专利名称：杏香兔耳风咖啡酰奎宁酸类提取物及其制备与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于中药领域，涉及杏香兔耳风咖啡酰奎宁酸类提取物制备工艺及其在开 发抗炎、抗细菌、抗耐药菌株、治疗宫颈炎疾病等新型药物中的应用。
背景技术：
杏香兔耳风(Ainsliaea fragrans Champ.)是菊科兔耳风属植物，为《江西省中 药材标准》1996年版收载。其具有清热解毒、利湿、止血等功效，民间以全草入药，主治虚劳 骨蒸，肺痨咳血、妇女崩漏、湿热黄疸、水肿、痈疽肿毒、瘰疬结核、跌打损伤、毒蛇咬伤。分布 于江苏、浙江、江西、福建等地。现代药理试验表明，杏香兔耳风中主要的药效活性成分主要 含3-咖啡酰基奎宁酸、3，5-二咖啡酰基基奎宁酸、4，5-二咖啡酰基基奎宁酸等，具有提高 免疫功能、抑制炎症介质如组胺、前列腺素等释放、对宫颈炎大鼠宫颈黏膜PGE2及外周血T 淋巴细胞亚群的调节作用，尤其是抗耐药菌株等方面具有一定的作用。宫颈炎的患病率居妇科病之首，高达39. 30%，其发病原因主要有化学物质或机械 性刺激(损伤)后造成感染、病原体感染而导致炎症。宫颈炎也是诱发不孕症和宫颈癌的高 危因素之一。目前，治疗宫颈炎的药品很少，上市药品大多对轻度单纯宫颈炎疗效尚可，但 对耐药性病原菌感染、深度感染等宫颈炎疗效欠佳。目前，在已发表的文献中，杏香兔耳风提取物制备以总酚酸或总黄酮的含量为考 察指标，通过紫外分光光度计检测含量，提取物成分复杂，主要药效成分不明确，在一定程 度上将导致制剂的药效成分含量低，日服剂量大。例如一种杏香兔耳风提取物及其制备方 法(中国，专利号ZL200510075384.4)，针对黄酮及内酯类成分，经水提，聚苯乙烯型大孔 树脂精制，得到总黄酮含量为广60%的提取物。经药理研究该提取物表明其具有抗炎活性， 并可制成片剂、胶囊、颗粒剂或口服液剂型。杏香兔耳风总酚酸提取物及其制备方法(中国， 申请号200810111902. 7)，针对杏香兔耳风总酚酸，经醇提、大孔树脂精制，得到总酚酸含 量大于60%、绿原酸含量为广5%的提取物。经药理研究表明其对盆腔炎具有抑制作用。一 种杏香兔耳风有效部位及其制备方法和应用(中国，申请号200810106926. 3)针对杏香兔 耳风总酚酸，经醇提、大孔树脂精制，得到总酚酸含量为广80%的提取物，含有0. 05 20%的 绿原酸，0. 5^50%的3，5- 二咖啡酰基奎宁酸、4，5- 二咖啡酰基奎宁酸。经药理研究表明其 具有抗炎、抑菌、抗病毒作用。并且，上述专利研究表明杏香兔耳风提取物具有抗炎抑菌作 用，但未见涉及其对宫颈炎和耐药菌抑制作用的研究。
发明内容
针对目前杏香兔耳风提取物的药效成分含量低、日服剂量大，本发明主要采用 药效活性成分咖啡酰奎宁酸类物质为考察指标，对杏香兔耳风药材进行提取、纯化，得到 UV含量大于70%，HPLC含量大于50%的咖啡酰奎宁酸类物质，其中3-咖啡酰基奎宁酸和 3，5- 二咖啡酰奎宁酸含量均高于10%。本发明的杏香兔耳风咖啡酰奎宁酸类提取物，其特征在于提取物中以3-咖啡酰
3基奎宁酸，3，4- 二咖啡酰奎宁酸、3，5- 二咖啡酰奎宁酸、4，5- 二咖啡酰奎宁酸为主。本发明的杏香兔耳风咖啡酰奎宁酸类提取物，其特征在于提取物以咖啡酰奎宁酸 类成分计算，UV含量为70%以上，HPLC含量为50%以上。其中3-咖啡酰基奎宁酸和3，5-二 咖啡酰奎宁酸含量均高于10%。本发明的提取物通过以下步骤制备得到
a)取杏香兔耳风干燥药材，切段，用5 20倍体积的浓度为4(Γ80%的乙醇在6(TlO(TC 下加热回流提取2、次，每次1-3小时，过滤，合并得提取液A ；
b)提取液A经4(T60°C减压浓缩至1/Γ1/8倍，即得到浓缩液B；
c)浓缩液B用稀盐酸调pH至到广3，将酸性浓缩液经大孔树脂吸附，先用去离子水 冲洗树脂，再用水-乙醇依次梯度洗脱，收集乙醇浓度为50 70%之间的洗脱液，经40 60°C减压浓缩去醇后，得浓缩液D ；
d)再将浓缩液D用稀盐酸调pH至到1 3，经大孔树脂吸附，先用去离子水冲洗树脂， 再用水-乙醇依次梯度洗脱，收集乙醇浓度为40 70 %之间的洗脱液，合并，真空干燥，即 得杏香兔耳风咖啡酰奎宁酸类提取物。以上述方法提取的提取物以咖啡酰奎宁酸类成分计 算，UV含量为70%以上，HPLC含量为50%以上。其中3-咖啡酰基奎宁酸和3，5- 二咖啡酰 奎宁酸含量均高于10%。本发明的杏香兔耳风咖啡酰奎宁酸类提取物的制备方法，其特征在于制备步骤a 中提取溶媒选用40% 80%的乙醇。本发明的杏香兔耳风咖啡酰奎宁酸类提取物的制备方法，其特征在于制备步骤a 中提取溶媒优选50%的乙醇。本发明的杏香兔耳风咖啡酰奎宁酸类提取物的制备方法，其特征在于所述的大孔 吸附树脂选自 AB-8、HPD-400、NKA-9、HPD-拟6。本发明的杏香兔耳风咖啡酰奎宁酸类提取物的制备方法，其特征在于大孔吸附树 脂 HPD-826。本发明还涉及一种药物组合物，其特征在于包含本发明的杏香兔耳风咖啡酰奎宁 酸类提取物和药学上可接受的辅料。所述药物组合物的剂型为片剂、胶囊、颗粒剂、散剂、丸 剂、浸膏剂、口服液或糖浆剂。本发明还涉及杏香兔耳风咖啡酰奎宁酸类提取物在制备抗炎、抗细菌、抗耐药菌 株的药物中的应用。特别是在制备抗宫颈炎的药物中的应用。针对杏香兔耳风提取物成分复杂，主要药效成分不明确这一问题，本发明的杏香 兔耳风提取物制备工艺采用活性引导分级分离方法，并结合HPLC跟踪检测目标，选取中级 性苯乙烯型HPD-^6大孔吸附树脂，进行两次连续吸附解析，避免了目标成分了流失，同时 使药效成分的含量得到明显提高，所得提取物具备主要药效成分更明确、提取率高的优势。 具体表现在本发明杏香兔耳风提取物不仅经紫外分光光度计检测咖啡酰奎宁酸类成分含 量约70%，而且经HPLC检测主要药效成分含量大于50%，其中3-咖啡酰基奎宁酸和3，5- 二 咖啡酰奎宁酸含量均高于10% ；并且其中主要含有3-咖啡酰基奎宁酸、3，4- 二咖啡酰基奎 宁酸、3，5- 二咖啡酰基奎宁酸、4，5- 二咖啡酰基奎宁酸等咖啡酰奎宁酸类成分。本发明所得的杏香兔耳风提取物具有抗炎、抗细菌、抗耐药菌株药效作用，并无明 显急性毒性作用。具体表现在对大鼠肉芽肿的增生、二甲苯致小鼠耳肿胀具有显著的抑制作用；对宫颈炎大鼠病变组织病变有明显改善作用，对白细胞数量有降低作用；对抗耐药 性病原菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌感染小鼠具有较好的抗感染作用。解决了目前相关产 品对耐药性病原菌感染、深度感染等宫颈炎疗效欠佳的问题。因而，本发明的杏香兔耳风咖啡酰奎宁酸类提取工艺在药材利用率、明确主要药 效成分，减小日服剂量，提高疗效等方面具有明显的优势。本专利药理试验结果显示，杏香兔耳风药材中咖啡酰奎宁酸类成分对宫颈炎动物 模型具有明显改善作用，并具有明显抗耐药菌等作用，无明显急性毒性作用，可见将其进一 步开发成具有抗耐药菌株作用的抗宫颈炎药物，具有广阔的市场前景。
图1杏香兔耳风咖啡酰奎宁酸类成分测定标准曲线图。图2对照品HPLC图。图3杏香兔耳风提取物HPLC图。图4 宫颈炎模型大鼠病理组织切片。
具体实施例方式药效成分含量测定
(1)杏香兔耳风提取物中咖啡酰奎宁酸类成分含量测定 对照品溶液制备
取3，5_ 二咖啡酰基奎宁酸对照品适量，置于棕色容量瓶，加50%甲醇制成浓度为 0. 041mg/ml的溶液，备用。标准曲线的绘制
精密移取对照品溶液0. 5,1. 0,1. 5,2. 0,2. 5,3. Oml,分别置于IOml容量瓶中，加甲醇 定容至刻度，摇勻。在328nm处的吸光度，以吸光度Y对质量浓度X(mg/ml)绘制标准曲线。 得到回归方程:Y=0. 279Χ+0. 016，R2=O. 999。标准曲线如附图1。样品测定与对照品的测定方法相同。(2)咖啡酰奎宁酸类有效成分含量测定
色谱条件色谱柱:Diamonsil(5ymX4. 6 mmX250 mm);柱温:30°C;检测波长:328nm ； 流速lml/min ；流动相乙腈一0.觊磷酸梯度洗脱(0 min， 20:80 ； 8min, 21:79 ； llmin, 23:77)。对照品溶液的制备
精密称取3-咖啡酰基奎宁酸、3，5-二咖啡酰基奎宁酸、对照品适量，加50%乙醇制成每 1 mL含3-咖啡酰基奎宁酸0. 034mg/mL,3, 5- 二咖啡酰基奎宁酸0. 0425mg/mL的混合对照 品溶液，备用。对照品HPLC结果见附图2。按上述色谱条件，对样品进行测定，其HPLC结果见附图3。实施例1
取杏香兔耳风干燥药材lOOOg，切断(2 5cm)，用10倍的50%乙醇，85°C加热回流提取 3次，过滤，合并得提取液A，6 0°C减压浓缩至提取液A的1/6倍，即得到浓缩液B。浓缩液 B用稀盐酸调pH至2，将酸性浓缩液B经已处理好的大孔吸附树脂AB-8，先用去离子水冲洗树脂，用20%乙醇洗脱2个柱体积，然后用50%乙醇洗脱10个柱体积，收集乙醇浓度50% 洗脱液，经60°C减压浓缩去醇，得浓缩液C，浓缩液C再用稀盐酸调pH至2，经大孔吸附树 脂HPD-826，先用去离子水冲洗树脂，再用水-乙醇依次梯度洗脱，收集乙醇浓度为50%洗脱 液，合并，经真空干燥，即得杏香兔耳风咖啡酰奎宁酸类提取物20g，其UV含量70%，HPLC含 量52%。其中3-咖啡酰基奎宁酸含量为15%，3，5-二咖啡酰基奎宁酸含量为13%。实施例2
杏香兔耳风干燥药材lOOOg，切断(2 5cm)，用15倍的60%乙醇，85°C加热回流提取3 次，过滤，合并得提取液A，6 0°C减压浓缩至提取液A的1/7倍，即得到浓缩液B。浓缩液用B 稀盐酸调PH至1，将酸性浓缩液B经已处理好的大孔吸附树脂HPD-826，先用去离子水冲洗 树脂，用30%乙醇洗脱2个柱体积，然后用60%乙醇洗脱8个柱体积，收集乙醇浓度60%洗脱 液，经60°C减压浓缩，得浓缩液C，浓缩液C再用稀盐酸调pH至1，经大孔吸附树脂HPD-826， 先用去离子水冲洗树脂，再用水-乙醇依次梯度洗脱，收集乙醇浓度为60%洗脱液，合并，经 真空干燥，即得杏香兔耳风咖啡酰奎宁酸类提取物16g，其UV含量79%，HPLC含量55%，其 中3-咖啡酰基奎宁酸含量为19%，3，5-二咖啡酰基奎宁酸含量为15%。实施例3
杏香兔耳风干燥药材lOOOg，切断(2飞cm)，用20倍的70%乙醇，85°C加热回流提取3 次，过滤，合并得提取液A，6 0°C减压浓缩至提取液A的1/8倍，即得到浓缩液B。浓缩液B 用稀盐酸调PH至3，将酸性浓缩液B经已处理好的大孔吸附树脂HPD-826，先用去离子水冲 洗树脂，用30%乙醇洗脱2个柱体积，然后用70%乙醇洗脱6个柱体积，收集乙醇浓度70% 的洗脱液，经60°C减压浓缩，得浓缩液C，浓缩液C再用稀盐酸调pH至3，经大孔吸附树脂 HPD-826,先用去离子水冲洗树脂，再用水-乙醇依次梯度洗脱，收集乙醇浓度70%的洗脱 液，合并，经真空干燥，即得杏香兔耳风咖啡酰奎宁酸类提取物12g。咖啡酰奎宁酸类提取物 的UV含量为74%，HPLC含量50%，其中3-咖啡酰基奎宁酸含量为13%，3，5- 二咖啡酰基奎 宁酸含量为10%。实施例4
采用苯酚胶浆造模后进行杏香兔耳风咖啡酰奎宁酸类提取物抗宫颈炎实验研究。杏香 兔耳风咖啡酰奎宁酸类提取物高、中、低剂量组及阳性组大鼠每天灌予对应药物，共10天。 经10天给药后，各大鼠眼球取血测白细胞总数，处死动物立即取阴道、子宫称重并于福尔 马林溶液中固定。结果见表1，阳性组(喷哚美辛)及杏香兔耳风咖啡酰奎宁酸类提取物组均有降低 模型大鼠子宫器指数的作用；阳性药及杏香兔耳风咖啡酰奎宁酸类提取物组对宫颈炎模型 大鼠白细胞总数具有显著的抑制作用；组织病理学检查结果见附图4，正常组阴道、宫颈组 织无病理学改变，而模型组阴道明显的上皮脱落，宫颈黏膜增厚、嗜酸性粒细胞浸润；与模 型组比较阳性组的嗜酸性粒细胞明显减少，上皮无脱落无增厚；杏香兔耳风咖啡酰奎宁酸 类提取物高剂量组嗜酸性粒细胞明显减少，上皮无脱落无增厚；中剂量组子宫少量嗜酸性 粒细胞浸润，阴道上皮有一定脱落；低剂量阴道上皮无见明显脱落，与模型组比较宫颈嗜酸 性粒细胞浸润无明显改变。
权利要求
1.杏香兔耳风咖啡酰奎宁酸类提取物，其特征在于提取物中药理活性成分以3-咖啡 酰基奎宁酸、3，4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸为主；提取 物以总咖啡酰奎宁酸类成分计算，UV含量为70%以上，HPLC含量为50%以上，其中3-咖啡 酰基奎宁酸和3，5- 二咖啡酰奎宁酸含量均高于10%。
2.权利要求1所述杏香兔耳风咖啡酰奎宁酸类提取物的制备方法，其特征是所述提取 物通过以下步骤制备a)取杏香兔耳风干燥药材，切段，用5 20倍体积的浓度为4(Γ80%的乙醇在6(TlO(TC 下加热回流提取2、次，每次1-3小时，过滤，合并得提取液A ；b)提取液A经4(T60°C减压浓缩至1/Γ1/8倍，即得到浓缩液B；c)浓缩液B用稀盐酸调pH至到广3，将酸性浓缩液经大孔树脂吸附，先用去离子水 冲洗树脂，再用水-乙醇依次梯度洗脱，收集乙醇浓度为50 70%之间的洗脱液，经40 60°C减压浓缩去醇后，得浓缩液D ；d)再将浓缩液D用稀盐酸调pH至到1 3，经大孔树脂吸附，先用去离子水冲洗树脂， 再用水-乙醇依次梯度洗脱，收集乙醇浓度为40 70 %之间的洗脱液，合并，真空干燥，即 得杏香兔耳风咖啡酰奎宁酸类提取物。
3.根据权利要求加所述的杏香兔耳风咖啡酰奎宁酸类提取物的制备方法，其特征在 于步骤a)所述的乙醇浓度为50%。
4.权利要求2所述的杏香兔耳风咖啡酰奎宁酸类提取物的制备方法，其特征在于所述 的大孔树脂选自AB-8、HPD-400、NKA-9和HPD-拟6。
5.权利要求2或4所述的杏香兔耳风咖啡酰奎宁酸类提取物的制备方法，其特征在于 所述的大孔树脂为HPD-826。
6.一种药物组合物，其特征在于包含权利要求1所述的提取物和药学上可接受的辅料。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于所述药物组合物的剂型为片剂、胶 囊、颗粒剂、散剂、丸剂、浸膏剂、口服液或糖浆剂。
8.权利要求1所述的杏香兔耳风咖啡酰奎宁酸类提取物在制备抗炎、抗细菌、抗耐药 菌株的药物中的应用。
9.权利要求1所述的杏香兔耳风咖啡酰奎宁酸类提取物在制备抗宫颈炎的药物中的 应用。
全文摘要
本发明涉及一种杏香兔耳风咖啡酰奎宁酸类为主的提取物及其制备方法与应用，杏香兔耳风药材经乙醇回流提取，过滤浓缩去醇，盐酸调pH至1~3，上大孔吸附树脂，水洗后乙醇梯度洗脱，收集乙醇浓度为50~70%之间的洗脱液，浓缩去醇，再用盐酸调pH至1~3后，上大孔吸附树脂，依次用水-乙醇梯度洗脱，收集乙醇浓度为40~70%之间的洗脱液，合并，真空干燥即得本发明的提取物，其咖啡酰奎宁酸类提取物的UV含量可达70%以上，HPLC含量可达到50%以上，3-咖啡酰基奎宁酸和3,5-二咖啡酰奎宁酸均可达10%以上。其具有抗炎、抗细菌、抗耐药菌株等作用，对宫颈炎大鼠病变组织有较好的改善，对子宫指数及白细胞数量有明显的降低作用，可单独或与其它药物配合开发成治疗宫颈炎药物。
文档编号A61P29/00GK102100720SQ20111003836
公开日2011年6月22日 申请日期2011年2月15日 优先权日2011年2月15日
发明者孙勇兵, 张武岗, 杨世林, 罗晓健, 陈兰英, 魏慧珍, 黄恺 申请人:江西本草天工科技有限责任公司