专利名称：活化人工骨体外构建方法及配套循环灌注接种环路的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及应用于活化人工骨体外构建中成骨性种子细胞与人工骨快速、高效的复合方法，特别涉及一种活化人工骨体外构建方法及配套循环灌注接种环路，能够显著提高细胞接种效率，缩短人工骨体外活化时间，增强活化效果，同时便于大规模生产、消毒、包装、运输、贮存和临床使用，利于人工骨的体外活化及临床应用。
背景技术：
骨移植术是治疗骨缺损和促进骨愈合的重要手段之一，自体骨移植因其能为成骨细胞和骨组织的生长提供支架(骨传导性)、诱导周围组织中的成骨前体细胞向缺损区域内的移行和向成骨细胞分化(骨诱导性)、直接提供可参与成骨活动、形成新骨的成骨细胞(骨生成性)等特点，至今仍是骨移植的“金标准”。但是，自体骨骨量有限，取骨手术增加了患者的创伤和痛苦、延长了手术时间，且存在供区感染、出血、疼痛等并发症。因此，同种异体骨、异种骨、人工骨等均获批作为自体骨替代物应用于骨移植术中。但是，免疫排斥反应、病毒传染等风险限制了异体骨和异种骨的推广应用。近年来，以钙磷类材料为主的人工骨在骨缺损的临床治疗中得到迅速推广和普及。然而，由于现有人工骨材料均不含有成骨细胞，主要依靠骨传导性即宿主骨的长入和爬行替代完成修复，骨愈合过程缓慢，修复效果并不理想。将骨愈合和骨修复的主体——成骨性种子细胞接种到各种人工骨和植骨材料上， 形成的活化人工骨兼具骨传导性、骨诱导性和骨生成性。相比于异体骨、异种骨和人工骨， 复合有成骨细胞的活化人工骨是一种成骨活性最接近自体骨的骨移植物。在活化人工骨的构建中，细胞接种是关键步骤。目前应用最普遍的细胞静态接种方法是通过重力、负压或毛细管作用使细胞接种至支架材料上(内)，操作简便，但接种效率很低，支架上细胞数量少，成骨活性差，同时造成大量种子细胞的浪费；其次，细胞多附着在支架材料表面而难以进入内部，造成支架内细胞分布很不均勻；再次，静态接种方法依靠纯手工操作，易污染，难以转化形成规模化生产。此外，由于含有活细胞，活化人工骨的包装、 消毒、运输、贮存等也存在诸多限制，这些原因导致迄今为止这种公认为“理想的骨移植物” 的活化人工骨仍未真正在临床中得到应用。
发明内容
针对上述现有技术存在的缺陷或不足，本发明的目的在于，提供一种活化人工骨体外构建方法及配套的循环灌注接种环路。为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案 一种活化人工骨体外构建方法，其特征在于，按下列步骤进行
1)制作配套使用的循环灌注接种环路，该循环灌注接种环路由灌流室、连接管、以及连接管上串联的第一通道转换器和第二通道转换器组成；
2)将待活化的人工骨材料预先装入循环灌注接种环路的灌流室内；以单个循环灌注接种环路为单位进行独立包装；
3)使用前于无菌状态下取出循环灌注接种环路，将单个或多个循环灌注接种环路与蠕动泵相连，置于浓度为5%的(X)2环境、温度为37°C的培养箱内；
4)经第二通道转换器向循环灌注接种环路内注满细胞培养液，开启蠕动泵4-6小时， 进行人工骨材料预湿化处理并排出材料孔隙内空气；经第一通道转换器将预定数量种子细胞注入循环灌注接种环路中，将第一通道转换器和第二通道转换器调节至整个循环灌注接种环路通畅；
5)开启蠕动泵进行循环灌注接种12- 24小时，得到活化人工骨。实现上述活化人工骨体外构建方法的配套循环灌注接种环路，其特征在于，由灌流室、连接管、以及连接管上串联的第一通道转换器和第二通道转换器组成。所述的蠕动泵为防水型蠕动泵。所述的环路中连接管为透气性管。上述得到的活化人工骨可以移植入患者体内进行骨缺损或骨折治疗、脊柱融合寸。本发明的显著特点在于
1、通过灌注式动态循环细胞接种，能够显著提高种子细胞接种效率和待活化的人工骨材料内细胞分布均勻度，从而增强活化人工骨构建效果，缩短构建时间；
2、预活化的人工骨材料封闭于灌注环路内，使用时通过灌注环路的蠕动泵管部分环路与蠕动泵直接组装，方便包装、消毒、运输和贮存，利于临床使用；
3、整个细胞接种过程均在封闭环境下进行，最大限度避免了污染；
4、接种细胞密度、数量，灌注接种速率、方式(单向循环、双向往复)等均精确可控。因此，可在短时间(12- 小时)内快速构建出活化人工骨，满足临床治疗需要。本发明较传统静态接种方法大大节省了种子细胞数量；整个细胞接种过程均在封闭环境下进行，最大限度避免了污染，预活化的人工骨材料封闭于灌注环路内，使用时通过灌注环路的蠕动泵管部分环路与蠕动泵直接组装，方便包装、消毒、运输和贮存，利于临床使用。
图1是本发明所涉及的配套循环灌注细胞接种环路结构及其工作状态示意图；图中的连接管用标记7表示，粗箭头标记6表示细胞循环灌注接种状态。下面结合附图和实例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施例方式参照图1，本发明的活化人工骨体外快速构建方法，首先制作配套循环灌注接种环路，配套循环灌注接种环路由灌流室2、连接管7、以及连接管7上串联的第一通道转换器4 和第二通道转换器6组成；使用过程中，通过调节第一通道转换器4和第二通道转换器5即可在环路内添加种子细胞悬液及更换培养液，或取样检测。根据置入人工骨材料的不同选取相应规格的灌流室2，将待活化的人工骨材料3 预先装入灌流室2内，以单个灌注接种环路为单位进行独立包装。
使用前于无菌状态下取出配套循环灌注接种环路，通过配套循环灌注环路的连接管7与蠕动泵1相连接(多个配套循环灌注接种环路可同时连接于一台蠕动泵上)，将整个循环灌注接种环路置于浓度为5%的CO2环境、37°C培养箱内。经第二通道转换器5向接种环路内注满细胞培养液，开启蠕动泵1，以设定速率灌注4-6小时，进行人工骨材料预湿化处理并排出材料孔隙内空气。经第一通道转换器将预定数量种子细胞注入循环灌注接种环路中，将第一通道转换器4和第二通道转换器5调节成灌注接种状态(图中的粗箭头6表示的回路)，开启蠕动泵1，以设定速率进行灌注接种，12-24小时后细胞在活化的人工骨材料内接种完毕，快速得到活化人工骨。用于移植入患者体内进行骨移植术治疗。蠕动泵1为防水型蠕动泵，由防水型蠕动泵提供灌注动力，灌流室2内预置人工骨材料3，连接在灌流室2入管上的第一通道转换器4用于加注种子细胞悬液，第二通道转换器5用于细胞培养液的注入及必要时更换。环路中的连接管7均为透气性管，可保持本系统内、外自由的气体交换。在活化人工骨构建必需的细胞接种过程中，通过灌注式动态循环细胞接种方法， 接种细胞密度、数量，灌注接种速率、方式(单向循环、双向往复)等均精确可控，因此可显著提高种子细胞接种效率和支架材料内细胞分布均勻度，缩短了构建时间，增强了构建效果， 较传统静态接种方法大大节省了种子细胞数量；整个细胞接种过程均在封闭环境下进行， 最大限度避免了污染；预活化的人工骨材料封闭于灌注环路内，使用时通过灌注环路的蠕动泵管部分环路与蠕动泵直接组装，方便包装、消毒、运输和贮存，利于临床使用。
权利要求
1.一种活化人工骨体外构建方法，其特征在于，按下列步骤进行1)制作配套使用的循环灌注接种环路，该循环灌注接种环路由灌流室、连接管、以及连接管上串联的第一通道转换器和第二通道转换器组成；2)将待活化的人工骨材料预先装入循环灌注接种环路的灌流室内，以单个循环灌注接种环路为单位进行独立包装；3)使用前于无菌状态下取出循环灌注接种环路，将循环灌注接种环路与蠕动泵相连， 并将循环灌注接种环路置于浓度为5%的(X)2环境、温度为37°C的培养箱内；4)经第二通道转换器向循环灌注接种环路内注满细胞培养液，开启蠕动泵4-6小时， 进行人工骨材料预湿化处理并排出材料孔隙内空气；经第一通道转换器将预定数量种子细胞注入循环灌注接种环路中，将第一通道转换器和第二通道转换器调节至整个循环灌注接种环路通畅；5)开启蠕动泵进行循环灌注接种12- 24小时，得到活化人工骨。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蠕动泵为防水型蠕动泵。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的连接管为透气性管。
4.一种实现权利要求1所述的活化人工骨体外构建方法的配套循环灌注接种环路，其特征在于，由灌流室(2)、连接管(7)、以及连接管上串联的第一通道转换器(4)和第二通道转换器(5)组成。
5.如权利要求4所述的配套循环灌注接种环路，其特征在于，所述的第一通道转换器 (4)用于向循环灌注接种环路内添加预定数量的种子细胞悬液；所述的第二通道转换器 (5 )用于向循环灌注接种环路内注入或更换细胞培养液，或取样检测。
6.如权利要求4所述的配套循环灌注接种环路，其特征在于，所述的蠕动泵(1)为防水型蠕动泵。
7.如权利要求4所述的配套循环灌注接种环路，其特征在于，所述的连接管(7)为透气性管。
全文摘要
本发明公开了一种用于临床的活化人工骨体外快速构建方法及循环灌注接种环路，由灌流室、通道转换器和连接管组成了单个循环灌注接种环路结构，将待活化的人工骨材料预先装入循环灌注接种环路的灌流室内，将单个或多个循环灌注接种环路与一台蠕动泵相连接；通过灌注式动态循环细胞接种方法，接种细胞密度、数量，灌注接种速率、方式(单向循环、双向往复)等均精确可控，因此可显著提高种子细胞接种效率和支架材料内细胞分布均匀度，缩短了构建时间，增强了构建效果，较传统静态接种方法大大节省了种子细胞数量，利于临床使用。
文档编号A61F2/28GK102389342SQ201110188289
公开日2012年3月28日 申请日期2011年7月6日 优先权日2011年7月6日
发明者张扬, 王林, 王臻, 胡蕴玉, 裴国献, 雷伟, 马真胜 申请人:中国人民解放军第四军医大学