专利名称：紫金砂及其提取物的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物提取物的用途，特别是涉及一种紫金砂及其提取物在制备用于治疗或缓解以心肌缺血再灌注损伤为主的心肌缺血性疾病的新用途。
背景技术：
紫金砂来源于伞形科植物当归属植物白根独活(Angelica polymorpha Maxim)的根，具有温中散寒，理气止痛的作用。主要含有香豆素、色原酮、挥发油等成分。既往实验证实紫金砂具有良好的抑制胃肠平滑肌痉挛、镇痛、抗溃疡、保护胃黏膜等作用。以心肌梗死、·冠状动脉狭窄为代表的缺血性心肌病是现今主要致死原因之一，据世界卫生组织报告，到2020年急性冠脉闭塞将会成为世界上的主要死因。通过溶栓、经皮冠状动脉成形术或搭桥术使缺血区早期再灌是缺血心肌存活的必要前提。然而，再灌注被认为是双刃剑，会导致比单纯缺血更为严重的损伤，即所谓的缺血再灌注损伤。因此，寻找对心肌缺血再灌注损伤具明确治疗作用药物，是今后心血管治疗药物领域研究重点。目前，尚未发现紫金砂及其提取物应用于心肌缺血及心肌缺血再灌注的专利申请及文献报道。发明人研究发现紫金砂提取物预先给药后，可显著缓解和抑制心肌缺血再灌注损伤，可以用于治疗以心肌缺血再灌注损伤为代表的心肌缺血性疾病。
发明内容
本发明的目的是提供一种治疗或缓解心肌缺血性疾病的药物。本发明人通过实验证实，一定剂量的紫金砂提取物预先口服给药后，对心肌缺血再灌注损伤具有确切治疗效果，可以用于心肌梗塞等缺血性心肌病的治疗。为此，本发明提供一种紫金砂及其提取物在制备用于治疗心肌缺血性疾病的产品和/或药物中的用途。其中所述的心肌缺血性疾病为心肌梗死、缺血再灌注损伤、再狭窄、冠状动脉心脏病、各种原因引发的冠状动脉狭窄及痉挛。优选地，所述的心肌缺血性疾病为心肌缺血再灌注损伤。所述的心肌缺血再灌注损伤，系指缺血心肌在恢复血液灌流后，出现心肌结构破坏及功能障碍反而加重的现象。能够引发心肌缺血再灌注损伤的疾病主要包括心肌梗死、冠状动脉心脏病、各种原因引发的冠状动脉狭窄及痉挛等。本发明所述的紫金砂及其提取物中含有香豆素类和色原酮类成分，优选地，所述香豆素类成分为选自水合氧化前胡素内酯、栓翅芹烯醇、异欧前胡素、奥斯索、佛手柑内酯、欧前胡素、二氢欧山芹素、异虎耳草素、氧化前胡素乙基醚中的一种或多种，所述色原酮类成分为3’ R_(+)_亥茅酚、3’ -O-乙酰基亥茅酚、拐芹色原酮、ledebouriellol的一种或多种。其中所述的香豆素类、色原酮类成分含量总和占总提取物的重量百分比为10-90%，优选的重量百分比为20-80%，进一步优选的重量百分为25-78%，更优选的重量百分比26.3-78%，特别优选的重量百分比为29.4%,26.3%,33.5%,59.38%,78%,38.61%。上述水合氧化前胡素内酯、栓翅芹烯醇、3’(R)-+-亥茅酚、3’ -O-乙酰基亥茅酚、异欧前胡素五种主要成分的总含量占总提取物的重量百分比为0.5-40%，优选的重量百分比为5-35%，进一步优选的重量百分比为10-30%，更优选的重量百分比为10.25-29.4%,特别优选的重量百分比为 11.65%U0.25%U4.82%,21.98%,29.4%U4.17%。优选地，水合氧化前胡素内酯、栓翅芹烯醇、3’(R)-+-亥茅酚、3’ -O-乙酰基亥茅酚、异欧前胡素五种主要成分在紫金砂总提取物中的重量百分比含量分别为5-25%、
0.5-2%,0.2-1.2%,0.2-1.2%,1.2-3.5%，优选的重量百分比含量分别为 7.37-23.9%,
0.63-1.8%,0.31-1.06%,0.33-0.98%,1.54-3.29%。本发明所述的紫金砂提取物，其制备方法可以用溶剂提取法、溶剂萃取法、醇沉法、柱色谱法、大孔吸附树脂法、液-液逆流分配色谱法或CO2超临界萃取法等方法中的任意一种，或者是这些方法的任意组合。优选的柱色谱为硅胶G柱色谱、大孔树脂柱色谱，优选的大孔树脂为AB-8大孔树脂。 在一个优选的实施例中，本发明所述的溶剂提取法可包括以下步骤，I)将紫金砂药材粉碎；2)用合适的溶剂提取1-5次，优选提取2-3次，优选的溶剂是乙醇、甲醇、丙酮、丙醇、异丙醇、乙醇水溶液或甲醇的水溶液等，提取方式可以是加热回流、微波提取、超声提取、冷浸提取等方式；3)合并提取液，浓缩至干，获得紫金砂提取物，优选的浓缩方式为减压浓缩。在一个优选的实施例中，上述溶剂提取法获得的提取物还可用大孔吸附树脂进一步提取，具体地包括以下步骤:4)将步骤3)中获得的紫金砂提取物在水中分散，再用合适的溶剂萃取1-6次，优选提取2-5次，进一步优选提取3次，分别合并萃取液后，浓缩至干；5)将步骤4)中获得的紫金砂粗提物加入水，超声分散，再加入合适的溶剂萃取1-6次，优选提取2-5次，进一步优选提取3次，将水层蒸干，加入乙醇，优选加入5-20%的乙醇水溶液，进一步优选加入8-15%的乙醇水溶液，特别优选加入10%的乙醇水溶液，溶散，然后上大孔树脂柱，树脂柱径高比为1: 8 1: 12，优选的树脂柱径高比为1: 9 I: 11，更优选的树脂柱径高比为1: 10，上样后用6-10倍BV (床容积，bed volume, BV)的乙醇洗去杂质，优选用6-10倍BV的5-20%的乙醇水溶液，进一步优选用6-10倍BV的8-15 %的乙醇水溶液，特别优选用8倍BV的10 %的乙醇水溶液；再用8-12倍BV的70-90 %乙醇洗脱，优选用10倍BV的85%乙醇洗脱，收集后者洗脱部分，浓缩至干，得到紫金砂提取物，其中优选的溶剂为石油醚，优选的浓缩方式为减压浓缩，优选的大孔树脂为AB-8大孔树脂。在另一个具体的实施例中，本发明所述的溶剂提取法获得的提取物还可用柱色谱法进一步提取，具体地包括以下步骤:4)将步骤3)中获得的紫金砂提取物用纯乙醇溶散均匀后，以硅胶G拌样，上硅胶G柱，树脂柱径高比1: 6 1: 10，优选的树脂柱径高比为1: 9 1: 11，更优选的树脂柱径高比1: 8，上样后用合适的有机溶剂洗脱1-3次，优选地用石油醚洗脱I次后，再用乙酸乙酯/丙酮(I: I)洗脱，收集乙酸乙酯/丙酮(I: I)洗脱液，减压浓缩至干，得到洗脱物。在一个优选的实施例中，本发明所述的CO2超临界萃取法包括以下步骤:1)将紫金砂药材粉碎；2)在萃取温度40-50°C、萃取压力30-40MPa时超临界萃取2_5小时，优选在萃取温度45°C、萃取压力35MPa时萃取3小时，优选的超临界萃取装置为HA121-50-01超临界萃取装置，优选以无水乙醇作夹带剂；3)将萃取物减压蒸干，得到超临界萃取提取物，优选将萃取物于40°C减压蒸干。根据需要，本发明的紫金砂及其提取物可以和一种或多种药学上可接受的载体制成药物组合物。优选的药物载体包括药学领域常规的稀释剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、香味剂、甜味剂。任选地，该药物组合物还可以包含其他活性物质，优选的其他活性物质为延胡素生物碱提取物或DL-四氢巴马汀。所述的药物组合物可以制成片剂、胶囊、粉剂、颗粒、锭剂、栓剂，或口服液等多种药物形式。上述不同剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。发明的有益效果本发明提供了紫金砂及其提取物在用于治疗心肌缺血性疾病的用途。在大鼠及兔上的药效学试验结果表明，紫金 砂提取物在缺血前预防给药，连续7天，可有效降低心肌梗死面积，显著提升机体抗氧化能力，有效减少脂质过氧化产物的产生，其作用与公认阳性治疗药物复方丹参滴丸基本相当，表明紫金砂及其提取物在治疗心肌缺血再灌注损伤上具良好应用前景。
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1紫金砂提取物I的制备取紫金砂药材500g粉碎后，用80%乙醇加热回流提取2次，每次提取2小时，溶剂用量为4000ml，合并提取液，减压浓缩至干，得乙醇提取物96g。称取乙醇提取物适量，用紫外可见分光光度测得总香豆素类、色原酮类成分含量总和为29.4%。用高效液相法测得水合氧化前胡素内酯、栓翅芹烯醇、3’(R)-+-亥茅酚、3’ -O-乙酰基亥茅酚、异欧前胡素含量分别为 8.24%,0.68%,0.41%,0.43%,1.89%。实施例2紫金砂提取物2的制备取紫金砂药材50g粉碎后，用甲醇超声提取3次，每次提取0.5小时，溶剂用量为400ml，合并提取液，减压浓缩至干，得甲醇提取物4.2g。称取甲醇提取物适量，用紫外可见分光光度测得香豆素类、色原酮类成分含量总和为26.3%。用高效液相法测得水合氧化前胡素内酯、栓翅芹烯醇、3’(R)-+-亥茅酚、3’ -O-乙酰基亥茅酚、异欧前胡素含量分别为
7.37%,0.63%,0.31%,0.33%、1.61%。实施例3紫金砂提取物3的制备取紫金砂药材IOOg粉碎后，用丙酮冷浸提取2次，每次提取24小时，溶剂用量为IOOOml，合并提取液，减压浓缩至干，得丙酮提取物9.2g。称取丙酮提取物适量，用紫外可见分光光度测得香豆素类、色原酮类成分含量总和为33.5%。用高效液相法测得水合氧化前胡素内酯、栓翅芹烯醇、3’(R)-+-亥茅酚、3’ -O-乙酰基亥茅酚、异欧前胡素含量分别为
9.73%、1.04%,0.86%,0.88%,2.31%。实施例4紫金砂提取物4的制备取紫金砂药材IOOg粉碎后，选用HA121-50-01超临界萃取装置，以200ml无水乙醇作夹带剂，在萃取温度45°C、萃取压力35MPa时提取3小时。将萃取物于40°C减压蒸干，得到超临界萃取提取物5.2g。称取提取物适量，用紫外可见分光光度测得香豆素类、色原酮类成分含量总和为59.38%。用高效液相法测得水合氧化前胡素内酯、栓翅芹烯醇、3，(R)-+-亥茅酚、3’ -O-乙酰基亥茅酚、异欧前胡素含量分别为15.37%、1.28%、1.06%,
0.98%,3.29%。实施例5紫金砂提取物5的制备取实施例1的乙醇提取物25g在50ml水中分散，再用150ml石油醚萃取三次，分别合并萃取液后，减压浓缩至干。称取紫金砂粗提物10g，加入15ml水超声分散，再加入50ml石油醚萃取3次，将水层蒸干，加入10%乙醇溶散，然后上AB-8大孔树脂柱，树脂柱径高比I: 10，上样后用8倍BV的10%乙醇洗去杂质，再用10倍BV的85%乙醇洗脱，收集后者洗脱部分，减压浓缩至干，得到紫金砂提取物。测定香豆素类、色原酮类成分含量总和为78%;水合氧化前胡素内酯、栓翅芹烯醇、3’ R_(+)_亥茅酚、3’ -O-乙酰基亥茅酚、异欧前胡素含量(重量％ )分别为 23.9%U.8%,0.8%,0.6%,2.3%0实施例6紫金砂提取物6的制备取实施例1的乙醇提取物IOg用纯乙醇溶散均匀后以15g硅胶G拌样，上60g硅胶G柱，树脂柱径高比1: 8 ，上样后先用300ml石油醚洗脱，再用500ml的乙酸乙酯/丙酮(I: I)洗脱，分别收集这两部分洗脱液，减压浓缩至干，得到石油醚洗脱物0.56g、乙酸乙酯/丙酮(I: I)洗脱物0.85g。称取乙酸乙酯/丙酮(I: I)洗脱物适量，用紫外可见分光光度测定香豆素类、色原酮类成分含量总和为38.61 %。用高效液相法测定水合氧化前胡素内酯、栓翅芹烯醇、3’(R)-+-亥茅酚、3’ -O-乙酰基亥茅酚、异欧前胡素的含量含量分别为 10.31%, 1.14%,0.68%,0.50%, 1.54%。本发明所述的紫金砂提取物的质量控制方法可包括以下含量测定方法中的一种或两种:1.香豆素类、色原酮类成分总含量测定(紫外分光光度法)对照品溶液的配制:精密称取水合氧化前胡素内酯对照品3.0mg,置于IOml量瓶中，加甲醇使其完全溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。标准曲线的制备:精密吸取对照品溶液2.5ml至25ml容量瓶中，定容。分别吸取
2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,6.7ml，用甲醇稀释定容到IOml量瓶中，摇匀，在307nm波长处测定吸光度。以水合氧化前胡素内酯对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。供试品溶液的配置:取紫金砂提取物适量，加甲醇溶解定容至25ml量瓶中，摇匀。精密吸取1ml，加甲醇定容至IOml量瓶中，摇匀。测定法:取供试品溶液在307nm波长处测定吸光度，按标准曲线法计算样品中香豆素、色原酮类成分总含量，即得。2.水合氧化前胡素内酯、栓翅芹烯醇、3’ (R)-+-亥茅酚、3’ -O-乙酰基亥茅酚、异欧前胡素含量测定(高效液相色谱法)色谱条件:色谱柱:用十八烷基键合硅胶为填充剂；流动相:甲醇-水；流速:
1.0ml/mim ;柱温:室温。洗脱条件如表I所示。
权利要求
1.紫金砂及其提取物在制备用于治疗心肌缺血性疾病的产品和/或药物中的用途。
2.权利要求1的用途，其中所述的心肌缺血性疾病为心肌梗死、缺血再灌注损伤、再狭窄、冠状动脉心脏病、各种原因引发的冠状动脉狭窄及痉挛； 优选地，所述的心肌缺血性疾病为心肌缺血再灌注损伤。
3.权利要求1或2的用途，其中所述提取物中含有香豆素类和色原酮类成分， 优选地，所述香豆素类成分为选自水合氧化前胡素内酯、栓翅芹烯醇、异欧前胡素、奥斯索、佛手柑内酯、欧前胡素、二氢欧山芹素、异虎耳草素、氧化前胡素乙基醚中的一种或多种，所述色原酮类成分为3’ R_(+)_亥茅酚、3’ -O-乙酰基亥茅酚、拐芹色原酮、Iedebouriellol 的一种或多种。
4.权利要求3的用途，其中所述的香豆素类、色原酮类成分含量总和占总提取物的重量百分比为10-90%，优选的重量百分比为20-80%，进一步优选的重量百分为25-78%，更优选的重量百分比26.3-78 %，特别优选的重量百分比为29.4%、26.3%、33.5%、59.38%,78%,38.61%。
5.权利要求3的用途，其中所述的水合氧化前胡素内酯、栓翅芹烯醇、3’(R)-+-亥茅酚、3’ -O-乙酰基亥茅酚、异欧前胡素五种主要成分的总含量占总提取物的重量百分比为0.5-40%，优选的重量百分比为5-35%，进一步优选的重量百分比为10-30%，更优选的重量百分比为10.25-29.4 %，特别优选的重量百分比为11.65 %、10.25 %、14.82 %、21.98%,29.4%,14.17% ； 优选地，水合氧化前胡素内酯、栓翅芹烯醇、3’(R)-+-亥茅酚、3’ -O-乙酰基亥茅酚、异欧前胡素五种主要成分在紫金砂总提取物中的重量百分比含量分别为5-25%、0.5-2%,0.2-1.2%,0.2-1.2%,1.2-3.5%，优选的重量百分比含量分别为 7.37-23.9%,0.63-1.8%,0.31-1.06%,0.33-0.98%,1.54-3.29%。
6.权利要求1-5任一项的用途，其中所述的提取物，其制备方法为溶剂提取法、溶剂萃取法、醇层法、柱色谱法、大孔吸附树脂法、液-液逆流分配色谱法或CO2超临界萃取法等方法中的任意一种,或这些方法的任意组合； 优选的柱色谱为硅胶G柱色谱、大孔树脂柱色谱，优选的大孔树脂为AB-8大孔树脂。
7.权利要求1-5任一项的用途，其中所述的提取物，其制备方法包括以下步骤，I)将紫金砂药材粉碎；2)用合适的溶剂提取1-5次，优选提取2-3次，优选的溶剂是乙醇、甲醇、丙酮、丙醇、异丙醇、乙醇水溶液或甲醇的水溶液等，提取方式可以是加热回流、微波提取、超声提取、冷浸提取等方式；3)合并提取液，浓缩至干，获得紫金砂提取物，优选的浓缩方式为减压浓缩； 任选地，该方法还包括以下步骤: 4)将步骤3)中获得的紫金砂提取物在水中分散，再用合适的溶剂萃取1-6次，优选提取2-5次，进一步优选提取3次，分别合并萃取液后，浓缩至干； 5)将步骤4)中获得的紫金砂粗提物加入水，超声分散，再加入合适的溶剂萃取1-6次，优选提取2-5次，进一步优选提取3次，将水层蒸干，加入乙醇，优选加入5-20%的乙醇水溶液，进一步优选加入8-15%的乙醇水溶液，特别优选加入10%的乙醇水溶液，溶散，然后上大孔树脂柱，树脂柱径高比为1: 8 1: 12，优选的树脂柱径高比为1: 9 1: 11，更优选的树脂柱径高比为1: 10，上样后用6-10倍BV(床容积，bed volume，BV)的乙醇洗去杂质，优选用6-10倍BV的5-20%的乙醇水溶液，进一步优选用6-10倍BV的8-15%的乙醇水溶液，特别优选用8倍BV的10%的乙醇水溶液；再用8-12倍BV的70-90%乙醇洗脱，优选用10倍BV的85%乙醇洗脱，收集后者洗脱部分，浓缩至干，得到紫金砂提取物。
其中优选的溶剂为石油醚，优选的浓缩方式为减压浓缩，优选的大孔树脂为AB-8大孔树脂； 或者，任选地，该方法还包括以下步骤: 4)将步骤3)中获得的紫金砂提取物用纯乙醇溶散均匀后，以硅胶G拌样，上硅胶G柱，树脂柱径高比1: 6 1: 10，优选的树脂柱径高比为1: 9 1: 11，更优选的树脂柱径高比1: 8，上样后用合适的有机溶剂洗脱1-3次，优选地用石油醚洗脱I次后，再用乙酸乙酯/丙酮(I: I)洗脱，收集乙酸乙酯/丙酮(I: I)洗脱液，减压浓缩至干，得到洗脱物。
8.权利要求6的用途，其中所述的CO2超临界萃取法包括以下步骤:1)将紫金砂药材粉碎；2)在萃取温度40-50°C、萃取压力30-40MPa时超临界萃取2_5小时，优选在萃取温度45°C、萃取压力35MPa时萃取3小时，优选的超临界萃取装置为HA121-50-01超临界萃取装置，优选以无水乙醇作夹带剂；3)将萃取物减压蒸干，得到超临界萃取提取物，优选将萃取物于40°C减压蒸干。
9.权利要求1-5任一项的用途，其中所述的药物含有紫金砂及其提取物，和一种或多种药学上可接受的载体，优选的载体包括:稀释剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、香味剂、甜味剂； 任选地，其中所述的药物还包含其他活性物质， 优选的其他活性物质为延胡素生物碱提取物或DL-四氢巴马汀。
10.权利要求9的用途，其中所述的药物为片剂、胶囊、粉剂、颗粒、锭剂、栓剂，或口服液。
全文摘要
本发明公开了紫金砂提取物的新用途。发明人通过实验证实，不同剂量紫金砂提取物口服预先给药后，可有效阻止或缓解心肌缺血再灌注所导致的心肌损伤。
文档编号A61K36/232GK103156893SQ201110408540
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月9日 优先权日2011年12月9日
发明者王永安, 于能江, 杨郁, 李万华, 骆媛, 关雷, 刘艳芹 申请人:中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所