专利名称：老年斑磁共振纳米诊断试剂及其优化方法
技术领域：
本发明属于医学及诊断试剂领域，具体涉老年斑磁共振诊断试剂。
背景技术：
长期以来，生物医学中阿尔茨海默病(Alzheimer Disease,AD)的诊断只有依靠病理活检或尸检来确诊，但病理学活检接受度不高，而利用脑脊液标志物来进行实验室诊断， 则面临诊断准确性以及难以量化评估AD的严重程度等问题。如何在AD发病的早期利用非创伤性方法来定性又定量的诊断AD，一直是广大神经病学专家和研究者试图解决的难题， 现代分子影像学的飞速发展为早期诊断AD带来可能，利用磁性纳米颗粒特异性对老年斑进行活体磁共振显像，是分子影像学与纳米技术交叉整合的热点和难点。将磁性纳米铁颗粒进行表面修饰，连接生物肽段(Αβ4(ι肽段)特异性能与老年斑相结合的特性达到其靶向性作用，再连接生物肽段(HIV-ITat肽段)使之能够通过血脑屏障，此部分已经通过我们前期863工作完成。然而A β 4(|肽段毕竟是老年斑的主要成分，具有一定的毒性作用，同时其由40个氨基酸残基组成，其免疫原性相对较大，同时空间结构上也会相对较大，不利于其通过血脑屏障。有研究表明，Αβ4(ι肽段的不同区域，其功能不同，其中Αβ25_Μ是Αβ4(ι肽段的主要毒性部分，而A β 16_20则是A β 4(|肽段的主要结合部位，故，如果可以选择A β 16_20代替A β 4(|肽段来与老年斑结合，不仅能避开毒性部分，还能降低免疫原性及空间体积，同时Αβ 16_2(|合成费用更低，还能降低磁共振纳米诊断试剂的整体成本。
发明内容
本发明的任务是提供一种老年斑磁共振纳米诊断试剂，使其对AD老年斑具有特异靶向性，与现有的AD诊断方法相比具有安全无创性和能即时成像等特点，同时与前期同类产品相比还具有提高结合能力、降低毒性及降低整体合成成本等优点。实现本发明的技术方案是本发明提供的这种老年斑磁共振纳米诊断试剂，是结合有人体免疫缺陷病毒 (HIV-I)的转录活化因子肽段(简称为HIV-1 Tat肽段)和Aβ 肽段的超顺磁性纳米氧化铁颗粒(USPIO)，简称为=Tat-USPIO-Aβ 16_2(1。将该结合有人体免疫缺陷病毒 (HIV-I)的转录活化因子肽段(HIV-1 Tat肽段)和A β 16_2(|肽段的超顺磁性纳米氧化铁颗粒(USPIO)用生理可接受的稀释剂稀释，即可作为老年斑磁共振诊断试剂使用，所述的稀释剂可以是PBS缓冲液或生理盐水。用稀释剂稀释后，以铁元素含量计量该诊断试剂中 Tat-USPIO-Aβ 16_20的浓度，其铁元素含量为0. 01-20摩尔/升。该老年斑磁共振纳米诊断试剂中所用的超顺磁性纳米氧化铁颗粒的粒径大小为 6-10纳米。本发明提供这种老年斑磁共振纳米诊断试剂，是按以下方法制得步骤一、在超顺磁性纳米氧化铁颗粒表面连上氨基官能团，得到表面官能化的超顺磁性纳米氧化铁颗粒；超顺磁性纳米氧化铁颗粒可以按照名称为“一种制备超小型超顺磁性磁共振对比剂的方法”，专利申请号为200410012883. 4、公开号为1562376 (
公开日为2005-01-12)的中国专利申请公开的技术方案制备得到，按此得到USPIO后，加入絮凝剂(如乙醇、甲醇、丙醇、丁醇等)，使之絮凝，用离心机在8000-9000转/分离心10-20分钟，然后弃去上清液， 将下部沉淀物均勻地溶解于蒸馏水中，取2-4份(本专利申请中所述物质的用量份为这些物质的用量比例，液体为体积份，固体为质量份，下同)该溶液与10-15份含1-3份NaBH4 的NaOH溶液(NaOH浓度为1. 8-2mol/L)在室温下混合均勻后，在惰性气体(如氮气、氩气等)环境下升温至60-70°C，边搅拌边加入3-5体积份表氯醇，放置10-12小时后，加入絮凝剂，5000-7000转/分离心3-5分钟，重新均勻地溶解于蒸馏水中，重复上述加入絮凝剂后离心再溶解的过程三至五次后，重新均勻地溶解于蒸馏水中，在50-60°C惰性气体环境保护下，加入5-10份乙二胺，放置10-12小时后，加入絮凝剂，5000-7000转/分离心3-5分钟，重新均勻地溶解于蒸馏水中，重复上述加入絮凝剂后离心再溶解的过程三至五次后，再均勻地溶解于PH值为7. 4-8的磷酸缓冲溶液(PBS)中，得到表面官能化的USPIO ；步骤二、将5-10重量份的3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP) 溶于1-2体积份的二甲基亚砜中，得交联剂溶液，再将该交联剂溶液与浓度为0. 1-0. 2mol/ L、PH = γ. 4-8的磷酸盐缓冲溶液，(如PBS溶液、D-Hanks溶液等)混合，得到交联剂溶液与磷酸盐缓冲溶液的混合液，交联剂溶液与磷酸盐缓冲溶液的体积用量比为1 1-2;步骤三、将表面官能化的超顺磁性纳米氧化铁颗粒加入到步骤二得到的混合液中，表面官能化的超顺磁性纳米氧化铁颗粒与该混合液的重量/体积用量比为3-5 2-3， 在室温下放置60 120分钟，置于超滤管中，6000-8000转/分离心50-60分钟，过滤去除杂质和未反应的交联剂溶液，得到经交联溶液处理过的表面官能化的超顺磁性纳米氧化铁颗粒(USPIO)磷酸盐溶液；步骤四、取经交联溶液处理过的表面官能化的超顺磁性纳米氧化铁颗粒(USPIO) 溶液3-5体积份，向其中加入1-2体积份的浓度为0. 02mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 溶液和1-2体积份的浓度为0. 2mol/L的3- 二甲胺基丙基碳二亚胺(EDC)溶液，于37°C下放置30-90分钟，然后再加入3-5重量份的人体免疫缺陷病毒HIV-I的转录活化因子肽段 (HIV-1 Tat肽段)和3-5重量的份A β 肽段，混合后室温下放置10-12小时；置于超滤管中，6000-8000转/分离心40-60分钟，过滤去除杂质和未反应的溶液，得到结合有人体免疫缺陷病毒(HIV-I)的转录活化因子肽段(简称HIV-1 Tat肽段)和A β 16_2(|肽段的超顺磁性纳米氧化铁颗粒，即老年斑磁共振纳米诊断试剂。上述步骤一所述的在超顺磁性纳米氧化铁颗粒表面连上氨基官能团，得到表面官能化的超顺磁性纳米氧化铁颗粒的具体方法是超顺磁性纳米氧化铁颗粒加入絮凝剂，于 8000-9000转/分离心10-20分钟，弃上清，下部沉淀物均勻溶解于蒸馏水中，取2_4体积份的该溶液与10-15体积份的NaBH4的NaOH溶液中，室温下均勻混合，于惰性气体环境下升温至60-70°C，边搅拌边加入3-5体积份的表氯醇，反应10-12小时后停止反应；加入絮凝剂，5000-8000转/分离心3-5分钟，均勻溶解于蒸馏水中，重复以上加入絮凝剂、离心、溶解于蒸馏水的操作三至五次；然后，于50-60°C惰性气体环境下，加入5-10体积份乙二胺，反应10-12小时后停止反应，加入絮凝剂，5000-7000转/分离心3_5分钟，均勻溶解于蒸馏水中，重复以上加入絮凝剂、离心、溶解于蒸馏水的操作三至五次，得到表面官能化的USPI0， 该USPIO可均勻溶解于PH值为7. 4-8的磷酸缓冲溶液(PBS)中保存，其中所述的NaBH4的 NaOH溶液的配制方法是将1-3重量份的NaBH4溶于浓度为1. 8-2mol/L的NaOH溶液；所述的絮凝剂是乙醇、甲醇、丙醇、或丁醇；所述的惰性气体为氮气或氩气。上述方法中所述的超顺磁性氧化铁纳米粒可以是超顺磁性三氧化二铁纳米粒或超顺磁性四氧化三铁纳米粒。超顺磁性纳米氧化铁颗粒的具体制备方法，可参见专利申请号为2004100U883. 4，名称为“一种制备超小型超顺磁性磁共振对比剂的方法”的中国专利申请文件。上述方法中所述的人免疫缺陷病毒HIV-I的转录活化因子肽段——HIV-I Tat肽段，可来源于多肽合成，其氨基酸序列为GRKKRRQRRRPPQ，[参见1. Dennison SR, Baker RD, Nicholl ID, Phoenix DA. Interactions of cell penetrating peptide Tat with model membranes :a biophysical study Biochem Biophys Res Commun. 2007 Nov 9 ； 363(1) :178-82. Epub 2007 Sep 4 (PMID :17854767) ；2. Futaki S. Membrane-permeable arginine-rich peptides and the translocation mechanisms Adv Drug Deliv Rev. 2005 Feb28 ；57 (4) :547-58. Epub 2004Dec 16 (PMID : 15722163)]；所述的 A β 16_2。肽段，可来源于多肽合成，氨基酸序列为KLVFF。本发明的主要特点为采用了小分子的Αβ 16_2(|来作为识别AD老年斑的特异性探针，与现有的AD诊断方法相比又具有安全无创性，同时又能应用于磁共振活体成像。与前期的Αβ整片段作靶向物质的方案相比还具有低毒性、低免疫原性、低空间体积以及低成本的优点。
图1为按照实施例1、2方法制备的USPIO的透射电子显微镜图，纳米氧化铁粒子均勻分散于基底中，总体来看其大小在7nm以下，呈球形。图2为按照实施例2、4方法制备的官能化的USPIO样品的水化半径分布图官能化的USPIO样品，其水化半径主要分布在50nm左右。图3为按照实施例3、6方法制备的官能化的USPIO样品的电荷分布图。这种官能化的USPIO样品其表面带有负电荷，电荷大小为-8. 003mV。图4为按照实施例4、9方法制备的官能化的USPIO样品在进行弛豫性能检测时的磁共振仪屏幕截图。截图中，样品按照铁浓度(mmol/L)依次排列，从下至上，样品中铁浓度依次递增。图5为按照实施例4、9方法制备的官能化的USPIO样品其弛豫时间倒数(1/T2) 与样品中铁浓度(mmol/L)之间的曲线图。横坐标为样品中铁浓度(mmol/L)，纵坐标为样品的T2弛豫时间的倒数(1/T2)。通过对该曲线的线性拟合计算可以得到样品的R2值为 140(mM-lsec-1)。图6为按照实施例4、9方法制备Tat-USPIO-Aβ 16_2Q的园二色谱对照。图7Tat-USPIO_Ai3 与神经干细胞孵育后铁染色验证细胞内可见蓝色铁颗粒 (A =Perl' s染色)与棕褐色铁颗粒(B :DAB复染)，如箭头所示，细胞胞体内存在均勻分布的Tat-USPIO-Aβ 16_2Q，其中的铁元素使细胞染色呈蓝色(左图)和棕褐色(右图)。
图STat-USPIO-Aβ 16_2Q与神经干细胞孵育后体外磁共振检测验证其弛豫性(A， B)，透射电镜证实细胞质内散在分布铁颗粒(C，D):神经干细胞与Tat-USPI0-Ai^6_2Q 孵育后1. 5TMRI成像结果(EP管1、2、3、4分别对应培养基，Tat-USPIO-A β 16_2(1，与 Tat-USPIO-A β 16_20共孵育后的神经干细胞，单纯的神经干细胞)，从上述四个样品的MR图像上可以清楚看到，第3管的T2信号强度介于第2管和第4管之间，即与Tat-USPIO-A β 16_20 共孵育过的细胞的T2信号强度介于单纯的Tat-USPIO-A β 16_2(1与单纯的神经干细胞之间。图96 月龄阳性鼠在尾静脉注射 Tat PTD-USPIO-A β 16_2Q-HiLyte Fluor 555(0. 01-20M)后24h脑部所成的MRI像，可见皮层及海马区有散在分布的小点状低T2信号区。图10为图9的脑区局部放大图，箭头所示位置即为散在分布于皮层及海马区的小点状低T2信号区的代表。图11 为上述注射过 iTat PTD-USPIO-A β 16_2Q-HiLyte Fluor 555 的老鼠作脑组织切片后在荧光显微镜下观察，发红色荧光的箭头所指处为Tat PTD-USPI0-A β 16_20-HiLyte Fluor 555聚集的部位。图12 为上述注射过 Tat PTD-USPIO-A β 16_2Q-HiLyte Fluor 555 的老鼠作脑组织切片并进行老年斑硫磺素染色后在荧光显微镜下观察，发绿色荧光的箭头所指处为老年斑所在部位。图9-12综合说明磁共振成像与组织学切片中本发明中的诊断试剂所在的位置以及老年斑病灶均吻合良好。
具体实施例方式实施例1向超顺磁性纳米铁颗粒中加入无水乙醇直至有黑色絮凝出现为止，通过8000转/ 分的速度离心10分钟，弃去上清液，收集下部黑色沉淀均勻溶解于60ml的蒸馏水中。取该溶液20ml，在室温下加入IOml含0. Ig NaBH4的NaOH溶液(NaOH溶液浓度为2mol/L)，混合均勻后，再于惰性气体环境下升温至60°C，磁力搅拌速度200转/分下，注入3ml表氯醇，反应10小时后停止反应，加入无水乙醇直至有黑色絮凝出现为止，通过8000转/分的速度离心，弃去上清液，收集下部黑色沉淀溶于50ml的蒸馏水中，然后在50°C的惰性气体环境下， 向其中加入5ml乙二胺，反应10小时后停止反应，加入无水乙醇直至有黑色絮凝出现为止， 通过8000转/分的速度离心，弃去上清液，收集下部黑色沉淀(即表面官能化的USPI0)溶于PH值为7. 4的磷酸缓冲液(PBS溶液)中。将IOOuL浓度为0. 02mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺(MB)溶液与IOOuL浓度为 0. 2mol/L的3-二甲胺基丙基碳二亚胺(EDC)溶液混合，然后向其中加入0. Iml表面官能化的USPIO溶液，37°C下放置30mins ；再向其中加入Img的SPDPjP 0. 128ml 二甲基亚砜，然后再加入0. Iml的HIV-I Tat溶液和0. Iml的A β 16_20肽段溶液，混合后在室温下放置反应 10小时；然后置于规格为0. 5ml、100k的超滤管中，在离心机上离心，离心机的转速为6000 转/分，离心时间为50mins，过滤去除杂质和未反应的溶液，得到结合有人体免疫缺陷病毒 (HIV-I)的转录活化因子肽段(简称HIV-1 Tat肽段)和A β 16_2(|肽段的超顺磁性纳米氧化铁颗粒老年斑磁共振纳米诊断试剂，于4°C下保存。实施例2
向超顺磁性纳米铁颗粒中加入无水乙醇直至有黑色絮凝出现为止，通过8000转/ 分的速度离心10分钟，弃去上清液，收集下部黑色沉淀超声溶于60ml的蒸馏水中。取该溶液25ml，在室温下加入15ml含0. Ig NaBH4的NaOH溶液(NaOH溶液浓度为2mol/L)，混合均勻后，再于惰性气体环境下升温至60°C，磁力搅拌速度300转/分下，注入細1表氯醇，反应11小时后停止反应，加入无水乙醇直至有黑色絮凝出现为止，通过8000转/分的速度离心，弃去上清液，收集下部黑色沉淀溶于50ml的蒸馏水中，然后在50°C的惰性气体环境下， 向其中加入8ml乙二胺，反应11小时后停止反应，加入无水乙醇直至有黑色絮凝出现为止， 通过8000转/分的速度离心，弃去上清液，收集下部黑色沉淀(即表面官能化的USPI0)溶于PH值为7. 8的磷酸缓冲液(PBS溶液)中。将150uL浓度为0. 02mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液与150uL浓度为 0. 2mol/L的3-二甲胺基丙基碳二亚胺(EDC)溶液混合，然后向其中加入0. 2ml表面官能化的USPIO溶液，37°C下放置50mins ；再向其中加入Img的SPDP、和0. 二甲基亚砜，然后再加入0. 2ml的HIV-I Tat溶液和0. 2ml的A β 16_2(1-HiLyte Fluor 555肽段溶液，混合后在室温下放置反应11小时，然后置于规格为0. 5ml、100k的超滤管中，在离心机上离心，离心机的转速为7000转/分，离心时间为40mins，过滤去除杂质和未反应的溶液，得到结合有人体免疫缺陷病毒(HIV-I)的转录活化因子肽段(简称HIV-1 Tat肽段)和A β 16_2(1-HiLyte Fluor 555肽段的超顺磁性纳米氧化铁颗粒老年斑磁共振纳米诊断试剂，于4°C下保存。实施例3向超顺磁性纳米铁颗粒中加入无水乙醇直至有黑色絮凝出现为止，通过8000转/ 分的速度离心10分钟，弃去上清液，收集下部黑色沉淀溶于60ml的蒸馏水中。取该溶液 30ml，在室温下加入20ml含0. Ig NaBH4的NaOH溶液(NaOH溶液浓度为2mol/L)，混合均勻后，再于惰性气体环境下升温至60°C，磁力搅拌速度400转/分下，注入5ml表氯醇，反应 12小时后停止反应，加入无水乙醇直至有黑色絮凝出现为止，通过8000转/分的速度离心， 弃去上清液，收集下部黑色沉淀溶于50ml的蒸馏水中，然后在50°C的惰性气体环境下，向其中加入IOml乙二胺，反应12小时后停止反应，加入无水乙醇直至有黑色絮凝出现为止， 通过8000转/分的速度离心，弃去上清液，收集下部黑色沉淀(即表面官能化的USPI0)溶于PH值为7. 4的磷酸缓冲液(PBS溶液)中。将200uL浓度为0. 02mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺(MB)溶液与200uL浓度为 0. 2mol/L的3-二甲胺基丙基碳二亚胺(EDC)溶液混合，然后向其中加入0. 3ml表面官能化的USPIO溶液，37°C下放置60mins ；再向其中加入Img的SPDP、和0. 128ml 二甲基亚砜，然后再加入0. 3ml的HIV-I Tat (FITC)溶液和0. 3ml的A β 16_20肽段溶液，混合后在室温下放置反应12小时；然后置于规格为0. 5ml、100k的超滤管中，在离心机上离心，离心机的转速为8000转/分，离心时间为30mins，过滤去除杂质和未反应的溶液，得到结合有人体免疫缺陷病毒(HIV-I)的转录活化因子肽段(简称HIV-1 Tat肽段)和A β 16_2(|肽段的超顺磁性纳米氧化铁颗粒老年斑磁共振纳米诊断试剂，于4°C下保存。实施例4向超顺磁性纳米铁颗粒中加入无水乙醇直至有黑色絮凝出现为止，通过8000转/ 分的速度离心10分钟，弃去上清液，收集下部黑色沉淀溶于60ml的蒸馏水中。取该溶液 30ml，在室温下加入IOml含0. Ig NaBH4的NaOH溶液(NaOH溶液浓度为2mol/L)，混合均勻后，再于惰性气体环境下升温至60°C，磁力搅拌速度500转/分下，注入5ml表氯醇，反应 12小时后停止反应，加入无水乙醇直至有黑色絮凝出现为止，通过8000转/分的速度离心， 弃去上清液，收集下部黑色沉淀溶于50ml的蒸馏水中，然后在50°C的惰性气体环境下，向其中加入IOml乙二胺，反应12小时后停止反应，加入无水乙醇直至有黑色絮凝出现为止， 通过8000转/分的速度离心，弃去上清液，收集下部黑色沉淀(即表面官能化的USPI0)溶于PH值为7. 4的磷酸缓冲液(PBS溶液)中。将IOOuL浓度为0. 02mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺(MB)溶液与150uL浓度为 0. 2mol/L的3-二甲胺基丙基碳二亚胺(EDC)溶液混合，然后向其中加入0. Iml表面官能化的USPIO溶液，37°C下放置30mins ；再向其中加入Img的SPDPjP 0. 128ml 二甲基亚砜，然后再加入0. 15ml的HIV-I Tat (FITC)溶液和0. 15ml的A β 16_20肽段溶液，混合后在室温下放置反应12小时；然后置于规格为0. 5ml、100k的超滤管中，在离心机上离心，离心机的转速为6000转/分，离心时间为60mins，过滤去除杂质和未反应的溶液，得到结合有人体免疫缺陷病毒(HIV-I)的转录活化因子肽段(简称HIV-1 Tat肽段)和A β 16_2(|肽段的超顺磁性纳米氧化铁颗粒老年斑磁共振纳米诊断试剂，于4°C下保存。实施例5-14 其成分及配比见下表，其制备过程同实例1-4
权利要求
1.一种老年斑磁共振纳米诊断试剂，其特征在于，它是结合有人体免疫缺陷病毒 (HIV-I)的转录活化因子肽段(简称HIV-1 Tat肽段)和A β 16_2(|肽段的超顺磁性纳米氧化铁颗粒(USPIO)(简称为=Tat-USPIO-A^ 16_20)。
2.根据权利要求1所述的老年斑磁共振纳米诊断试剂，其特征在于含有生理可接受的稀释剂。
3.根据权利要求2所述的老年斑磁共振纳米诊断试剂，其特征在于所述的稀释剂可以是PBS缓冲液或生理盐水。
4.根据权利要求2或3所述的老年斑磁共振纳米诊断试剂，其特征在于，以铁元素含量计量该诊断试剂中Tat-USPI0-Ai^6_2(1的浓度为其铁元素含量为0. 01-20摩尔/升。
5.据权利要求1所述的老年斑磁共振纳米诊断试剂，其特征在于，所用的超顺磁性纳米氧化铁颗粒的粒径大小为6-10纳米。
6.结合有人体免疫缺陷病毒(HIV-I)的转录活化因子肽段(HIV-1Tat肽段)和 A β 16_20肽段的超顺磁性纳米氧化铁颗粒在制备老年斑磁共振纳米诊断试剂中的应用。
7.—种老年斑磁共振纳米诊断试剂的制备方法，包括以下步骤步骤一、在超顺磁性纳米氧化铁颗粒表面连上氨基官能团，得到表面官能化的超顺磁性纳米氧化铁颗粒；步骤二、将5-10重量份的3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)溶于 1-2体积份的二甲基亚砜中，得交联剂溶液，再将该交联剂溶液与浓度为0. 1-0. 2mol/L、PH =7. 4-8的磷酸盐缓冲溶液(如PBS溶液、D-Hanks溶液等)混合，得到交联剂溶液与磷酸盐溶液的混合液，交联剂溶液与磷酸盐溶液的体积用量比为1 1-2;步骤三、将表面官能化的超顺磁性纳米氧化铁颗粒加入到步骤二得到的混合液中，表面官能化的超顺磁性纳米氧化铁颗粒与该混合液的重量/体积用量比为3-5 2-3，在室温下放置60 120分钟，置于超滤管中，6000-8000转/分离心50-60分钟，过滤去除杂质和未反应的交联剂溶液，得到经交联溶液处理过的表面官能化的超顺磁性纳米氧化铁颗粒 (USPIO)磷酸盐溶液；步骤四、取经交联溶液处理过的表面官能化的超顺磁性纳米氧化铁颗粒(USPIO)溶液 3-5体积份，向其中加入1-2体积份的浓度为0. 02mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺(MB)溶液和1-2体积份的浓度为0. 2mol/L的3- 二甲胺基丙基碳二亚胺(EDC)溶液，于37°C下放置 30-90分钟，然后再加入3-5重量份的人体免疫缺陷病毒HIV-I的转录活化因子肽段(HIV-1 Tat肽段)和3-5重量的份Αβ 16_2(|肽段，混合后室温下放置10-12小时；置于超滤管中， 6000-8000转/分离心40-60分钟，过滤去除杂质和未反应的溶液，得到结合有人体免疫缺陷病毒(HIV-I)的转录活化因子肽段(简称HIV-1 Tat肽段)和A β 16_2(|肽段的超顺磁性纳米氧化铁颗粒，即老年斑磁共振纳米诊断试剂。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤一所述的在超顺磁性纳米氧化铁颗粒表面连上氨基官能团，得到表面官能化的超顺磁性纳米氧化铁颗粒的具体方法是: 超顺磁性纳米氧化铁颗粒加入絮凝剂，于8000-9000转/分离心10-20分钟，弃上清，下部沉淀物均勻溶解于蒸馏水中；取2-4份体积份的该溶液与10-15体积份的NaBH4的NaOH溶液中，室温下均勻混合，于惰性气体环境下升温至60-70°C，边搅拌边加入3-5体积份的表氯醇，反应10-12小时后停止反应；加入絮凝剂，5000-7000转/分离心3_5分钟，均勻溶解于蒸馏水中，重复以上加入絮凝剂、离心、溶解于蒸馏水的操作三至五次；然后，于50-60°C 惰性气体环境下，加入5-10体积份乙二胺，反应10-12小时后停止反应，加入絮凝剂， 5000-7000转/分离心3-5分钟，均勻溶解于蒸馏水中，重复以上加入絮凝剂、离心、溶解于蒸馏水的操作三至五次，得到表面官能化的USPI0，均勻溶解于PH值为7. 4-8的磷酸缓冲溶液(PBS)中保存，其中所述的NaBH4的NaOH溶液的配制方法是将1_3重量份的NaBH4溶于浓度为1. 8-2mol/L的NaOH溶液。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的絮凝剂是乙醇、甲醇、丙醇、或丁醇；所述的惰性气体为氮气或氩气。
10.根据权利要求9所述的结合有人体免疫缺陷病毒HIV-I的转录活化因子肽段 (HIV-ITat肽段)和Αβ 肽段的超顺磁性纳米氧化铁颗粒在制备老年斑磁共振纳米诊断试剂中的应用，其特征在于，所述的结合有人体免疫缺陷病毒HIV-I的转录活化因子肽段 (HIV-ITat肽段)和A β 16_20肽段的超顺磁性纳米氧化铁颗粒按权利要求7、8或9所述的方法制得。
全文摘要
一种特异性活体标记老年斑的体内磁共振纳米诊断试剂的优化方法，属于生物诊断试剂的开发领域。该方法制得的磁共振纳米诊断试剂可以顺利地通过血脑屏障，既能与脑内老年斑特异性结合，又具有超顺磁性，可以进行核磁共振老年斑特异性成像，同时还具有低毒性、低免疫原性、低空间体积以及低成本等优点。可以作为生物医学上的阿尔茨海默病磁共振分子影像学成像上的磁共振对比剂来应用。
文档编号A61K49/18GK102284068SQ201110231428
公开日2011年12月21日 申请日期2011年8月11日 优先权日2011年8月11日
发明者刘祖黎, 吴军, 夏星, 张旻, 张苏明, 李慧, 李震, 杜桂焕, 杨华静, 湛彦强, 熊永洁, 王东, 褚倩, 闵喆, 马铭 申请人:华中科技大学同济医学院附属同济医院