专利名称：敬钊毒素-v在制备抗认知、学习记忆功能障碍药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及多肽物质在药品制备中的用途，特别涉及一种敬钊缨毛蛛毒素-敬钊毒素-V在制备抗认知、学习记忆功能障碍药物中的应用。
背景技术：
中国专利，ZL200610031864. 5申请公开了从蜘蛛敬钊缨毛蜘蛛(Chilobrachys jingzhao)粗毒中纯化得到的一种新型肽类神经毒素，即敬钊毒素-V(JZ-V)。 JZ-V由四个氨基酸残基组成，分子中6个半胱氨酸形成3对二硫键，一级结构为 YCQKWMWTCDSKRACCEGLRCKLWCRKII。CN101^8138A号专利公开了 JZ-V在制备镇痛药物中的应用；CN101543624A号专利公开了 JZ-V在制备戒毒药物中的应用。至今未见敬钊毒素-V 在制备抗认知、学习记忆功能障碍药物中的应用的相关报道。
发明内容
本发明实施例的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供一种敬钊毒素-V在制备抗认知、学习记忆功能障碍药物中的应用。为了实现上述目的本发明采取的技术方案是本发明的一个方面，涉及JZ-V提高哺乳动物神经突触可塑性的用途。具体是指 JZ-V可显著提高高频刺激HFS (High frequency stimulation)所诱导的海马长时程增强效应(long-term potentiation，LTP)，增强 LTP 的诱导相。本发明中，HFS(100HZ，10 串，5 组波宽为0.2ms的方波刺激)很接近动物海马θ节律自发活动的方式，能有效诱导海马齿状回LTP的形成。增强LTP的诱导相是指在HFS施与之前20分钟予以JZ-V，可大大增强群峰电位(population spike,PS)的幅度，并维持至少1. 5小时。JZ-V通过增强LTP的诱导相， 可显著改善哺乳动物认知功能障碍和学习记忆功能障碍，提高痴呆模型动物的空间学习记忆能力和被动回避能力等学习记忆能力。避暗实验的结果证明JZ-V可显著延长痴呆动物错误潜伏期，减少错误次数；在Morriss水迷宫试验中，结果表明JZ-V可缩短痴呆动物寻找到安全岛的游泳时间和游泳路程，在定位航行测试结束后，撤除平台进行空间探索实验中， JZ-V可明显改善痴呆动物对平台的空间记忆，在原安全岛所在象限游泳的路程比率和时间明显升高。本发明的一个方面，涉及JZ-V在制备预防、缓解和/或治疗阿尔茨海默氏病或症状以及能引发认知功能障碍和/或学习记忆功能障碍的疾病的药物中的应用。本发明中，所述预防、缓解和/或治疗中的预防是指在出现阿尔茨海默氏病之前， 抑制认知功能和学习记忆障碍病症的发生；所述缓解是指在出现阿尔茨海默氏病发病过程中改善认知功能和学习记忆障碍；所述治疗是指在出现阿尔茨海默氏病之后或发病过程中，实现临床意义上的改善认知功能和学习记忆功能障碍。更具体的，本发明所述预防、缓解和/或治疗阿尔茨海默氏病或症状是预防、缓解和/或治疗针对疾病导致的认知功能和学习记忆障碍。本发明的另一方面，涉及一种用于预防、缓解和/或治疗能引发认知功能障碍和/ 或学习记忆功能障碍的疾病，如阿尔茨海默氏病或症状的药物组合物，所述药物含有预防或治疗有效量的JZ-V以及适量任选的药学可接受的载体和/或辅料。在本发明中，根据施用途径，所述药物的剂型选自溶液剂、悬液剂、乳剂、丸剂、胶囊剂、粉末剂、控制释放剂或持续释放制剂。这些制剂将含有预防或治疗有效量的JZ-V，优选为纯化形式的JZ-ν，也可以是其药学可接受的盐，以及制备这些制剂所需适量的药学可接受的载体和/或辅料。剂型的选择应当适合于对患者给药的形式。本发明的JZ-V药物可以通过任何常规方法用一种或多种药学可接受的载体和/ 或赋形剂来配制成各种剂型，使之适用于对受试者施用的几种途径，其中包括但不限于胃肠外、经口、局部、皮内、肌肉内、皮下、鼻内、中枢或外周神经直接给予途径。因此，本发明所用的JZ-V或其药学可接受的盐可以特别配制为例如吸入或吹入 (通过口和鼻)或经口含化、胃肠外或直肠给药、局部椎管给药的剂型。JZ-V可采用带电荷的、中性和/或其他药学可接受的盐的形式，包括盐酸盐，枸橼酸盐，柠檬酸盐等一切药学可接受的盐的形式。药学可接受的载体例子包括但不限于“Remington，s Pharmaceutical Sciences (A. R. Gennaro Ed.), 20th edition, Williams & Wilkins PA，USA OOOO) ” 中所述的内容。本发明中所用的JZ-V为白色粉末状产品，可通过已知方法制备得到。已知方法制备参考以下文献1.曾雄智，邓梅春，孙正华，王贤纯，梁宋平.敬钊毒素-V的合成、复性及其钾通道活性鉴定，中国生物化学与分子生物学报，2008，M (5) =463-468 ；2.肖玉成，梁宋平.海南捕鸟蛛毒素-V分离纯化及其抑制河豚毒敏感型钠通道活性研究.动物学研究，2002，23 (3) :200-205。本发明的化学法制备的敬钊缨毛蜘蛛毒素提取物-JZ-V在改善学习记忆的行为学和提高神经可塑性作用的药物中的应用，特别是在制备改善认知功能和/或学习记忆功能的药物和/或药物组合物中的应用，使该药物和/或药物组合物可用于预防、缓解和/或治疗能引发认知功能和/或学习记忆功能障碍如阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease, AD)等疾病或症状。JZ-V能显著提高大鼠海马突触传递效应，使其突触传递通路LTP的诱导呈显著性增强。在被动回避能力行为学试验中，JZ-V可显著延长痴呆动物错误潜伏期，减少错误次数。在Morriss水迷宫试验中，JZ-V可显著缩短痴呆动物寻找到安全岛的游泳时间和游泳路程，在定位航行测试结束后，撤除平台进行空间探索实验，JZ-V可明显改善痴呆动物对平台的空间记忆，在原安全岛所在象限游泳的路程比率和时间较Αβ 1-42模型组明显升高。 临床一线痴呆治疗药物多奈哌齐在本实验中为阳性对照药，研究结果显示JZ-V对于学习记忆障碍的治疗效果的多项指标优于或与多奈哌齐相齐平。
图1为诱发电位的指标测定图；图2小鼠Morris水迷宫装置示意图3aJZ-V10nmOl Γ1)对基础突触传递的影响图；图!BbJZ-VIOOnmol L—1)对基础突触传递的影响图；图4a为JZ-V IOnmol L-1对LTP诱导相的作用图；图4b为JZ-V IOOnmol L—1对LTP诱导相的作用图；图如为图如和图4b的合并比较图示。
具体实施例方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。实施例1JZ-V提高LTP诱导形成的作用1.实验材料实验动物SD雄性大鼠，250士20g，由中国药品生物制品检定所提供，质量合格证 SCXK(京)2010-008。手术前将动物饲养于SPF级动物房，自然采光，室温22士2°C，自由摄食饮水，适应环境7天后进行手术。实验大鼠分成三组对照组，JZ-V IOnmol I^+HFS组和 JZ-V IOOnmol L_1+HFS 组，每组 6 只。实验仪器=VC-Il记忆示波器(Nihon Koden,日本)；SEN-7203三道电子刺激器(Nihon Koden,日本)；SS-202J刺激隔离器(Nihon Koden,日本)；SR-6N立体定位仪 (Narishige,日本)2.实验方法2. 1电极的埋植将SD大鼠手术前称重，体重200 士 20g。以腹腔注射20%乌拉坦麻醉(1. Og/kg)，固定于SR-6N立体定位仪上使头颅保持水平，用75%酒精消毒皮肤，剪去耳后及头顶部毛后，沿颅骨正中线纵向切开皮肤，用脱脂棉推开皮下组织并用3% H2O2清除骨膜，充分暴露颅骨，使骨缝清晰。参照George I^axinos，ChariesWatson大鼠脑立体定位图谱[92]，使用SR-6N立体定位仪定坐标为前囟后0. 8mm，矢状缝旁1. 8mm，硬脑膜下3. 5mm, 以骨钻打开颅骨，将脱脂棉清除骨屑后以针头小心挑破硬脑膜。以此为脑室给药进针位点。 以同样的方法埋植刺激电极和记录电极。刺激电极定位坐标为AP 7. 5-7. 8，L 4. 4-4. 6，H 3. 5-4. O ；记录电极坐标为=AP 3. 7-4. 0，L 2. 4-2. 7，H 3. 0-3. 5。根据已定位坐标的位置， 先将给药篓管及记录电极放入所在脑区，然后以固定的强度进行刺激(SEN-7203三道电子刺激器，SS-202J刺激隔离器)，记录诱导出的群峰电位，慢慢调整刺激电极和记录电极的位置，直到诱导出最大群峰电位。然后给予不同强度的电刺激，记录诱发的动作电位，得到输入输出曲线。以引起最大兴奋性突触后电位的1/2-1/3的刺激电流强度作为检测刺激强度，之后将刺激电极固定。2. 2诱发电位的记录和幅值的计算方法诱发电位的记录实验中计算出的PS幅度作为DG颗粒细胞群兴奋性的指标。记录PS是采用细胞外记录法。测试刺激频率为l/30HZ(SEN-7203三道电子刺激器，SS-202J 刺激隔离器)，采用引起最大PS幅度所需刺激强度的1/2-1/3的电流强度作为测试刺激强度，整个实验过程中测试刺激强度参数恒定不变。记录信号经多道生理信号采集处理系统进行采集、放大，并在多媒体计算机中显示和储存。
参见图1，其中，a =PS的起始点(第一个正相峰的端点)，b =PS的点(第二个正相峰的端点)c :PS, d 经过c点的垂线与ab点连线的交点。dc =PS峰的幅度。PS幅度计算方法实验中以PS幅度相对值(％ )为观测指标，观察其给药后的增幅情况。其测定方法是，以HSF前30min的测定作为基线的测定，各测6个时间点(每隔 5min测一个时间点)，计算6个时间点幅度值PS幅度的平均值。将给药前30min所记录的 6个时间点PS幅度值的平均值作为自身基础突触传递水平(自身基础幅值)，并以此PS均值为100%。用给药后所测各时间点的PS幅度值除以基线的6个时间点的PS平均值，得到各时间点的PS幅度相对值。高频刺激参数诱发LTP的高频刺激为100HZ，由10串高频电刺激所诱导，每串刺激由5个刺激方波组成，波宽为0. 1ms，每串刺激间隔为200ms。刺激强度与测试刺激相同。如果PS幅度较自身对照值增加20%以上并且持续时间超过60min，则表示LTP现象已形成。2. 3电生理实验给药方法与剂量JZ-V用生理盐水配制，通过埋植在侧脑室的导管进行给药。将连接微量注射器的细塑料管导入篓管，稳定一段时间后，再记录PS 30min, 代表给药前的基础传递突触水平。将5μ 1药物或溶剂于5min内缓慢注入侧脑室，对照组注入 5 μ 1 生理盐水，JZ-V IOnmol Ι^+HFS 组和 JZ-V IOOnmol Ι^+HFS 组分别注入 5 μ 1 IOnmol L—1和5 μ 1 IOOnmol L—1的JZ-V。为了防止对实验的干扰，给药结束后细塑管仍置留于篓管内至实验结束。药物在脑组织中浓度换算大鼠脑容积计量为ani，根据给药体积、原药液浓度以及在理论上应达到脑组织中的药物浓度，计算出药物在侧脑室的终浓度 [93]。溶剂对照组给予相应体积的生理盐水。2. 4数据处理所有实验数据用均数士标准差(mean士SD)表示，采用SPSS统计软件进行处理，组间比较采用t检验。P < 0. 05为差异有显著性，P <0.01为差异有极显著性。3 结果3. IJZ-V (10、IOOnmol L—1)对基础突触传递水平的影响JZ-V (10、IOOnmol L—1，icv)通过篓管给予，在给药前记录基础突触传递水平PS幅度值30min，每5min记录一次，将此6个时间点的PS幅度值的平均值作为PS幅度基线值， 如图3a和图北所示，在溶剂对照组给药后60min内的PS幅度没有变化。3. 2JZ-V (IOUOOnmol Γ1)对 HFS 诱导 DG LTP 的影响在给予J-V IOnmol Γ1后30min，给予HFS (IOOHz)。在给药前30min记录基础突触传递水平PS幅度值，每5min记录一次，将此6个时间点的PS幅度值的平均值作为PS 幅度基线值，给药后观察时间为90min。如图4a、图4b和图如所示，对照组的PS幅度在 90min内没有变化，单纯高频刺激组的PS值在10，30，60，90min分别为200% 士 20%，182% 士 19%，180% 士 19%禾Π 178% 士 17% (n = 6)。JZ-V IOnmol Γ1+HFS 组的 PS 幅度在给予 HFS 后 IOmin 为 297% 士 21%，30min 时为 290% 士 18%，60min 时 PS 幅度为 296% 士 20% (n = 6)，而 JZ-V IOOnmol Γ1 给药组在给予 HFS 后 10，30，60min 其 PS 值为 348% 士 27%， 333% 士沘％，3；35% 士31% (n = 6)。研究结果说明JZ-V呈剂量依赖性加强100ΗΖ对LTP 的诱导，显著提高突了海马突触传递效能。4、结论JZ-V可显著提高HFS后的群峰电位幅度，大大增强LTP的诱导。具有增强神经突触传递的作用。实施例2JZ-V对A β ( β -淀粉样蛋白，β -Amyloid Protein)所致学习记忆障碍的改善作用1实验材料1. 1实验动物C57BL/6雄性小鼠，SPF级，体重(23士2)g，由中国医学科学院实验动物研究所提供，质量合格证号SCXK (京)2009-007。将动物饲养于SPF级动物房中，自然采光，室温22士2°C，自由摄食饮水，动物在动物房中适应环境7天进行手术。1.2药品与试剂4 3 1-42:美国5丨8111￡1公司，0981(4813。盐酸多奈哌齐卫材医药有限公司，(国药准字H200550978)，批号100223A。JZ-V通过现有方法直接提取得到。1. 3实验仪器SR_6N立体定位仪(Narishige，日本)2实验方法2. 1动物模型制备手术前，C57小鼠称重，体重25 ^g，小鼠腹腔注射4%水合氯醛麻醉(lml/100g)后，固定于脑立体定位仪上使头颅保持水平，用75%酒精消毒皮肤， 剪去耳后及头顶部毛后，沿颅骨正中线纵向切开皮肤，用脱脂棉推开皮下组织及骨膜，充分暴露颅骨，使骨缝清晰。使用脑立体定位仪定坐标为前囟后0. 2mm，矢状缝旁1mm，硬脑膜下0. 9mm,以骨钻打开颅骨，将脱脂棉清除骨屑后以针头小心挑破硬脑膜，用眼科镊将装有生理盐水的PE管垂直插入小孔内，并用牙科水泥将其固定于颅骨上，待实验时注射药物使用。埋管结束后在小孔周围颅骨上洒少量青霉素粉防止感染。手术后，动物需单笼饲养，恢复3天后进行给药。手术后，将小鼠随机分为4组，每组13只，分别为空白对照组、A β 1-42 模型组、阳性药盐酸多奈哌齐给药组和JZ-V给药组。单笼饲养，术后动物恢复3天后，第4 天开始每天给药进行造模。A β 1-42模型组、阳性药盐酸多奈哌齐给药组和JZ-V给药组每天给与A β l-42400pmol即5 μ 1，连续给药3天进行造模。造模后，Αβ 1-42模型组在末次给药7天后进行Morris水迷宫试验。阳性药盐酸多奈哌齐给药组造模后，每天在固定时间灌胃给予盐酸多奈哌齐(5mg/kg)。JZ-V给药组造模后，每天侧脑室注射5μ1 JZ-V (0.0 μ Μ，溶于生理盐水)。阳性药盐酸多奈哌齐给药组和JZ-V给药组在末次给药Ih后进行Morris水迷宫试验。除阳性药盐酸多奈哌齐给药组每天固定时间灌胃给予5mg/kg的阳性药，其余各组灌胃给予等容量的双蒸水(DDW)。JZ-V给药组侧脑室注射JZ-V5 μ 1，其余组别侧脑室给与等容量的生理盐水。2. 2Morris水迷宫实验使用如图2所示的Morris水迷宫实验装置。Morris水迷宫实验包括定位航行试验和空间探索试验，Morris水迷宫实验的前四天进行定位航行试验。实验第一天，不放置平台，让小鼠自由游泳anin，以适应周围环境。第二天正式实验时， 平台固定在NW(按东南西北四个方向将水池平均划分为4个象限NE、SE、SW、NW)中央，迷宫中含有白色素的液面高于平台1.5cm，水温稳定在(22士0.5) °C。小鼠首先被搁置于台阶上10s，使其了解平台的位置后，选择平台的对角象限作为入水象限(SE)，将小鼠面向池壁放入水池，使其自由游泳，自动摄像系统记录小鼠寻找平台的时间(逃避潜伏期，escape latency)，设定60s为最长逃避潜伏期，60s后自动停止记录。如果小鼠在60s内未找到平台，需将其引至平台，这时潜伏期记为60s。检测指标为潜伏期、总游程、终止类型(终止类型为至测试终止成功寻找到平台的百分比)。定位航行试验结束第二天为空间探索试验(spatial probe test)，撤除平台，通过动物在60s内穿过原平台位置的次数、原平台象限游程比率及时间比率(即动物在原平台象限的游程及时间占总游程及总时间的比率)来评价动物的空间记忆能力。试验期间环境安静，迷宫外参照物不变。Morris水迷宫实验期间，阳性药盐酸多奈哌齐给药组和JZ-V给药组仍继续每天给药，阳性药盐酸多奈哌齐给药组和JZ-V给药组末次给药Ih后进行Morris水迷宫实验。2. 3避暗实验=Morris水迷宫试验结束后，动物休息1天后进行避暗试验。在此期间，阳性药盐酸多奈哌齐给药组和JZ-V给药组仍继续每天给药，末次给药Ih后进行避暗试验测试。首次试验前，让动物在试验箱中适应;3min。训练时，将小鼠面部背向洞口放置明室，同时启动自动记录装置，计时器开始计时。动物通过洞口进入暗室受到电击后即可取出。24h后正式测试，记录小鼠第1次进入暗箱前，在明箱停留的时间(即避暗潜伏期)，以及5min中内小鼠进入暗箱，受到电击的次数(即小鼠进入暗箱的错误次数)。3 结果3. IMorris 水迷宫试验中 JZ-V 对 Αβ 1_42(β-淀粉肽，beta-amyloidp印tide， Αβ )(1-42)引起的小鼠学习记忆障碍的改善作用侧脑室内注射Αβ 1-42造模一周后，小鼠出现明显的空间学习记忆障碍，表现为潜伏期较空白对照组显著延长，小鼠寻找平台的成功率(百分比表示)显著降低(结果如表2所示)，在平台所在象限内游泳路程也明显减少。与模型组相比，JZ-V组小鼠潜伏期明显缩短，寻找平台的成功率显著增加，在平台所在象限内游泳路程也明显增多。随着训练次数的增加，各组小鼠寻找到平台的游泳时间、游泳路程(潜伏期)不断减少，与模型组相比，其余各组小鼠潜伏期均明显缩短(P <0.01)，成功寻找平台的几率不断增加(P <0.01)，总游路程缩短。结果如表1、2、3所示。在定位航行测试结束后，撤除平台进行空间探索实验以测试小鼠是否已形成对平台的空间记忆，结果见表4所示。结果表明，Αβ模型与空白对照组小鼠相比，在原平台所在象限游泳的路程比率明显下降(P < 0. 01)，在原平台所在象限游泳的时间比率明显降低 (P < 0. 05)。与模型组相比，各组小鼠在原平台所在象限游程明显升高(P < 0. 05)。说明在Morris水迷宫实验中，Αβ 1-42明显损伤了小鼠的空间记忆能力，提示 JZ-V能明显对抗由Αβ 1-42引起的小鼠空间学习记忆功能的损伤，改善学习记忆能力。表1. JZ-V对安全岛探寻潜伏期的影响
权利要求
1.敬钊毒素-V在制备抗认知、学习记忆功能障碍药物中的应用。
2.敬钊毒素-V在制备用于预防、缓解和/或治疗阿尔茨海默氏病引发的认知功能障碍和/或学习记忆功能障碍的药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物含有预防或治疗有效量的敬钊毒素-ν以及任选的药学可接受的载体和/或辅料。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型选自溶液剂、悬液剂、乳剂、丸剂、胶囊剂、粉末剂、控制释放剂或持续释放制剂。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物通过吸入或吹入口和鼻给药、经口含化给药、胃肠外或直肠给药、局部椎管给药。
全文摘要
本发明公开了敬钊毒素-V在制备抗认知、学习记忆功能障碍药物中的应用。本发明将化学法制备的敬钊缨毛蜘蛛毒素提取物-JZ-V用于制备预防、缓解和/或治疗能引发认知功能和/或学习记忆功能障碍的疾病，如阿尔茨海默氏病等疾病或症状，特别是改善认知功能和/或学习记忆功能的药物和/或药物组合物。实验证实JZ-V能显著提高大鼠海马突触传递效应，使其突触传递通路LTP的诱导呈显著性增强，从而可显著延长痴呆动物错误潜伏期；可显著缩短痴呆动物寻找到安全岛的游泳时间和游泳路程；可明显改善痴呆动物对平台的空间记忆。临床一线痴呆治疗药物多奈哌齐在本实验中为阳性对照药，研究结果显示JZ-V对于学习记忆障碍的治疗效果的多项指标优于或与多奈哌齐相齐平。
文档编号A61K38/17GK102397526SQ20111036961
公开日2012年4月4日 申请日期2011年11月18日 优先权日2011年11月18日
发明者王晓英, 谢奇辰, 陈曦 申请人:中国医学科学院药用植物研究所