸取 醇沉上清液；残渣用适量40% 80%的乙醇洗涤，洗液离心后与上清液合并，减压回收乙 醇后继续浓缩至浓缩液生药比达1 0.25 2.5 (即每公斤浓缩液中约含相当于人参药材 0. 25 2. 5kg)，记为 B 液；2. 2水沉取A液，加入相当于A液体积1 5倍的水(冷水或热水均可)，静置水沉，然后吸取水沉上清液；残渣用适量水洗涤，洗液离心后与上清液合并，浓缩至浓缩液生 药比达1 0. 25 2. 5，记为B液；(3)层析3. 1第一次分离3. 1. 1配制上柱液取B液，将其配制成生药含量为25% 150%的药液，加入氢氧化钠，使药液中的氢氧化钠浓度达0. 1 2. Omol ·Ι^，充分搅拌，静置，离心或滤过，得透 明液，记为C液；3. 1. 2上柱取C液，上大孔吸附树脂柱，所述的大孔吸附树脂为弱极性或非极性， 直至C液全部进入大孔树脂柱内；3. 1.3碱洗涤用0. 1 1. 25mol · L-1氢氧化钠溶液洗涤，过柱液弃去；3. 1. 4水洗涤用水洗涤至过柱液呈中性止，过柱液弃去；3. 1. 5醇洗涤用5% 45%的乙醇洗涤，过柱液弃去；3. 1.6洗脱用45% 80%乙醇洗脱，收集过柱液，记为D液，待用；3. 1.7浓缩取D液，减压回收乙醇，残液浓缩至流浸膏状，干燥，获一次分离干燥 物，记为甲；3. 2第二次分离3. 2. 1配制上柱液取甲，将其按0. 01 0. lg/ml的浓度溶解到5% 35%的乙 醇中，充分搅拌溶解，离心或过滤，得透明液，记为E液；3. 2. 2上柱取E液，上大孔吸附树脂柱，所述的大孔吸附树脂为弱极性或非极性， 直至E液全部进入大孔吸附树脂柱内；3. 2. 3醇洗涤用10% 50%的乙醇洗涤，过柱液弃去；3. 2. 4洗脱用50% 80%乙醇洗脱，收集过柱液，记为F液；3. 2. 5浓缩取F液，减压回收乙醇，残液浓缩(常压或减压浓缩均可)至流浸膏 状，干燥(常压、减压、喷雾或冷冻干燥均可)，获二次分离干燥物，即人参有效部位。进一步，所述步骤(2)中，A液优选采用如下2. 1或者2. 2所述的方法进行处理2. 1醇沉取A液，加入适量乙醇，使其含醇量达40% 80%，充分搅拌，密闭，室 温或冷藏静置12小时以上，然后取醇沉上清液，残渣用75%以上的乙醇洗涤，洗液离心或 过滤后与上清液合并，减压回收乙醇后继续减压或常压浓缩至浓缩液生药比达1 0.25 2. 5，记为B液；2. 2水沉取A液，加入相当于A液体积1 5倍的冷水或热水，充分搅拌，密闭， 室温或冷藏静置12小时以上，然后取水沉上清液，残渣用水洗涤，洗液离心或过滤，合并上 清液，减压或常压浓缩至浓缩液生药比达1 0.25 2. 5，记为B液。进一步，所述的步骤(2)中，优选A液采用2. 1或者2. 2所述的方法进行处理后， 使得浓缩液生药比达1 0.5 2. 5，更优选使得浓缩液生药比达1 1 2.5。进一步，所述的大孔吸附树脂柱优选自下列之一 D1Q1、DA201, D1Q1+DA2Q1、PHD-100, PHD-200等非极性或弱极性大孔吸附树脂。进一步，步骤3. 1. 2或3. 2. 2所述的大孔吸附树脂柱的径高比各自独立为1 2 10，C液和E液的流量各自独立为0. 25 2. 5SV(即每小时液体的流出量为树脂体积的 0. 25 2. 5倍量)。
进一步，所述步骤3. 1. 3,3. 1.4,3. 1. 5,3. 1. 6、3. 2. 3或3. 3. 4中，洗涤或者洗脱流 量各自独立为0. 25 2. 5SV。本发明具体推荐所述制备方法按照如下步骤进行(1)提取取人参切制成小段，以含水乙醇或含醇水进行煎煮、热回流或渗漉提 取，充分提取后离心或静置，得离心液或上清液，浓缩至80°C时相对密度为0. 8 1. 3，记为 A液；(2) A液采用2. 1或者2. 2所述的方法进行处理2. 1醇沉取A液，加入适量乙醇，使其含醇量达40% 80%，静置醇沉，然后吸取 醇沉上清液；残渣用适量40% 80%的乙醇洗涤，洗液离心后与上清液合并，减压回收乙 醇后继续浓缩至浓缩液生药比达1 0.25 2. 5，记为B液；2. 2水沉取A液，加入相当于A液体积1 5倍的冷水或热水，静置水沉，然后 吸取水沉上清液；残渣用适量水洗涤，洗液离心后与上清液合并，浓缩至浓缩液生药比达 1 0. 25 2. 5，记为B液；⑶层析3. 1第一次分离3. 1. 1配制上柱液取B液，将其配制成生药含量为25% 150%的药液，加入氢 氧化钠，使药液中的氢氧化钠浓度达0. 1 2. Omol ·厂1，充分搅拌，静置0. 5 3. 0小时， 离心或滤过，得透明液，记为C液；3. 1.2上柱取C液，上径高比为1 1 10的大孔吸附树脂柱，流量0.25 2. 5SV，直至C液全部进入大孔树脂柱内，静置1 60分钟或不静置；所述大孔吸附树脂柱 为弱极性或非极性；3. 1. 3碱洗涤用0. 1 1. 25mol .L—1氢氧化钠溶液洗涤，流量均为0. 25 2. 5SV, 过柱液弃去；3. 1. 4水洗涤用水洗涤至过柱液呈中性止，流量0. 25 2. 5SV，过柱液弃去；3. 1. 5醇洗涤用5% 45%的乙醇洗涤，流量均为0. 25 2. 5SV，过柱液弃去；3. 1. 6洗脱用45% 80%乙醇洗脱，流量均为0. 25 2. 5SV，收集过柱液，记为 D液，待用；3. 1.7浓缩取D液，减压回收乙醇，残液浓缩至流浸膏状，干燥，获一次分离干燥 物，记为甲；3. 2第二次分离3. 2. 1配制上柱液取甲，将其按0. 01 0. lg/ml的浓度溶解到5% 35%的乙 醇中，充分搅拌溶解，离心或过滤，得透明液，记为E液；3. 2. 2上柱取E液，上径高比为1 1 10的大孔吸附树脂柱，流量0. 25 2. 5SV，直至E液全部进入大孔树脂柱内，静置1 60分钟或不静置，待用；所述大孔吸附树 脂柱为弱极性或非极性；3. 2. 3醇洗涤用10% 50%的乙醇洗涤，流量均为0. 25 2. 5SV，过柱液弃去；3. 2. 4洗脱用50% 80%乙醇洗脱，流量均为0. 25 2. 5SV，收集过柱液，记为 F液；3. 2. 5浓缩取F液，减压回收乙醇，残液浓缩至流浸膏状，干燥，获二次分离干燥物，即人参有效部位。 上述技术方案中，乙醇浓度均为体积浓度。本发明要解决的第三个技术问题是所述的人参有效部位的应用，具体的是在制备 抗白血病药物中的应用；在制备抑制实体肿瘤细胞药物中的应用，具体的，所述的实体肿瘤 细胞为L929成纤维肿瘤细胞或ECV-304肿瘤内皮细胞。本发明采用动物模型、细胞学和分子生物学技术研究，证明本发明所述的人参有 效部位治疗白血病动物模型皮下荷瘤裸小鼠，及单核白血病浸润裸小鼠的疗效显著，抑制 白血病祖细胞增殖、促进凋亡、诱导分化、协同化疗药，及阻滞白血病细胞增殖的恶性信号 传导而达到抗白血病的功效，具有抗白血病有效而无明显毒副作用的优势。因此，本发明所 述的人参有效部位可用于制备抗白血病药物。本发明所述的人参有效部位对其它实体肿瘤细胞也具有显著的抑制作用，包括 L929成纤维肿瘤细胞、ECV-304肿瘤内皮细胞等，故其可用于制备抑制实体肿瘤细胞的药 物。与现有技术相比，本发明所述的人参有效部位的有益效果在于1.研究证明人参有效部位治疗2种白血病动物模型的体内疗效显著，能够明显地 延长生存期，显著地抑制K562白血病细胞皮下荷瘤裸小鼠体内瘤体的生长，瘤组织病理检 查有不同程度地变性坏死。治疗单核SHI-I白血病细胞浸润裸小鼠模型，能够有效地抑制 骨髓的白血病细胞生长，并显著减少白血病细胞在脑组织及多个脏器的浸润。2.抑制急性髓系白血病患者原代白血病造血祖细胞的增殖，集落形成数均明显下 降，20 100mg/L的集落抑制率达到25. 6 68. 6%。同时抑制红系K562、粒系HL-60和单 核系SHI-I白血病细胞株的增殖，使集落形成数均明显下降，20 100mg/L的集落抑制率达 到26. 7 83. 5%。抑制增殖作用呈剂量依赖性，其作用机制之一是下调白血病K562细胞 增殖特异性BCR/ABL融合蛋白的表达。3.小剂量能够增强白血病细胞对化疗药物的敏感性，显示其与化疗药物的协同 性。增加K562、HL-60白血病细胞对化疗药高三尖杉酯碱和阿糖胞苷的敏感性，使小剂量化 疗药物对白血病细胞的抑制作用明显增强。4.诱导白血病细胞凋亡的作用明显，人参有效部位诱导红系K562、粒系HL-60和 单核系SHI-I等白血病细胞凋亡，Armexin V阳性的凋亡细胞率明显增加，并可见凋亡典型 的DNA降解特异性梯形条带。5.诱导白血病原始细胞分化的作用显著，流式细胞术显示白血病细胞分化特异性 标记的阳性细胞率明显增加。同时，通过激光共聚焦显微技术、Western免疫印迹法和细胞 免疫组化染色等多种方法证实促进分化的作用机制是通过上调多种白血病细胞分化相关 蛋白的表达。6.下调白血病细胞增殖相关MAPK信号途径多种蛋白激酶的表达，Western免疫 印迹分析显示能够不同程度地抑制人白血病干细胞KG-Ia细胞、红系K562细胞内AKT-I、 AKT-2、ERK-2、MEK-I和MEK-2等增殖相关蛋白激酶的表达水平，说明其通过下调增殖相关 信号途径蛋白激酶的表达，阻滞恶性信号的传导，而抑制白血病细胞的异常增殖。7.对其它实体肿瘤细胞也具有显著的抑制作用，包括L929成纤维肿瘤细胞、 ECV-304肿瘤内皮细胞等。鉴于成纤维肿瘤细胞为肿瘤细胞的生长提供支架，内皮细胞则通过形成血管提供肿瘤生长所需的营养，因此提示人参有效部位除了抗白血病的功效外，同 时也具有抗实体肿瘤的作用。
图1 实施例4中人参有效部位治疗后裸鼠体内瘤组织有不同程度的变性和坏死 (HE 染色，200 倍)，其中，A 模型对照组，B :50mg/Kg 组，C :100mg/Kg 组，D :200mg/Kg 组。 100、200mg/Kg治疗后，病理检查瘤组织细胞有肿胀、破裂，细胞核溶解等现象，说明在荷白 血病瘤裸鼠体内具有较强的抗白血病作用。图2 实施例5中人参有效部位治疗后裸鼠脑组织HCD45+白血病细胞的浸润明显 减少(200倍)，其中:A 模型对照组，B :50mg/Kg组，C :100mg/Kg组，D :200mg/Kg组。免疫 组化染色显示模型对照组的脑实质内大量人CD45+白血病细胞堆积，而100mg/Kg组脑实质 和硬膜外人CD45+细胞浸润的数量明显减少，并且未见到脑实质内有浸润，仅脑外膜覆盖有 人CD45+细胞；200mg/Kg组脑组织的白血病细胞浸润更少，未发现有脑实质的浸润，仅少量 覆盖于大脑、小脑和脑间裂隙表面。图3 实施例6中人参有效部位下调白血病细胞增殖特异性BCR/ABL融合蛋白的 表达，其中，A 对照K562细胞，B :20mg/L, C :50mg/L，D :100mg/L。激光共聚焦显微术显示 20、50mg/L组K562细胞内呈绿色荧光反应的BCR/ABL融合蛋白表达逐渐减弱，100mg/L组 的绿色荧光最弱，提示能够有效地通过下调BCR/ABL融合蛋白的表达而抑制白血病的增殖。图4 实施例7中人参有效部位增加白血病细胞对化疗药物的敏感性，图4a 增加 白血病细胞对高三尖杉酯碱(Hom)的敏感性，半固体集落培养小剂量10、20、50mg/L与小剂 量Hom联合应用时，K562、HL-60细胞的集落生成数明显低于单用Hom对照组。图4b 增加 白血病细胞对阿糖胞苷(Ara-c)的敏感性，10、20和50mg/L与小剂量Ara_c联合应用时， K562、HL-60细胞的集落生成数明显低于单用Ara_c对照组。图5:实施例8中人参有效部位诱导白血病细胞凋亡DNA降解梯形条带，其中 l.Mark、2.HL-60 对照细胞、3. 10mg/L、4. 25mg/L、5. 50mg/L、6. 75mg/L、7. 100mg/L。25、50、 75、lOOmg/L作用36小时，琼脂糖凝胶电泳分析出现细胞凋亡DNA降解的特异性梯形条带。图6 实施例9中人参有效部位上调白血病细胞分化相关Y-珠蛋白的表达，其 中:A 对照 K562 细胞，B :10mg/L,C :20mg/L,D :40mg/L。10、20mg/L 作用 K562 细胞 3 周，免 疫组化法显示表达Y-珠蛋白“+++”强阳性的细胞率明显高于不加药的对照细胞。图7 实施例9中人参有效部位诱导白血病细胞分化相关CDllb表型阳性细胞率 增高，其中7a 对照 SHI-I 细胞，7b :5mg/L，7c :10mg/L，7d :20mg/L，7e :40mg/L。10、20、 40mg/L诱导SHI-I细胞3周，分化相关⑶lib阳性细胞率明显高于不加药的对照细胞。图8 实施例10中人参有效部位下调MAPK信号途径主要蛋白激酶的表达，50、 100mg/L作用KG-Ia细胞7天后，增殖相关5种蛋白激酶AKT-1、AKT-2、ERK-2、MEK-1和 MEK-2的条带密度不同程度地低于对照细胞。50、100mg/L作用K562细胞后，5种蛋白激酶 AKT-I、AKT-2、ERK-2、MEK-I和MEK-2的条带密度也不同程度地低于对照细胞。图9 实施例11中人参有效部位抑制L929肿瘤细胞集落生成的作用，A.对照细 胞；B. 5mg/L ；C. 10mg/L ；D. 20mg/L ；Ε. 50mg/L ；F. 100mg/L。10、20、50mg/L 时集落数明显减少，细胞丛增加，并且集落形态由紧密型向疏散型转变，当药物浓度增加到100mg/L时，基本上无集落生成。
具体实施例方式下面以具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明的保护范围不限 于此实施例1人参有效部位制备1.提取取人参原料25kg，切制成3 5mm小段，以30 %的乙醇热回流提取三次， 合并各次提取液，静置，滤过得虑液，减压或常压浓缩至相对密度1. 1 (80°c )，编号A液，待用。2A液处理2. 1醇沉取A液，加入3倍体积量的95%乙醇，充分搅拌，密闭，室温静置12小时 以上。次日取醇沉上清液，残渣用71%的乙醇洗涤三次，洗液离心后与上清液合并，减压回 收乙醇后继续常压浓缩至浓缩液生药比达1 1.0 (即每公斤浓缩液中约含相当于人参药 材1.0kg)，编号:B液，待用。3.层析3.1第一次分离3. 1. 1配制上柱液取B液，加水至50L，加入适量氢氧化钠，使药液中的氢氧化钠浓 度达l.Omol .I/1,充分搅拌，静置0.5小时，300目筛滤过，得透明液，编号C液，待用。3. 1.2上柱取C液，上径高比为1 5的Dltll大孔吸附树脂柱，流量1.0SV，直至C 液全部进入大孔树脂柱内，静置30分钟，待用。3. 1. 3碱洗涤用0. Imol · L—1氢氧化钠液洗涤，流量均为1. 0SV，过柱液弃去。3. 1. 4水洗涤用水洗涤至过柱液呈中性止，流量1. 0SV，过柱液弃去。3. 1. 5醇洗涤用30%乙醇洗涤，流量均为0. 1SV，过柱液弃去。3. 1.6洗脱用80%乙醇洗脱，流量均为1.0SV，收集过柱液，编号D液，待用。3. 1.7浓缩取D液，减压回收乙醇，残液常压浓缩至流浸膏状，真空干燥，获一次分 离干燥物，编号甲，待用。3. 2第二次分离3.2. 1配制上柱液取甲，将其按0.02g/ml)的浓度溶解到20%的乙醇中配，充分搅 拌溶解，离心或滤过，得透明液，编号E液，待用。3. 2. 2上柱取E液，上径高比为1 5的DlOl大孔树脂柱，流量1. 0SV，直至E液 全部进入大孔树脂柱内，静置30分钟，待用。3. 2. 3醇洗涤用45%的乙醇洗涤，流量均为1. 0SV，过柱液弃去。3. 2. 4洗脱用80%乙醇洗脱，流量均为1. 0SV,收集过柱液，编号F液，待用。3. 2. 5浓缩取F液，减压回收乙醇，残液常压浓缩至流浸膏状，真空干燥，获二次分 离干燥物，即人参有效部位。4.人参有效部位化学成分的鉴定4. 1仪器与色谱条件液-质联用检测仪采用Agilent 1200系列高效液相色 谱-TOFQ 125联用仪，离子源为ESI源。
色谱柱Agilent ZORBAX 80AExtend-Clg (4. 6x250mm, 5 μ m)；柱温30°C；流速lml/min ；检测波长205nm ；流动相梯度见表1。4. 2样品处理取数批人参有效部位中试样品各10mg，分别以Iml甲醇超声溶解 2min,3000rmp离心lOmin，取澄清溶液供测试用，进样量2 μ 1。4. 3分析结果与结论4. 3. 1经分析发现人参有效部位中含量较高的有9个化合物，根据这9个化合物的 质谱裂解情况，同时结合人参皂苷类成分的质谱裂解规律，推测它们分别为原人参二醇型 皂苷Rd、F2与Rg3，人参三醇型皂苷Rg6、F4，Rk3, Rh4 ；及人参二醇型皂苷=RK1, Rg504. 3. 2经分析发现9个主要化合物在人参有效部位总人参皂苷中的含量比例如 表2所示。表1流动相梯度表
权利要求
1.一种人参有效部位，其特征在于所述的人参有效部位的制备包括如下步骤(1)提取取人参切制成小段，以含水乙醇或含乙醇水进行提取，所得提取液浓缩至 80°C时相对密度为0. 8 1. 3，记为A液；(2)A液通过醇沉或水沉处理，分离得到的上清液浓缩至浓缩液生药比达1 0.25 2. 5，记为B液；(3)层析3. 1第一次分离取B液，将其配制成生药含量为25% 150%的药液，加入氢氧化钠， 使药液中的氢氧化钠浓度达0. 1 2. Omol ·厂1，充分搅拌，静置0. 5 3. 0小时，离心或滤 过，得透明液，记为C液；取C液，上大孔吸附树脂柱，所述的大孔吸附树脂为弱极性或非极 性，依次用碱液、水、5 % 45 %乙醇洗涤，然后用45% 80%乙醇洗脱，收集过柱液，记为D 液；取D液，减压回收乙醇，残液浓缩至流浸膏状，干燥，获一次分离干燥物，记为甲；3. 2第二次分离取甲，将其按0.01 0. lg/ml的浓度溶解到5% 35%的乙醇中，充 分搅拌溶解，离心或过滤，得透明液，记为E液；取E液，上大孔吸附树脂柱，所述的大孔吸附 树脂为弱极性或非极性，然后用10% 50%的乙醇洗涤，再用50% 80%乙醇洗脱，收集 过柱液，记为F液；取F液，减压回收乙醇，残液浓缩至流浸膏状，干燥，获二次分离干燥物， 即人参有效部位。
2.如权利要求1所述的人参有效部位，其特征在于所述的人参有效部位主要含有下列 重量份的化合物原人参二醇型皂苷Rd 3 43份 原人参二醇型皂苷R& 4 11份 原人参二醇型皂苷F4 6 17份 人参三醇型皂苷I^k3 2 9份 人参三醇型皂苷Mi4 5 16份 人参三醇型皂苷F2 13 18份 人参三醇型皂苷Rg3 0. 5 4份 人参二醇型皂苷RK1 2 20份 人参二醇型皂苷Rg5 1 30份
3.—种如权利要求1所述的人参有效部位的制备方法，包括如下步骤(1)提取取人参切制成小段，以含水乙醇或含醇水进行提取，充分提取后离心或静 置，得离心液或上清液，浓缩至80°C时相对密度为0. 8 1. 3，记为A液；(2)A液采用2. 1或者2. 2所述的方法进行处理2. 1醇沉取A液，加入适量乙醇，使其含醇量达40 % 80 %，静置醇沉，然后吸取醇沉 上清液；残渣用适量40% 80%的乙醇洗涤，洗液离心后与上清液合并，减压回收乙醇后 继续浓缩至浓缩液生药比达1 0.25 2. 5，记为B液；2.2水沉取A液，加入相当于A液体积1 5倍的水，静置水沉，然后吸取水沉上清液； 残渣用适量水洗涤，洗液离心后与上清液合并，浓缩至浓缩液生药比达1 0.25 2. 5，记 为B液；(3)层析3.1第一次分离，3. 1. 1配制上柱液取B液，将其配制成生药含量为25% 150%的药液，加入氢氧化 钠，使药液中的氢氧化钠浓度达0. 1 2. Omol化―1，充分搅拌，静置，离心或滤过，得透明液， 记为C液；，3. 1. 2上柱取C液，上大孔吸附树脂柱，直至C液全部进入大孔树脂柱内； 3. 1. 3碱洗涤用0. 1 1. 25mol · Γ1氢氧化钠溶液洗涤，过柱液弃去； 3. 1. 4水洗涤用水洗涤至过柱液呈中性止，过柱液弃去； 3. 1. 5醇洗涤用5% 45%的乙醇洗涤，过柱液弃去； 3. 1. 6洗脱用45% 80%乙醇洗脱，收集过柱液，记为D液，待用； 3. 1.7浓缩取D液，减压回收乙醇，残液浓缩至流浸膏状，干燥，获一次分离干燥物，记 为甲；，3. 2第二次分离，3. 2. 1配制上柱液取甲，将其按0.01 0. lg/ml的浓度溶解到5% 35%的乙醇中， 充分搅拌溶解，离心或过滤，得透明液，记为E液；，3. 2. 2上柱取E液，上大孔吸附树脂柱，直至E液全部进入大孔吸附树脂柱内； 3. 2. 3醇洗涤用10% 50%的乙醇洗涤，过柱液弃去； 3. 2. 4洗脱用50% 80%乙醇洗脱，收集过柱液，记为F液；，3.2. 5浓缩取F液，减压回收乙醇，残液浓缩至流浸膏状，干燥，获二次分离干燥物，即 人参有效部位。
4.如权利要求3所述的人参有效部位的制备方法，其特征在于所述的大孔吸附树脂柱 选自下列之一 D1(11、DA2tll、D而+DA2tll、PHD-100、PHD-200。
5.如权利要求3所述的人参有效部位的制备方法，其特征在于所述的步骤(2)中，A液 采用2.1或者2. 2所述的方法进行处理后，使得浓缩液生药比1 0.5 2. 5。
6.如权利要求3所述的人参有效部位的制备方法，其特征在于步骤3.1. 2或3. 2. 2 所述的大孔吸附树脂柱的径高比各自独立为1 1 10，C液和E液的流量各自独立为 0. 25 2. 5SV;所述步骤3. 1. 3,3. 1. 4,3. 1. 5,3. 1. 6,3. 2. 3或3. 3. 4中，洗涤或者洗脱流量 各自独立为0. 25 2. 5SV。
7.如权利要求3所述的人参有效部位的制备方法，其特征在于所述制备方法按照如下 步骤进行(1)提取取人参切制成小段，以含水乙醇或含醇水进行煎煮、热回流或渗漉提取，充 分提取后离心或静置，得离心液或上清液，浓缩至80°C时相对密度为0. 8 1. 3，记为A液；(2)A液采用2. 1或者2. 2所述的方法进行处理，2. 1醇沉取A液，加入适量乙醇，使其含醇量达40 % 80 %，静置醇沉，然后吸取醇沉 上清液；残渣用适量40% 80%的乙醇洗涤，洗液离心后与上清液合并，减压回收乙醇后 继续浓缩至浓缩液生药比达1 0.25 2. 5，记为B液；，2.2水沉取A液，加入相当于A液体积1 5倍的冷水或热水，静置水沉，然后吸 取水沉上清液；残渣用适量水洗涤，洗液离心后与上清液合并，浓缩至浓缩液生药比达 1 0. 25 2. 5，记为B液;(3)层析，3.1第一次分离.3. 1. 1配制上柱液取B液，将其配制成生药含量为25% 150%的药液，加入氢氧化 钠，使药液中的氢氧化钠浓度达0. 1 2. Omol · L—1，充分搅拌，静置0. 5 3. 0小时，离心 或滤过，得透明液，记为C液；.3. 1. 2上柱取C液，上径高比为1 1 10的大孔吸附树脂柱，流量0. 25 2. 5SV, 直至C液全部进入大孔树脂柱内，静置1 60分钟或不静置；所述大孔吸附树脂柱为弱极 性或非极性；.3. 1. 3碱洗涤用0. 1 1. 25mol · L-1氢氧化钠溶液洗涤，流量均为0. 25 2. 5SV，过 柱液弃去；.3. 1. 4水洗涤用水洗涤至过柱液呈中性止，流量0. 25 2. 5SV，过柱液弃去； 3. 1. 5醇洗涤用5% 45%的乙醇洗涤，流量均为0. 25 2. 5SV，过柱液弃去； 3. 1. 6洗脱用45% 80%乙醇洗脱，流量均为0. 25 2. 5SV，收集过柱液，记为D液， 待用；.3. 1.7浓缩取D液，减压回收乙醇，残液浓缩至流浸膏状，干燥，获一次分离干燥物，记 为甲；.3. 2第二次分离.3. 2. 1配制上柱液取甲，将其按0.01 0. lg/ml的浓度溶解到5% 35%的乙醇中， 充分搅拌溶解，离心或过滤，得透明液，记为E液；.3. 2. 2上柱取E液，上径高比为1 1 10的大孔吸附树脂柱，流量0. 25 2. 5SV, 直至E液全部进入大孔树脂柱内，静置1 60分钟或不静置，待用；所述大孔吸附树脂柱为 弱极性或非极性；.3. 2. 3醇洗涤用10% 50%的乙醇洗涤，流量均为0. 25 2. 5SV，过柱液弃去； 3. 2. 4洗脱用50% 80%乙醇洗脱，流量均为0. 25 2. 5SV，收集过柱液，记为F液； 3. 2. 5浓缩取F液，减压回收乙醇，残液浓缩至流浸膏状，干燥，获二次分离干燥物，即 人参有效部位。
8.如权利要求1所述的人参有效部位在制备抗白血病药物中的应用。
9.如权利要求1所述的人参有效部位在制备抑制实体肿瘤细胞药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述的实体肿瘤细胞为成纤维肿瘤细 胞或ECV-304肿瘤内皮细胞。
全文摘要
本发明公开了一种人参有效部位及其制备方法和应用，所述的人参有效部位的制备包括如下步骤(1)提取取人参切制成小段，以含水乙醇或含乙醇水进行提取，所得提取液浓缩至80℃时相对密度为0.8～1.3，记为A液；(2)A液通过醇沉或水沉处理，分离得到的上清液浓缩至浓缩液生药比达1∶0.25～2.5，记为B液；(3)层析通过两次大孔吸附树脂柱层析分离得到所述的人参有效部位。本发明所述的人参有效部位对于抗白血病和实体肿瘤有效而无明显毒副作用。
文档编号A61P35/02GK102068477SQ20101062036
公开日2011年5月25日 申请日期2010年12月31日 优先权日2010年12月31日
发明者余潇苓, 尹利明, 林筱洁, 王潇, 肖鲁伟, 苗青, 许家鸾, 陈华, 高瑞兰 申请人:浙江省中医院