专利名称：一种灰树花多糖zzk组分及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种灰树花多糖TUL组分及其制备方法。对灰树花子实体进行粉碎， 提取等步骤得到一种灰树花多糖za(组分，该多糖主要由葡萄糖和甘露糖组成，可用于制作食品添加剂，各种药物制剂。本发明属于食品加工，医药工业相关领域。
背景技术：
自20世纪80年代始，国内外学者对灰树花多糖进行了大量研究，从灰树花子实体和菌丝体中提取了几十种活性多糖，其中包括D-组分、MD组分、Grifolan组分、T-2组分等具有显著生理活性的组分。这些组分的共同特征就是由β_1，3连接和β_1，6连接的葡萄糖组成，并含有一定量的蛋白质。Nanba等从灰树花中提取到的纯化灰树花多糖D-组分和MD-组分是成功的典范。 D-组分为灰树花子实体的酸不溶、碱溶性热水提取物，相对分子质量约为1. 4Χ106,是一种由高度分化的β_1，3连接为主链和β-1，6为支链的蛋白聚糖，蛋白含量约为30%，提取率约为0.4%，D-组分进一步分离可以得到E、F等组分。MD-组分相对分子质量约为1X106， 蛋白含量小于20%，来自于灰树花子实体或菌丝体，是在改进D-组分提取工艺基础上进一步纯化的产物，与D-组分具有相同的β-葡聚糖结构。ΜΤ-2组分即E-组分，也是一种酸不溶性、碱溶性多糖,是MT-I即D-组分经kpharose CL-4B柱和DEAE-S印harose CL-6B柱进一步纯化后的产物，相对分子质量约为2X106，蛋白含量0.6%，提取率约为0.014%，为含 β_1，3支链的β_1，6葡聚糖。Kubo等在进行灰树花子实体多糖分离过程中，发现热水提取物中加入一倍量乙醇后产生了悬浮物，离心分离后得到一种糖蛋白，即χ-组份(糖蛋白=65 35)，相对分子质量5Χ105。结构分析表明，X-组份为具有α-1，4分支的β-1， 6葡聚糖，口服给药时具有显著的降血糖活性。劳华均等(上海农业学报，1997，13，(1) 25 30)从灰树花子实体中提取得到灰树花粗多糖GFP，实验证明该粗多糖对于小鼠Lewis肺癌和Colon癌均有显著的抑制作用。乔彦茹等(食用菌学报，2010，17 ) :48 51)从灰树花子实体中提取得到一种灰树花多糖GFP75-2-2B，该多糖由岩藻糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖组成，其摩尔比为 1.0 1.3 3.6 4.0 4. 5，重均分子量小于8000道尔顿，该多糖具有明显刺激巨噬细胞分泌NO的活性，NO的分泌能够增强巨噬细胞对病原微生物、肿瘤细胞等有害物质的作用，是巨噬细胞活化的主要特征之一。Feng jie-cui等从灰树花中提取出来一种多糖蛋白(Toxicology in vitro 21，2007，417 427)，该多糖由α连接的葡萄糖、半乳糖为主链，支链由阿拉伯糖组成，蛋白含量约16%，重均分子量21KD。该多糖可以抑制SGC-7901 细胞的增长，具有一定的抗肿瘤活性。李小定等从灰树花子实体中提取得到四个多糖组分 PGFl 4(华中农业大学学报，2002年4月21卷第2期186 188)，对PGFl进行成分分析，结果表明PGFl是一种β葡聚糖，该多糖重均分子量11万道尔顿，单糖组成为葡萄糖， 含有1. 的蛋白质。作者未对PGFl多糖做进一步的纯化得到纯品多糖并进行结构分析。目前国内外学者对灰树花多糖的研究还处于一个起步阶段，通过对灰树花粗多糖的分离得到各种组分如D组分等，这些组分实质上仍然属于灰树花粗多糖。比如D组分还可以进一步纯化为MD、E或F组分。没有确定灰树花多糖的确切有效单体成分及确切结构。 这大大阻碍了灰树花多糖做为药品尤其是注射剂类药品的开发。目前国内已经上市的多糖类药品如注射用香菇多糖就具有明确化学结构，有明确的重均分子量范围。2002年浙江方格药业有限公司第一个在国内获得灰树花多糖药品批准文号即国药准字B20020023，使得灰树花多糖真正成为上市药品，剂型为胶囊剂，内容物为灰树花粗多糖。目前国内市场上仅有方格药业一家获得灰树花胶囊剂的药品批文，没有企业获得灰树花注射剂的批文。本发明所述灰树花多糖组分是以灰树花子实体为原料，经干燥，粉碎，提取， 纯化等工艺分离得到的一种β葡甘聚糖(zao，该组分在之前的文献中未见报道。其主要单糖组成是葡萄糖和甘露糖，重均分子量在38 75万道尔顿，具有显著的抗肿瘤活性。
发明内容
本发明涉及一种灰树花多糖TDL组分，该多糖组分是从灰树花子实体中提取的一种特异性结构多糖，该组分多糖此前未有文献报道方法，属于新发现的一种灰树花多糖组分。本发明还提供了 za(组分的提取方法。灰树花子实体经干燥，粉碎，热水提取，超滤浓缩，无水乙醇多次沉淀，大孔树脂纯化，Sephacryl凝胶纯化分离，洗脱液干燥得到灰树花多糖ZZk组分。动物实验表明TUL组分具有显著的抗肿瘤活性。制备灰树花多糖ZZk组分的优选的提取工艺具体步骤为一、灰树花子实体的干燥，粉碎为了方便灰树花子实体的粉碎，因此需要对灰树花子实体进行充分干燥。干燥的温度不宜过高，设定在50 60°C之间即可。干燥后的灰树花子实体使用粉碎机粉碎为细粉 (能通过5号筛或80目的粉不少于95% )。二、提取灰树花细粉适量，加10倍体积的热水100°C提取2小时，采用离心或过滤方法进行固液分离，残渣弃去，澄清的提取液备用。三、浓缩步骤“二、提取”中的提取液适量用超滤膜处理，膜孔径为截留重均分子量80万大小，能通过超滤膜的部分再用截留重均分子量20万道尔顿大小孔径的超滤膜反复处理，保留不能通过膜的部分(浓缩液)备用，此浓缩液主要含有重均分子量20 80万道尔顿的灰树花多糖。四、沉淀取步骤“三、浓缩”中浓缩液适量，加2倍体积的无水乙醇，边加边搅拌。静置过夜， 过滤，沉淀用80%的乙醇洗涤2次，无水乙醇洗涤2次，80°C烘干。沉淀研细，加30倍量的水100°C提取2小时，离心，上清加3倍体积的无水乙醇，边加边搅拌。静置过夜，过滤，沉淀用80%的乙醇洗涤2次，无水乙醇洗涤2次，80°C烘干。沉淀再次研细，加30倍量的水依上法复溶、沉淀、烘干即得灰树花粗多糖。五、大孔树脂纯化取灰树花粗多糖适量，加50倍量的水100°C提取2小时，离心，上清通过大孔树脂DlOl所装的柱子进行纯化，洗脱液为水。收集洗脱液主峰，在下一步中用S^hacryl S-400HR继续纯化。六、Sephacryl 纯化上述大孔树脂洗脱液主峰用kphacryl S-400HR所装的柱子进行纯化，洗脱液为水。收集洗脱液峰面积最大的主峰，重复步骤“五、大孔树脂纯化”和“六、S^hacryl纯化” 数次，直至kphacryl S-400HR洗脱图谱只有一个均一的主峰为止。七、干燥取“六、S^hacryl纯化”步骤获得的均一主峰溶液，冷冻干燥即得灰树花多糖ZI 组分。综上所述的制备过程，优选的工艺为灰树花子实体经50 60°C干燥，粉碎成细粉。加10倍体积的热水100°C提取2小时，离心除去残渣，离心所得上清液用截留重均分子量80万道尔顿大小的超滤膜超滤，能通过膜的部分接着用截留重均分子量20万道尔顿的超滤膜超滤浓缩，不能通过的部分即浓缩液。浓缩液加2倍体积的无水乙醇，边加边搅拌。 静置过夜，过滤，沉淀用80%的乙醇洗涤2次，无水乙醇洗涤2次，80°C烘干。沉淀研细，加 50倍量的水100°C提取2小时，离心，上清加3倍体积的无水乙醇，边加边搅拌。静置过夜， 过滤，沉淀用80%的乙醇洗涤2次，无水乙醇洗涤2次，80°C烘干。沉淀再次研细，加50倍量的水依上法复溶、沉淀、烘干即得灰树花粗多糖。取灰树花粗多糖适量，加50倍量的水 100°C提取2小时，离心，上清依次用大孔树脂DlOl所装的柱子和kphacryl S-400HR所装的柱子反复纯化3次，洗脱液为水。收集洗脱液峰中面积最大的主峰冷冻干燥即得灰树花多糖ZI组分。灰树花多糖TOk组分的结构信息为1、单糖组成分析参照文献(戴军等，分析测试学报，第沈卷第2期P206 216)采用PMP (1_苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)衍生化分析方法对灰树花多糖ZI组分进行单糖组成分析，结果表明ZI组分的单糖组成主要由葡萄糖和甘露糖组成，葡萄糖和甘露糖的量为1 1。2、连接方式# M(Jansson P E et al. A practical guide to the methylation analysis of carbohydrates. Chem. Commun. , 1976,8(15) :1 74)采用部分甲基化方法对灰树花多糖ZI组分进行连接方式分析，结果表明Z3(组分是由1，3连接的葡萄糖和1，6 连接的甘露糖组成的葡甘聚糖。3、部分酸水解取灰树花ZI组分0. 5克，加0. lmol/L硫酸溶液2mL，密封，80°C保温15分钟，用 0. 2mol/L的氢氧化钠溶液调溶液pH值至近中性。用截留重均分子量3000的透析袋流水透析过夜，袋内液体干燥后得部分酸水解的ZI组分，对此组分进行糖组成和连接方式分析， 结果表明与未水解的Za(组分一致，即由1 1的1，3连接的葡萄糖和1，6连接的甘露糖组成。4、重均分子量以Dextran系列葡聚糖为对照品，测定5批TLY的重均分子量，结果表明5批TDk 的重均分子量分别为38万，42万，56万，64万和75万。
5、红外扫描(构型)红外扫描结果表明ZI样品在890CHT1有弱吸收峰，840cm"1无吸收，说明ZI组分是β构型，不含α构型。6、紫外扫描紫外扫描结果表明ZI样品在270 290区域无吸收峰，说明样品中不含蛋白质。7、含量测定采用硫酸苯酚法测定5个批次的TUk样品多糖含量，结果表明多糖含量均在95% 以上。8、比旋度测定温度按中国药典为20°C，按中国药典二部附录依法测定，经测定5批Ζ3(的比旋度分别为 3. 2,4. 3,2. 6,2. 5 和 3. 4。9、结构分析通过上述1 7的实验，可以得出ZI组分是1，3连接的葡萄糖和1，6连接的甘露糖组成的β-葡甘聚糖，两种单糖摩尔比为1 1，重均分子量在38 75万之间，具有如下重复单元-3Glc3 l_6Man3 1-所述的灰树花多糖TUL组分可应用于制备抗肿瘤药物，也可将这种灰树花多糖 ZI用于制成食品、保健食品或食品添加物，应用于患有癌症的病人。灰树花多糖ZI组分腹腔注射Q0mg/kg、50mg/kg和100mg/kg)给药10天，香菇多糖(天地欣)为对照，结果表明灰树花多糖ZI组分3种剂量对小鼠S-180瘤均具有显著抑制作用。其中TUL组分50mg/kg与天地欣20mg/kg给药剂量抑瘤率无显著差别，均高于80%。提示灰树花多糖TUL组分可以用于抗肿瘤药物的制备。(四)说明书附图
无
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1灰树花多糖TDk组分的制备灰树花子实体干品1公斤，在鼓风干燥箱内50°C干燥5小时，用打粉机粉碎成细粉，过5号筛网得细粉0. 98公斤。加IOL热水至细粉中，搅拌均勻，煮沸提取2小时，提取物用板框过滤除去残渣得澄清提取液，提取液用截留重均分子量80万大小的超滤膜超滤，能通过膜的部分(重均分子量小于80万)接着用截留重均分子量20万的超滤膜超滤浓缩，不能通过20万的部分(重均分子量大于20万)即浓缩液。浓缩液加2倍体积的无水乙醇， 边加边搅拌。静置过夜，离心得沉淀，沉淀用80%的乙醇洗涤2次，无水乙醇洗涤2次，80°C 烘干得沉淀5. 6克。干燥后的沉淀研细，加^OmL水100°C提取2小时，离心，上清加3倍体积的无水乙醇，边加边搅拌。静置过夜，过滤，沉淀用80%的乙醇洗涤2次，无水乙醇洗涤2 次，80°C烘干。沉淀再次研细，加50倍量的水依上法复溶、沉淀、烘干即得灰树花粗多糖共 3. 8克。取灰树花粗多糖3. 8克，加190mL水100°C提取2小时，离心，上清依次用大孔树脂DlOl所装的柱子和kphacryl S-400HR所装的柱子反复纯化3次，洗脱液为水。收集洗脱液峰面积最大的主峰冷冻干燥即得灰树花多糖TUL组分1. 5克。实施例2灰树花多糖TUk组分的制备灰树花子实体鲜品10公斤，在鼓风干燥箱内60°C干燥15小时，用打粉机粉碎成细粉，过5号筛网得细粉1. 2公斤。加12L热水至细粉中，搅拌均勻，煮沸提取2小时，提取物用板框过滤除去残渣得澄清提取液，提取液用截留重均分子量80万大小的超滤膜超滤，能通过膜的部分(重均分子量小于80万)接着用截留重均分子量20万的超滤膜超滤浓缩， 不能通过20万的部分(重均分子量大于20万)即浓缩液。浓缩液加2倍体积的无水乙醇，边加边搅拌。静置过夜，离心得沉淀，沉淀用80%的乙醇洗涤2次，无水乙醇洗涤2次， 80°C烘干得沉淀6. 5克。干燥后的沉淀研细，加325mL水100°C提取2小时，离心，上清加3 倍体积的无水乙醇，边加边搅拌。静置过夜，过滤，沉淀用80%的乙醇洗涤2次，无水乙醇洗涤2次，80°C烘干。沉淀再次研细，加50倍量的水依上法复溶、沉淀、烘干即得灰树花粗多糖共4. 7克。取灰树花粗多糖4. 7克，加235mL水100°C提取2小时，离心，上清依次用大孔树脂DlOl所装的柱子和kphaCrylS-400HR所装的柱子反复纯化3次，洗脱液为水。收集洗脱液峰面积最大的主峰冷冻干燥即得灰树花多糖TUL组分1. 7克。实施例3灰树花多糖TUk组分的结构分析取实施例1中Z3(组分3批(批号20100401，20100402，20100402)和实施例2中的 Za(组分3批(批号20100501，20100502)适量进行结构分析。单糖组成分析采用PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)衍生化法；单糖的连接方式采用部分甲基化部分乙酰化法分析； 多糖构型采用红外分析法；蛋白检测采用紫外扫描；重均分子量采取高效液相凝胶渗透色谱法(GPC)测定，检测器使用示差检测器；按中国药典二部规定对5批Z3(组分的比旋度依法测定，测定温度20°C。5批样品分别进行部分酸水解，具体为za(组分0.5克加0. Imol/ L硫酸溶液2mL，密封，80°C保温15分钟，用0. 2mol/L的氢氧化钠溶液调溶液pH值至近中性。用截留重均分子量3000的透析袋流水透析过夜，袋内液体干燥后得部分酸水解的TUk 组分，对此组分进行糖组成和连接方式分析。以上测试结果如下5批ZI组分单糖组成测定结果如下表1 表 权利要求
1.一种灰树花多糖ZI组分，其特征在于所述的灰树花多糖是由1，3连接的葡萄糖和 1，6连接的甘露糖组成的β-葡甘聚糖，两种单糖的摩尔比例为1 1，重均分子量在38 75万道尔顿之间，具有如下重复单元-3Glc3 l-6Man β 1-
2.制备如权利要求1所述的制备灰树花多糖TDk组分的方法，其特征在于灰树花子实体经干燥，粉碎，热水提取，离心，膜分离截留重均分子量20 80万道尔顿范围，乙醇沉淀， 水复溶再次乙醇沉淀，大孔树脂DlOl柱子和kphacrylS-400HR柱子反复纯化，收集洗脱液峰面积中最大的主峰冷冻干燥即得灰树花多糖TUL组分。
3.如权利要求1 2所述的灰树花多糖TUL组分所用的提取原料是灰树花子实体。
4.如权利要求1 2所述的灰树花多糖TUk组分的制备方法，其特征在于所述的方法如下灰树花子实体经50 60°C干燥，粉碎成细粉。加10倍体积的热水100%提取2小时，离心除去残渣，离心所得上清液用截留分子量80万道尔顿大小的超滤膜超滤，能通过膜的部分接着用截留分子量20万道尔顿的超滤膜超滤，不能通过的部分即浓缩液，分子量在20 80万道尔顿。浓缩液加2倍体积的无水乙醇，边加边搅拌。静置过夜，过滤，沉淀用80%的乙醇洗涤2次，无水乙醇洗涤2次，80°C烘干。沉淀研细，加50倍量的水100°C提取2小时，离心，上清加3倍体积的无水乙醇，边加边搅拌。静置过夜，过滤，沉淀用80%的乙醇洗涤2次，无水乙醇洗涤2次，80°C烘干。沉淀再次研细，加50倍量的水依上法复溶、乙醇沉淀、烘干即得灰树花粗多糖。取灰树花粗多糖适量，加50倍量的水100°C提取2小时， 离心，上清依次用大孔树脂DlOl所装的柱子和kphacryl S-400HR所装的柱子反复纯化3 次，洗脱液为水。收集洗脱液峰面积中最大的主峰冷冻干燥即得灰树花多糖TUL组分。
5.如权利要求1 2所述的灰树花多糖TEk组分在制备抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种灰树花多糖ZZK组分及其制备方法。以灰树花中子实体为原料，经干燥，粉碎，提取，纯化等工艺分离得到的一种β葡甘聚糖(ZZK)。其主要单糖组成是葡萄糖和甘露糖，重均分子量在38～75万道尔顿，具有显著的抗肿瘤活性。
文档编号A61K31/736GK102408494SQ20111039899
公开日2012年4月11日 申请日期2011年11月30日 优先权日2011年11月30日
发明者张萍, 杨勇杰, 杨小丽, 毛延卿, 郑宝芬 申请人:杭州众芝康菇生物技术有限公司