专利名称：壳聚糖与硫酸化灰树花多糖共混凝胶冻干海绵及其制备方法、应用的制作方法
技术领域：
本发明属于天然高分子技术领域，也属于生物医学技术领域，具体涉及壳聚糖与硫酸化灰树花多糖共混凝胶冻干海绵及其制备方法和用途。
背景技术：
壳聚糖又称可溶性甲壳素、脱乙酰基甲壳素、壳糖胺、几丁聚糖，其是以虾蟹壳为原料，先制得甲壳素，然后在浓碱作用下脱去甲壳素分子中的乙酰基而制得的一种天然高分子化合物，其在自然界中的含量仅次于纤维素。由于壳聚糖分子中含有活泼的羟基和氨基等极性基团，主链上可发生水解反应，C 一 2位上的氨基和C - 6位上的羟基可以发生乙酰化、羟乙酰化、羧甲基化、氰乙基化、硫酸酯化、氧化、黄原酸化等化学修饰。在双官能团的醛或酸酐等交联剂作用下，可进行交联反应。在Y —射线或催化剂作用下，乙烯基单体和丙烯酸类单体可与壳聚糖进行接枝共聚反应，加上它不仅具有很好的生物相容性，而且无毒、易生物降解，使得其在医药、农业、环保、纺织、印染、造纸、催化、食品、日用化妆品等领域具有广泛的应用前景。在医药工业中，由壳聚糖制得的手术缝合线机械强度好，可长期存放，能用常规方法消毒，能被人体内组织液降解而吸收，伤口愈合后无须拆除手术线，免除了患者拆线的痛苦。由壳聚糖制成的人造皮肤，具有柔软、舒适的特点，覆盖在烧伤面上能减轻患者痛苦，加速伤口愈合、促进皮肤再生。在实施手术时，血管内注入高粘度的壳聚糖， 可起凝血剂的作用，达到止血的目的。壳聚糖还具有抑制胃酸、抗溃疡、降低胆固醇和甘油三酯吸收等作用，用其制成的药物可用来治疗胆囊炎、冠心病和各种胃肝病以及减肥。壳聚糖与二价铁离子配合而成的复合物可用于治疗缺铁症。壳聚糖与硫酸反应生成的硫酸化产物具有与肝素类似的分子结构，作为抗凝血剂，具有良好的抗凝血性和经济实用的效果。此外，壳聚糖还可用于微型胶囊的制备和疫苗的缓释，用作消炎眼膏的载体用于制造隐形眼镜等。灰树花，又名贝叶多孔菌[Polyporus frondosus]，俗称云蕈，日本人称舞茸，是一种新开发的名贵食、药用菌。灰树花主要活性成份是灰树花蛋白多糖，多糖组份中以葡聚糖为主，以具有β - (1 — 6)分支的β - (1 — 3)葡聚糖为基本结构，含少量的木糖和甘露糖。灰树花多糖主要通过增强细胞免疫功能而发挥其抗肿瘤作用，在基因水平上，灰树花多糖有较强的抗化学诱变作用。硫酸化灰树花多糖具有类肝素结构，因而具有类肝素的促创面愈合作用。由于纯壳聚糖冻干海绵状材料性能呈片层状结构，有一定的机械强度但其柔韧性不足；此外，由于其亲水性能较差，细胞相容性不好。鉴于此，通过水溶性硫酸化灰树花多糖引入改性，使得海绵材料具备良好的柔韧性能。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供了一种壳聚糖与硫酸化灰树花多糖共混凝胶冻干海绵及其制备方法、应用。本发明壳聚糖与硫酸化灰树花多糖共混凝胶冻干海绵具有良好的力学性能、微孔径可控和良好的生物相容性以及良好的透气性能和可降解性能，且生产过程简单、方便。可用做创面止血、组织工程材料等，具有良好的临床应用前景。本发明采取以下技术方案壳聚糖与硫酸化灰树花多糖共混凝胶冻干海绵，其包含以下质量百分比成份壳聚糖20%-98%、硫酸化灰树花多糖2%-80%。优选的，海绵材料的孔径在20 - 500 μ m,既具有均勻连通微孔，又具有不均勻连通大孔结构。本发明还公开了以壳聚糖和硫酸化灰树花多糖为原料，通过冷冻一冻干方法制备多孔海绵材料的方法，并采用物理化学方法交联改性，该制备方法按以下步骤进行
一、将灰树花多糖溶于浓硫酸或氯磺酸，采用浓硫酸或氯磺酸与灰树花多糖制备硫酸化灰树花多糖，其硫酸化位点在于2，3,6-羟基上；(优选的，采用氯磺酸；浓硫酸采用 98. 3%的浓硫酸；)
二、采用冰水浴，机械搅拌转速500-1000rpm，硫酸化时间为20-120分钟，经低温下与碱中和后经无水乙醇沉淀，透析，冻干纯化后可获得磺化度为50% -100%的硫酸化灰树花多糖；(优选的，硫酸化时间为40分钟；)
三、配制壳聚糖的酸性溶液，将壳聚糖溶于有机酸或无机酸中，获得质量百分比0.5 -10%的溶液；将步骤二制备得的硫酸化灰树花多糖配制成0. 1 - 10%溶液；将壳聚糖酸性溶液与硫酸化灰树花多糖水溶液按照质量百分比壳聚糖20%-98%、硫酸化灰树花多糖 2%-80%(即比例98 2-20 80)混合；将混和液加入制得海绵总质量0. 0001 — 0. 5%的京尼平或(聚)乙二醇二缩水甘油醚，混和液浇铸冷冻，冻干得海绵材料。(优选的，壳聚糖与硫酸化灰树花多糖溶液采用80 20比例混和；京尼平或(聚)乙二醇二缩水甘油醚占总质量的 0. 05% (即不超过海绵总质量的0.5%)；冷冻温度为一 5°C—一 80°C，最佳为一 20°C。)
优选的，第三步，有机酸是抗坏血酸，苹果酸，乳酸，柠檬酸，麸酸，琥珀酸，酒石酸，顺丁烯二酸或富马酸；无机酸是乙酸或盐酸。优选的，第三步，壳聚糖原料分子量为15万一200万，脱乙酰度70%—95%。优选的，第一步，灰树花多糖纯度选用多糖含量>30%。优先的，第二步，低温为-15°C 10°C。当然，在前述技术方案中，壳聚糖酸性溶液与硫酸化灰树花多糖水溶液的制备步骤可以同步进行，或者先制备其中之一，后制备另一溶液，也可以达到相应的技术效果。因此，本发明还可以采取以下技术方案壳聚糖与硫酸化灰树花多糖共混凝胶冻干海绵的制备方法，其按如下步骤
一、将壳聚糖溶于有机酸或无机酸中，制得质量百分比为0.5 - 10%的溶液；
二、将灰树花多糖溶于浓硫酸或氯磺酸，其磺化位点在于2，3，6-羟基上；采用冰水浴， 机械搅拌转速500-1000rpm，磺化时间为20-120分钟，经低温(_15°C 10°C )下与碱中和后无水乙醇沉淀，透析，冻干纯化后可获得磺化度为50% -100%的硫酸化灰树花多糖；将硫酸化灰树花多糖配制成质量百分比为0. 1 - 10%溶液；
三、将第一步的壳聚糖酸性溶液与第二步的硫酸化灰树花多糖水溶液按照质量百分比壳聚糖20%-98%、硫酸化灰树花多糖2%-80%混合，经5-20秒超声振荡混均后，加入制得海绵材料总质量0. 0001 - 0. 5%的京尼平或(聚)乙二醇二缩水甘油醚，混和液浇铸冷冻，冻干得海绵材料。在上述技术方案中，第一步与第二步可以互换，或者可以合并成同一步，都可以达到相应的技术效果。本发明的冻干海绵用作止血敷料。本发明的冻干海绵用作组织工程材料。本发明采用天然动物多糖与植物多糖为原料，具有良好的生物安全性与可降解性能，其材料来源广泛，成本低廉。采用冷冻一冻干方法可通过酸种类，浓度，冷冻温度，交联剂用量控制凝胶海绵的微结构及其降解速率。本发明的多孔海绵材料可用于创口止血材料，心瓣膜，硬脑膜，硬脊膜，深度烫伤材料等，可促受损组织迅速愈合。
图1为壳聚糖与抗坏血酸形成复合物结构的过程图。图2为海绵多糖的扫描电镜图谱。图3为海绵在不同pH条件下M小时的吸水率图。图4为植入多孔海绵20天后创面愈合情况HE染色切片。从图1可知，壳聚糖上伯氨基发生质子化而与抗坏血酸形成复合物。从图2中可知，多糖海绵的孔径范围在20 - 500 μ m，有利于成纤维细胞的长入，从而促进创面的修复。 由图3可知，该海绵在酸性条件下(pH<4)吸水率较高而在中性及碱性(pH>7)条件下吸水率较低，故可以满足中性及偏碱性创面的使用要求。由图4结果说明，20天后，有丰富血管长入，说明本海绵的促创面愈合能力很强。
具体实施例下面对本发明实施例作详细说明。实施例1
将40克灰树花多糖(多糖含量>30% )缓慢加入30mL氯磺酸中，冰水浴冷却，SOOrpm 高速搅拌。40分钟后，将反应液缓慢倒入50mL冷藏过的2mol/LNa0H中，控制温度不超过 40°C。调节pH值至中性，将水溶液采用无水乙醇沉淀，过滤。将沉淀物溶于20mL去离子水中，透析，冻干，获得100%取代度的硫酸化灰树花多糖。将1. 6克壳聚糖(分子量80万，脱乙酰度90% )高速搅拌溶于80mL2%的抗坏血酸水溶液中，加入0. 4克硫酸化灰树花多糖溶于20mL去离子水配制成溶液，加入0. 0001克京尼平，搅拌混和均勻，倒入模具中，放入一 20°C冰箱冷冻。将冷冻模具放入冷冻干燥机真空干燥，获得多孔多糖海绵。
实施例2
将20克灰树花多糖(多糖含量>30 % )缓慢加入15mL浓硫酸中，冰水浴冷却，IOOOrpm 高速搅拌。60分钟后，将反应液缓慢倒入30mL冷藏过的Im0VLNa2CO3中，控制温度不超过 45°C。调节pH值至中性，将水溶液采用无水乙醇沉淀，过滤。将沉淀物溶于20mL去离子水中，透析，冻干，获得90%取代度的硫酸化灰树花多糖。将1. 2克壳聚糖(分子量100万，脱乙酰度92%)高速搅拌溶于75mL2%的苹果酸水溶液中，加入0. 8克硫酸化灰树花多糖溶于25mL去离子水配制成溶液，加入0. 005克聚乙二醇二缩水甘油醚，搅拌混和均勻，倒入模具中，放入一 5°C冰箱冷冻。将冷冻模具放入冷冻干燥机真空干燥，获得多孔多糖海绵。
实施例3
将30克灰树花多糖(多糖含量>20% )缓慢加入20mL浓硫酸中，冰水浴冷却，500rpm 高速搅拌。20分钟后，将反应液缓慢倒入30mL冷藏过的Im0VLNa2CO3中，控制温度不超过 30°C。调节pH值至中性，将水溶液采用无水乙醇沉淀，过滤。将沉淀物溶于IOmL去离子水中，透析，冻干，获得80%取代度的硫酸化灰树花多糖。将0. 8克壳聚糖(分子量60万，脱乙酰度90% )高速搅拌溶于SOmLO. 2%的乳酸水溶液中，加入1. 2克硫酸化灰树花多糖溶于20mL去离子水配制成溶液，加入0. 008克乙二醇二缩水甘油醚，搅拌混和均勻，倒入模具中，放入一 30°C冰箱冷冻。将冷冻模具放入冷冻干燥机真空干燥，获得多孔多糖海绵。
实施例4
将15克灰树花多糖(多糖含量>30% )缓慢加入20mL氯磺酸中，冰水浴冷却，600rpm 高速搅拌。25分钟后，将反应液缓慢倒入60mL冷藏过的3mol/LK2C03中，控制温度不超过 40°C。调节pH值至中性，将水溶液采用无水乙醇沉淀，过滤。将沉淀物溶于25mL去离子水中，透析，冻干，获得100%取代度的硫酸化灰树花多糖。将0. 6克壳聚糖(分子量120万，脱乙酰度85%)高速搅拌溶于90mLl%的柠檬酸水溶液中，加入0. 2克硫酸化灰树花多糖溶于IOmL去离子水配制成溶液，加入0. 002克乙二醇二缩水甘油醚，搅拌混和均勻，倒入模具中，放入一 10°C冰箱冷冻。将冷冻模具放入冷冻干燥机真空干燥，获得多孔多糖海绵。
实施例5
将25克灰树花多糖(多糖含量>30 % )缓慢加入20mL浓硫酸中，冰盐浴冷却，1200rpm 高速搅拌。35分钟后，将反应液缓慢倒入SOmL冷藏过的4mol/LNaHC03中，控制温度不超过 30°C。调节pH值至中性，将水溶液采用无水乙醇沉淀，过滤。将沉淀物溶于30mL去离子水中，透析，冻干，获得98. 5%取代度的硫酸化灰树花多糖。将1. 8克壳聚糖(分子量140万，脱乙酰度95%)高速搅拌溶于95mLl%的琥珀酸水溶液中，加入0. 2克硫酸化灰树花多糖溶于5mL去离子水配制成溶液，加入0. 001克京尼平，搅拌混和均勻，倒入模具中，放入一 25°C冰箱冷冻。将冷冻模具放入冷冻干燥机真空干燥，获得多孔多糖海绵。本发明采用天然多糖及其衍生物壳聚糖与硫酸化灰树花多糖为原料，通过冷冻一冻干方法，京尼平或(聚)乙二醇二缩水甘油醚为交联剂制备出具有微结构可控，适宜降解速率，可迅速完成血管化的多孔海绵材料，该海绵材料的制备原料来源广泛，制备工艺简易，所制备材料可用于创伤、烧伤及溃疡等难愈合创面的修复。
权利要求
1.壳聚糖与硫酸化灰树花多糖共混凝胶冻干海绵，其特征是包含以下质量百分比成份壳聚糖20%-98%、硫酸化灰树花多糖2%-80%。
2.根据权利要求1所述的壳聚糖与硫酸化灰树花多糖共混凝胶冻干海绵，其特征是 所述海绵材料的孔径在20 - 500 μ m。
3.壳聚糖与硫酸化灰树花多糖共混凝胶冻干海绵的制备方法，其特征是按如下步骤一、将灰树花多糖溶于浓硫酸或氯磺酸，其磺化位点在于2，3，6-羟基上；二、采用冰水浴，机械搅拌转速500-1000rpm，磺化时间为20-120分钟，经低温下与碱中和后无水乙醇沉淀，透析，冻干纯化后可获得磺化度为50% -100%的硫酸化灰树花多糖；三、将壳聚糖溶于有机酸或无机酸中，制得质量百分比为0.5 - 10%的溶液；将步骤二制备得的硫酸化灰树花多糖配制成质量百分比为0. 1 - 10%溶液；将前述壳聚糖酸性溶液与硫酸化灰树花多糖水溶液按照质量百分比壳聚糖20%-98%、硫酸化灰树花多糖2%-80%混合，经5-20秒超声振荡混均后，加入制得海绵材料总质量0. 0001 - 0. 5%的京尼平或(聚) 乙二醇二缩水甘油醚，混和液浇铸冷冻，冻干得海绵材料。
4.按照权利要求3所述的制备方法，其特征在于第三步，所述的有机酸是抗坏血酸， 苹果酸，乳酸，柠檬酸，麸酸，琥珀酸，酒石酸，顺丁烯二酸或富马酸；所述的无机酸是乙酸或盐酸。
5.按照权利要求3所述的制备方法，其特征在于第三步，冻干的冷冻温度为一 5 0C——80 "C。
6.按照权利要求3所述的制备方法，其特征在于第三步，壳聚糖原料分子量为15 万一200万，脱乙酰度70%—95%。
7.按照权利要求3所述的制备方法，其特征在于第一步，灰树花多糖的多糖含量 >30%。
8.壳聚糖与硫酸化灰树花多糖共混凝胶冻干海绵的制备方法，其特征是按如下步骤一、将壳聚糖溶于有机酸或无机酸中，制得质量百分比为0.5 - 10%的溶液；二、将灰树花多糖溶于浓硫酸或氯磺酸，其磺化位点在于2，3，6-羟基上；采用冰水浴， 机械搅拌转速500-1000rpm，磺化时间为20-120分钟，经低温下与碱中和后无水乙醇沉淀， 透析，冻干纯化后可获得磺化度为50% -100%的硫酸化灰树花多糖；将硫酸化灰树花多糖配制成质量百分比为0. 1 - 10%溶液；三、将第一步的壳聚糖酸性溶液与第二步的硫酸化灰树花多糖水溶液按照质量百分比壳聚糖20%-98%、硫酸化灰树花多糖2%-80%混合，经5-20秒超声振荡混均后，加入制得海绵材料总质量0. 0001 - 0. 5%的京尼平或(聚)乙二醇二缩水甘油醚，混和液浇铸冷冻，冻干得海绵材料。
9.权利要求书1所述的冻干海绵用作止血敷料。
10.权利要求书1所述的冻干海绵用作组织工程材料。
全文摘要
本发明涉及壳聚糖与硫酸化灰树花多糖共混凝胶冻干海绵及其制备方法和用途。壳聚糖与硫酸化灰树花多糖共混凝胶冻干海绵包含以下质量百分比成份壳聚糖20%-98%、硫酸化灰树花多糖2%-80%。本发明采用天然动物多糖与植物多糖为原料，具有良好的生物安全性与可降解性能，其材料来源广泛，成本低廉。采用冷冻－冻干方法可通过酸种类，浓度，冷冻温度，交联剂用量控制凝胶海绵的微结构及其降解速率。本发明的多孔海绵材料可用于创口止血材料，心瓣膜，硬脑膜，硬脊膜，深度烫伤材料等，可促受损组织迅速愈合。
文档编号C08B37/02GK102167847SQ20111002550
公开日2011年8月31日 申请日期2011年1月24日 优先权日2011年1月24日
发明者刘彩凤, 周盛华, 杨学佳, 陈壁辉, 黄爱宾 申请人:杭州电子科技大学