专利名称:生产人参皂甙-Rd的一种方法
本发明涉及到一种便于工业上制备人参皂甙-Rd(人参皂甙中的一种)的方法。
近年来对人参(例如人参Panax ginseng C.A.Meyer的根)的成分进行了广泛的研究，并已分离出作为人参有效成分的不同类型的人参皂甙。在这些人参皂甙中，人参皂甙-Rd(以下可称它为化合物〔Ⅰ〕)和人参皂甙-Rb1(以下称可它为化合物〔Ⅱ〕)属于人参的主要有效成份。对它们的药理作用已经做了阐明，现在已经知道这两种人参皂甙-Rd和-Rb1，在它们所具有的许多种活性之中，在实用的药理活性，例如止痛活性、镇静活性、改善代谢的活性、或改善心血管系统的活性。已经表明人参皂-Rd的药理活性比人参皂甙-Rb1的药理活性要强得多。但是，在人参(例如人参Panax ginseng C.A.Meyer的根)中人参皂甙-Rd的含量很少，以致从植物中抽提它远不是工业上有利的制法。此外，人参是非常昂贵的。因此需要发展一种产率高，纯度好，并简单易行的制取人参皂甙-Rd的方法。
近来有报告从绞骨蓝(Gynostemma pentaphyllum Makino)中，与人参皂甙-Rb1一起提取出人参皂甙-Rd，绞骨蓝是一种多年生的藤本植物，天然生长于亚洲各地，〔日本药学杂志(Yakugaku zasshi)，103，第173页(1983)〕;日本公布的未审查专利申请号No.56-12739(12739/1981)。但是，绞骨蓝中主要的皂甙不是人参皂甙-Rd，而是gypenoside V。
人参皂甙-Rd，人参皂甙-Rb1和gypenoside V(以下可称它为化合物〔Ⅲ〕)都可用下面的结构式表示，它们的化学名称如下。
从上述结构式中可看出，在人参皂甙-Rd、人参皂甙-Rb1、和gypenoside V中的化学结构式上只有取代基R有区别，因此本发明者们认为人参皂甙-Rd可以从人参皂甙-Rb1或gype-noside V用化学方法衍生。更具体地说，认为R-O键的选择性断裂，即在人参皂甙-Rb120-位上的龙胆二糖基部分的末端β-D-葡糖苷键或是gypenoside V 20-位上的芸香糖基部分的α-L-鼠李糖苷键断裂将会产生人参皂甙-Rd。但是，在人参皂甙-Rb1或gypenoside V中，除R-O部分外还有三个对水解敏感的糖苷键，仅选择性地水解这一R-O部分是困难的。例如，当在不同的酸性条件下将人参皂甙-Rb1或gypenoside V进行水解时，
并不能得到人参皂甙-Rd。
本发明者们对于比酸水解有更高选择性的水解反应进行了深入的研究，用一种特异性酶的酶反应从人参皂甙-Rb1和/或gype-noside V有效地生产人参皂甙-Rd获得成功，于是完成了本发明。
这就是说，本发明涉及到生产人参皂甙-Rd的工艺过程，它包括鼠李糖苷酶和/或葡糖苷酶对gypenoside V和/或人参皂甙-Rb1的作用。更具体地说，按照本发明的工艺，人参皂甙-Rd是以鼠李糖甙酶对gypenoside V作用，或葡糖甙酶对人参皂甙-Rb1作用而生产出来的。
作为本发明的方法的起始原料(底物)的gypenoside V和人参皂甙-Rb1，可以分别将其分离出来，或者以其混合物形式分离出来。从工业观点出发，最好是使用含有gypenoside V，人参皂甙-Rb1和人参皂甙-Rd的绞骨蓝提取物，或是含有人参皂甙-Rb1和人参皂甙-Rd的人参根的提取物做为原料(底物)。按照本发明的方法将gypenoside V或/和人参皂甙-Rb1转变成人参皂甙-Re，但在原料中的人参皂甙-Rd不改变。诚然，用绞骨蓝提取物做为原料(底物)是最有利的，因为绞骨蓝可以很便宜地买到，而人参却很贵。将绞骨蓝提取物或人参根的提取物做为底物按照本发明的方法进行酶解可以提供一种富集人参皂甙-Rd的提取物。将这样提取出来的物质再进行普通的分离和/或纯化处理，例如层析，重结晶等，很快就得到高纯度的人参皂甙-Rd。与从绞骨蓝或人参根中抽提、分离和/或纯化人参皂甙-Rd的普通方法相比，本发明的方法提供的人参皂甙-Rd产量大，纯度高，并且容易得多。
在本发明中所使用的酶是鼠李糖苷酶和/或葡糖苷酶。鼠李糖苷酶和/或葡糖苷酶是用培育微生物的方法生产的，这种微生物能够在液体培养基中产生鼠李糖苷酶和/或葡糖苷酶，并累积鼠李糖苷酶和/或葡糖苷酶。这些微生物的例子中包括真菌和酵母。用这些酶来水解人参皂甙-Rb1的葡糖苷键和/或gypenoside V的鼠李糖苷键。具体来说，是鼠李糖苷酶水解gypenoside V上的α-L-鼠李糖苷键，葡糖苷酶水解人参皂甙-Rb120-位的龙胆二糖基部分的末端β-D-葡糖苷键。因此，在本发明中所使用的鼠李糖苷酶可以是对gypenoside V有活性的任何一种酶，在本发明中所使用的葡糖苷酶可以是能水解人参皂甙-Rb1末端β-D-葡糖苷键的任何一种酶。这两种酶可以单独纯化后使用，也可以用它们的混合物。当用gypenoside V或绞骨蓝提取物做底物时，可使用鼠李糖苷酶或使用鼠李糖苷酶和葡糖苷酶的混合物，当用人参皂甙-Rb1或人参根的提取物做底物时，可使用葡糖苷酶或使用葡糖苷酶和鼠李糖苷酶的混合物。但是，要得到纯的酶一般需要大量的劳动和花费。在本发明中，这两种酶甚至在粗制品状态也可使用，只要它们含有的鼠李糖苷酶和/或葡糖苷酶具有足够满足本发明需要的活性。此外，也可以使用含有具有适合于本发明所需活性的鼠李糖苷酶和/或葡糖苷酶的液体培养基。从工业观点出发，使用绞骨蓝提取物做为底物，和用粗酶或液体培养基做为酶，是生产人参皂甙-Rd最为有利的方法。本发明的酶解作用一般在pH值从大约4到7和温度从大约40到65℃的条件下进行的。
做为适用于本发明效用的粗酶，商业上可买到的粗酶制剂都可使用，例如“可溶性桔皮苷酶”(由日本Tanabe Seiyaku公司生产)。这种“可溶性桔皮苷酶”是一种粗酶，除含有对gypenoside V有活性的鼠李糖苷酶外，还含有葡糖苷酶。例如，当把“可溶性桔皮苷酶”加到gypenoside V上或加至绞骨蓝的水提取液中时，将混合物保持在pH值从大约6.8到7(最好在缓冲溶液中)，温度从大约50到60℃的条件下，则可以很高的产率产生人参皂甙-Rd。当缓冲溶液使用普通常用的缓冲溶液，如邻苯二甲酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液等时，“可溶性桔皮苷酶”是一种特别适用于将gypenoside V转变为人参皂甙-Rd的酶。
适合于本发明效用的液体培养基可以这样来制备，即将属于真菌类(例如真菌、酵母)的某些菌株放在含有L-鼠李糖或一种含有α-L-鼠李糖苷键的物质(做为碳源)的培养基中培养，然后按照以下介绍的方法，选择能够将gypenoside V和/或人参皂甙-Rb1以高产率转换成人参皂甙-Rd的菌株。
在这种液体培养基中，除葡糖苷酶外，还累积了对gypenosi-de V有活性的鼠李糖苷酶，液体培养基本身也可被用做将gypeno-side V和/或人参皂甙-Rb1转变成人参皂甙-Rd的酶源。例如，将gypenoside V或绞骨蓝提取液加到这种液体培养基中，使混合物pH值保持在约4到7，温度从约40到65℃，最好在pH值从约5至7，和在温度从约40到55℃的条件下，则会以高产率得到人参皂甙-Rd。还有，将人参皂甙-Rb1或人参根的提取物加到这种液体培养基中，使混合物保持在pH值从约4到7，温度从约40到65℃，最好是pH值从约5到7，温度从约40到55℃的条件下，则以高产率得到人参皂甙-Rd。
含有α-L-鼠李糖苷键的物质的例子包括具有鼠李糖基的寡糖(双糖到四糖)，以及具有鼠李糖基的糖苷，前者可以芸香糖、新橙皮糖等为例，后者可以橙皮苷，芦丁，柑桔苷等为例。
为了得到适合于本发明效用的液体培养基，在培养某些属于真菌类的菌株时，可使用一种水溶液培养基，内含碳源的浓度从大约0.1到大约10毫克/毫升，最好使用从大约0.5到大约3毫克/毫升的L-鼠李糖或具有α-L-鼠李糖苷键的一种物质。另外，液体培养基可以含有氮源和可用于一般的微生物培养的无机盐，也可制得适合于本发明效用的液体培养基。
可用有机化合物或无机化合物做为氮源，例如胨、尿素、硫酸铵、氯化铵或硝酸铵，单独使用或联合使用。
可用钾、钠、镁、钙、锌、铁、锰、钴、铜和磷酸等的盐类作为无机盐。
在培养基中氮源和无机盐的浓度是不严格的，只要可得到适合于本发明效用的液体培养基即可。通常发酵方法中所用的浓度范围也可用于本发明。
可在有氧条件下进行培养，例如在有氧情况下振摇或搅拌。
培养的温度最好是从约20°到40℃。培养的pH值通常是从约5.0到7.5，最好从约5.5到6.0。
pH调节是靠加入诸如缓冲液、氢氧化钠、氢氧化钾、或氢氧化钠或氢氧化钾的水溶液(从大约5到40%(重量比)，最好从约30到40%(重量比)都能得到好的结果。在上述条件下，培养通常进行2天到10天左右，最好从4天左右到7天左右，并从制成的液体培养基中选择适合于本发明效用的液体培养基。
选择适合的微生物菌株可以这样进行，即将一种对gypeno-side V和/或人参皂甙-Rb1转变成人参甙-Rd具有高转化率的液体培养基做为标准物。例如，用上述方法向所得到的约2毫升液体培养基中加入约1毫升到约10毫升(最好是约3毫升到约5毫升)磷酸盐缓冲液，其pH值是从约4.0到约8.0，向缓冲液中加入从约0.05到0.2毫升(最好是约0.1毫升)的每毫升内含约10到30毫克(最好是约20毫克)gypenoside V或是人参皂甙-Rb1的醇溶液(例如一种C1-4醇，如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇或丁醇)。
将混合物于约30°到80℃下保温约10到30小时，最好是约15到20小时。选择在其中gypenoside V或人参皂甙-Rb1的剩余量较少而人参皂甙-Rd被富集的液体培养基，因为它能满足本发明的效用。在液体培养基中化合物〔Ⅰ〕、〔Ⅱ〕和〔Ⅲ〕各自的量可用例如高效液谱法测定。
在那些未被选用的液体培养基中所使用的菌株可以重复做上述培养，并经再次或多次选择以得到一种能以高产率将gypenoside V和/或人参皂甙-Rb1转换成人参皂甙-Rd的液体培养基。更具体地说，能够将gypenoside V和/或人参皂甙-Rb1转化成人参皂甙-Rd的液体培养基可以用下述方法制备。
(1)将6.0克硫酸铵、1.0克含7分子结晶水的硫酸镁、2.0克磷酸二氢钾和1.0克酵母提取物溶于2.0升水中，(这种液体培养基以下称为“基础培养基”)，如上所述向其中加入L-鼠李糖或是一种含α-L-鼠李糖键的物质，使其浓度成为1毫克/毫升，然后将pH值调节到约5.7以制备做培养用的液体培养基。
(2)将液体培养基用要做试验的菌株接种，然后置于28℃下振摇培养一星期。
(3)将液体培养基经过棉塞过滤。把滤液按每份2毫升倒入4根试管内。这些试管再分为两组，每组有两根试管。向每组的试管中加入每份3毫升的pH7.0或pH5.0的磷酸盐缓冲液。再向每一试管中加入0.1毫升的gypenoside V的甲醇溶液(10毫克/毫升)。每组中取一个已加入pH7.0或5.0的缓冲溶液的试管，置于60℃下保温18小时。剩下的两个试管置于35℃下进行反应。
(4)用人参皂甙-Rb1代替gypenoside V进行第(3)步步操作。
(5)把从(3)和(4)得到的反应混合物分别进行高效液谱分析，以选择含有较少gypenoside V或人参皂甙-Rb1，并预期是大量富集人参皂甙-Rd的液体培养基，这类菌株的液体培养基才适用于本发明的方法。
(6)把在(5)中不合需要的那些菌株再接种到新鲜的培养基上，将此培养基再经过振摇培养一星期，然后再重复(3)-(5)的操作。
(7)经过直到步骤(6)以后仍然不能呈现满意结果的那些菌株，再将其培养三次，每次一星期。每一次都进行可适用的菌株培养基的选择。
(8)将这样选择出来的在适当的液体培养基中的菌株分别再接种到固体培养基上，这种固体培养基是上述步骤(1)用的液体培养基，每份7毫升中加入1%的琼脂，再置于20到35℃下，最好是30℃左右，培养七天。然后将培养基放在约5℃的冷处贮存。
这样贮存过的菌株分别再用上述步骤(1)所用的液体培养基和在上述步骤(2)条件下经过一周的培养。适合于本发明效用的液体培养基需经棉塞过滤。将滤液分入试管中以测定最佳反应条件。更具体地说，向每份2毫升的滤液中加入浓度为10毫克/毫升的gypenoside V或人参皂甙-Rb1的甲醇溶液，随后每份分别加入3毫升pH4.0、5.0、6.0或7.0的磷酸盐缓冲液。将这些试管放在35℃、45℃、50℃、55℃或60℃下保温18小时。将每种反应混合物都分别进行高效液谱分析，以测定在哪一种条件下gypenoside V或人参皂甙-Rb1被最有效地水解了，而人参皂甙-Rd被大量富集了。
使用按照上述方法培养选定的菌株来制得的液体培养基，调节适宜的pH和温度可以从gypenoside V或人参皂甙-Rb1很容易地生产人参皂甙-Rd，可从绞骨蓝提取物或人参根的提取物中制得人参皂甙-Rd丰富的混合物。
适用于本发明做液体培养基的真菌类菌株可举例如下浅白隐球酵母(IFO 0378)，罗伦隐球酵母(IFO 0609)，苔上生的汉逊酵母(IFO 1383)，泡盛曲霉(IFO 4033)，炭黑曲霉(IFO 4038)，黑曲霉(Aspergillus niger var.fermentarius)(IFO 4068)和金黄曲霉(Aspergillus aureus var.minor)(IFO 4118)。较好的菌株是浅白隐球酵母(IFO 0378)，罗伦隐球酵母(IFO 0609)，炭黑曲霉(IFO 4038)和黑曲霉(IFO 4068)。但是如上文所述，可以使用任何菌株，只要它们可以提供含有能满足本发明效用的活性的鼠李糖苷酶和/或葡糖苷酶的液体培养基。
在培养基中培养属于隐球菌属、汉逊酵母属或曲霉属的微生物，以在液体培养基中产生鼠李糖苷酶和/或葡糖苷酶的液体培养基，也可用于本发明。
上面提到过的一些菌株，IFO 0378，IFO 0609，IFO 1383，IFO 4033，IFO 4038，IFO 4068和IFO 4118都已存放在大阪发酵研究所，并被列入由上述研究所出版的“1984年第七版的培殖目录”中。
根据本发明，具有诸如止痛、镇静、改善代谢、或改善心血管系统等许多有用的药理活性的人参皂甙-Rd，能够以高产率、高纯度、较易制取和低费用的方式提供。
以下诸例将更具体地解释本发明，但并不是对本发明的范围作任何限制。
实例1将2毫克gypenoside V和50毫克“可溶性桔皮苷酶”(日本Tanabe Seiyaku公司生产)加入到5毫升0.025M磷酸盐缓冲溶液中。将四份这种溶液的样品，分别在表1所指定的pH和温度下保持18小时。每种生成物各取5微升做高效液相色谱分析＊，以测定原料和人参皂甙-Rd的含量。结果示于表Ⅰ(在表Ⅰ中的“%”表示与理论值之比，在表2到表9中表示相同含义)。
用人参皂甙-Rb1作为底物来代替gypenoside V，然后按上述步骤处理。结果示于表2。
＊高效液相色谱分析的条件(以下所述的各例中均使用这些条件)固定相TSK凝胶ODS-120T(由日本Toyo Soda制造公司生产、φ4.6×250mm)。
移动相乙腈-水(36∶64，(体积比)，流速-1.2毫升/分。检测波长-203毫微米。
保留时间-人参皂甙-Rb1约8.5分，gypenoside V 约15.5分人参皂甙-Rd 约21.3分实例2在1升水中，溶入123克绞骨蓝地上部分的提取物，内含7.12克gypenoside V，1.23克人参皂甙-Rb1和0.61克人参皂甙-Rd如例1中所述，向此溶液中加入500克“可溶性桔皮苷酶”，随后用0.2M磷酸氢二钠的水溶液将pH调至7.0。然后将混合物放在60℃下保温24小时。
将反应混合物放在2℃的冷处静置七天，可得到13.4克苍白色沉淀，将此沉淀经Li Chroprep RP-8(美国Merck公司生产)柱层析，然后用65%(体积比)含水甲醇洗脱，可得到7.01克人参皂甙-Rd和1.03克人参皂甙-Rb1。
绞骨蓝地上部分的上述提取物可用下面的方法制备。向2公斤干燥的绞骨蓝地上部分中加入10升甲醇。将混合物回流加热2小时。将甲醇提取液在减压下浓缩至1升。
向浓缩液中加入2升水和2升醋酸乙酯。振摇混合物。分去水层并在减压下浓缩至干。
实例3用0.2M磷酸盐缓冲液将其中含有1200毫克L-鼠李糖的1200毫升基础培养基溶液的pH值调至5.7，将它用黑曲霉(Aspergillus niger var.fermentarius)(IFO 4068)接种，然后置于28℃，在振摇下培养7天。液体培养基经棉塞过滤，将滤液分为每份4毫升。将每份的pH值调至如表3所指定的一种，然后各加入4毫克的gypenoside V或是人参皂甙-Rb1。将每种混合物在表3所指定的温度下保温18小时。每种反应混合物经高效液相色谱分析。结果示于表3。
在使用上述例3条件下所制备的IFO 4068液体培养基时，从表3的结果可总结出，对于gypenoside V转化为人参皂甙-Rd，最好让反应在pH值为7左右和在温度从约40到约45℃的范围内进行。还有，为了把人参皂甙-Rb1转化成人参皂甙-Rd，让反应在pH值为5左右和在温度从约40到约55℃的范围内进行最好。
实例4向含有600毫克的桔皮甙的600毫升基础培养基中，加入0.2M磷酸盐缓冲液以调节pH值至5.7，将此培养基用炭黑曲霉(IFO 4038)接种，然后在28℃下振摇培养7天。此液体培养基再用与例3同样的方法处理。
结果示于表4。
在使用例4条件下所制备的上述IFO 4038液体培养基时，从表4的结果可总结出，对于把gypenoside V转化为人参皂甙-Rd，最好让反应在pH值为7左右和温度在从约45到约55℃的范围内进行。还有，对于人参皂甙-Rb1转化成人参皂甙-Rd，显然最好让反应在pH从约5到6和温度从约55到60℃的条件下进行。
实例5在15毫升水中溶解5.0克绞骨蓝地上部分的提取物，内含167.7毫克gypenoside V，80.9毫克人参皂甙-Rb1和67.1毫克人参皂甙-Rd。向此溶液中加入350毫升从例3中所制得的液体培养基，随后用0.2M磷酸缓冲液将pH值调至5.0。再将此混合物放在45℃下保温13小时，混合物再经高效液相色谱分析，测定其中所含的第一种皂甙的含量。在反应混合物中人参皂甙-Rd的含量为220.3毫克，人参皂甙-Rb1的含量为15.8毫克，未发现有gypenoside V。
上述绞骨蓝地上部分的提取物是用下述方法制备的。向100克干燥的绞骨蓝地上部分中加入500毫升甲醇。将混合物回流加热2小时。在减压下将甲醇提取液浓缩至50毫升。
向浓缩液中加入100毫升水和100毫升醋酸乙酯。振摇此混合物。分去水层并在减压下浓缩至干。
实例6在15毫升水中溶入与例5同样多的绞骨蓝地上部分的提取物底物。使用350毫升在例4中所制得的液体培养基，在pH值为7.0和在55℃条件下，让反应以类似于例4的方式进行。反应混合物含有200.5毫克人参皂甙-Rd，64.8毫克人参皂甙-Rb1，无gypenoside V。
实例7在50毫升水中溶解含有305毫克人参皂甙-Rb1和25毫克人参皂甙-Rd的Panax人参粗皂甙2克。向此溶液中加入350毫升例3中制得的液体培养基，使混合物在pH值为5和50℃下保温15小时。在反应混合物中人参皂甙-Rd的含量是290.6毫克，人参皂甙-Rb1为6.3毫克。
上述的粗皂甙是用如下的方法制备的。向2千克Panax人参的干根中加入10升甲醇，在回流下加热2小时。将甲醇的提取液在减压下浓缩至1升。向浓缩液中加入2升水和3升丁醇。取出丁醇可溶部分，将其在减压下浓缩并干燥后得到100克的粗皂 甙。
实例8向600毫升内含600毫克桔皮苷的基础培养基中，加入1N氢氧化钠使其pH值为5.7。将培养基用浅白隐球酵母(IFO 0378)接种，再放在28℃下振摇7天。将液体培养基用类似于例3的方式处理，结果示于表5。
在使用上述例8条件制备出的IFO 0378液体培养基时，由表5的结果可以得出这样的结论，即为了把gypenoside V转化成人参皂甙-Rd，最好是让反应在pH值为7左右和温度约为40℃的条件下进行。
实例9向内含600毫克桔皮甙的基础培养基600毫升中加入1N氢氧化钠使其pH值到5.7。将培养基用罗伦隐球酵母(IFO 0609)接种，再放在28℃下振摇7天。然后把此液体培养基用类似于例3的方式处理。结果示于表6。
在使用上述用例9条件制备出的IFO 0609液体培养基时，可以得出这样的结论，即为了把gypenoside V转化成人参皂甙-Rd，最好是让反应在pH值约为7和约40℃的条件下进行。
实例10向内含600毫克桔皮苷的600毫升基础培养基中加入1N氢氧化钠使其pH值达到5.7。将培养基用罗伦隐球酵母(IFO 0609)接种，再放在28℃下培养7天。此液体培养基经棉塞过滤。向滤液中加入120毫升绞骨蓝地上部分的提取液，内含4.45克gypenoside V，2.05克人参皂甙-Rb1和1.32克人参皂甙-Rd。向混合物中加入1N氢氧化钠使其pH值达到7.0，然后置于40℃下搅拌75小时。将反应混合物倒入用0.5升Amberlite XAD-2(美国Rohm & Haas公司制造)填装的柱中。皂甙被吸附到载体上，把载体先用2升水洗，再用2升40%(体积比)甲醇洗，随后用2升60%(体积比)甲醇洗脱。洗脱液在减压下浓缩至干，残留10克淡黄棕色粉末，将其溶解在50毫升45%(体积比)甲醇中。将此溶液加到用500克ODS-Q3(日本Wako纯化学工业有限公司生产)填装的柱上。柱子用1升55%(体积比)甲醇冲洗，再用62.5%(体积比)甲醇洗脱，可制得3.12克(纯
度94%)的人参皂甙-Rd，1.85克(纯度91%)的人参皂甙-Rb1，和2.41克(纯度90%)的gypenoside V。
上述绞骨蓝地上部分的提取液是用如下方法制备的。向250克绞骨蓝地上部分的干料中加入2升甲醇。将混合物回流加热1小时。在减压下浓缩甲醇液至50毫升。向浓缩液中加入70毫升水和100毫升乙酸乙酯，并振摇混合物。分离出水层。
实例11向内含600毫克芦丁的600毫升基础培养基中加入0.2M磷酸缓冲液以调pH值至5.7，将它用炭黑曲霉(IFO 4038)接种，再放在28℃和振摇下培养7天。然后将液体培养基用类似于例3的方式处理。结果示于表7和表8。
在使用上述例11的条件所制备的IFO 4038液体培养基时，由表7的结果可以得出这样的结论，即对于gypenoside V转化为人参皂甙-Rd，最好是让反应在pH值从约6到约7和温度范围从约40到约60℃的条件下进行。由表8可以看出，对于人参皂甙-Rb1转化成人参皂甙-Rd，最好让反应在pH值从约4到6和在温度范围为40℃左右的条件下进行。
实例12用0.2M磷酸盐缓冲液，将600毫升内含600毫克L-鼠李糖的基础培养基的pH值调至5.7，此培养基用汉逊酵母(IFO 1383)接种，然后置于28℃和振摇下培养7天。再用类似于例3的方式处理此液体培养基。
在使用上述例12条件制备出的IFO 1383液体培养基时，可从表9得出这样的结论，即对于gypenoside V转化为人参皂甙-Rd，最好让反应在pH值约7和温度约40℃的条件下进行。对于人参皂甙-Rb1转化成人参皂甙-Rd，让反应在pH值约4和温度约40℃的条件下进行最好。
勘误表
权利要求
1.生产人参皂甙-Rd的一种方法，包括鼠李糖苷酶和/或葡糖苷酶对gypenoside V和/或人参皂甙-Rb1的作用。
2.按权利要求
1的方法，其中鼠李糖苷酶和/或葡糖苷酶是用培养微生物的方法产生，这种微生物能够在液体培养基中产生鼠李糖苷酶和/或葡糖苷酶。
3.按权利要求
2的方法，其中微生物是真菌类。
4.按权利要求
2的方法，其中微生物是酵母。
5.按权利要求
3的方法，其中真菌属于真菌属。
6.按权利要求
4的方法，其中酵母属于汉逊酵母属。
7.按权利要求
4的方法，其中酵母属于隐球酵母属。
8.按权利要求
1的方法，其中反应是在pH值从约4到约7和温度在约40到约65℃的条件下进行的。
9.按权利要求
2的方法，其中微生物是黑曲霉(Aspergillusniger var.fermentarius)。
10.按权利要求
2的方法，其中微生物是炭黑曲霉。
11.按权利要求
2的方法，其中微生物是浅白隐球酵母。
12.按权利要求
2的方法，其中微生物是罗伦隐球酵母。
专利摘要
本发明涉及一种有利于工业上制备人参皂甙-Rd(人参皂甙的一种)的方法。按照本发明的方法，能以高产率、高纯度并很容易地生产出人参皂甙-Rd。所制得的人参皂甙-Rd可用做止痛剂、镇静剂、改善代谢或改善心血管系统的药剂。
文档编号C07J17/00GK86105166SQ86105166
公开日1987年3月4日 申请日期1986年7月22日
发明者大盐春治, 桑原雅明, 小宫威∴ 申请人:武田药品工业株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan