专利名称：一种利用发酵牛胆汁和复合胆红素钙制备牛胆结石的方法
一种利用发酵牛胆汁和复合胆红素钙制备牛胆结石的方法技术领域
本发明属于制药技术领域，涉及一种中药原料药的制造方法，尤其涉及一种制备牛胆结石的方法。
背景技术：
牛胆结石即牛黄，是珍贵的中药材。它具有清心、豁痰、开窍、凉肝、息风、解毒等功效。我国许多名贵中成药，如安宫牛黄丸、六神丸等均以牛黄为主药配制而成。但是牛体内自然成石率仅为广2%，因此，药用资源非常稀缺，价格昂贵，依赖进口，不仅花费了大量的外汇，而且也制约了我国传统医药工业的发展。
1956年以来，我国的医药工作者积极从事人工牛黄的研究，1971年人工牛黄应用于中成药组方中，部分缓解了天然牛黄的供需矛盾。但这种人工牛黄主要是胆酸、猪去氧胆酸和极微量的胆红素以及大量淀粉研末过筛而得的粉末，不是牛胆结石，其成份、结构、含量及已知各种微量成份均与天然牛黄相差太远，不具备天然牛黄的性状、结构、成份、含量特征，临床疗效远不及天然牛黄。
上世纪70年代以来，我国云南、广东、内蒙等地的医药工作者，在活牛胆囊内培植牛黄的实验研究获得了成功。但需对牛体进行剖腹手术并且该手术比较复杂，而且2 3年才能剖腹取出尼龙丝网，刮下棕黄色附着物。成石率低，产量小，胆红素含量低，质量不稳定。而且，此产品并不是牛胆结石，而是沉积在尼龙丝网上的棕黄色胆色素钙颗粒及粘液。 刮下干燥后所形成的粉末。因此，不可能规模化生产。
上世纪70年代初，武汉同济医科大学附属同济医院肝胆外科蔡红娇医师在对人类胆结石形成的原因和机理进行研究，并获得成功的基础上，进一步用此原理进行牛胆囊胆汁内培育牛胆结石的研究，取得了成功并于1989年申报了 “一种人工体外制作牛胆结石的方法”的发明专利(申请号89100505. 6)。利用该方法制作的牛胆结石，其外观、结构、成份、含量与天然牛黄基本相同。但是限于当时的条件，特别是1985版《中国药典》对牛黄的胆酸、胆红素含量未作规定，因此，其制成的牛胆结石的胆红素、胆酸等含量较低。不仅如此，上述方法除配方的牛胆汁之外，制备胆红素钙，多用猪胆汁代替，胆汁未经细菌发酵即可以成石。因此，其制成的牛胆结石却含有猪去氧胆酸。中国药典1990年版一部明确规定 牛黄是牛胆结石，含胆红素35%以上，胆酸6%以上，并规定了相应的鉴别和检测方法。因此用上述方法制成的牛胆结石不能满足新的《中国药典》对牛胆结石规定的药用要求。
2000年，由武汉大鹏药业有限公司组织科研人员在ZL89100505. 6发明专利的基础上，根据1990年版《中国药典》要求，研制了一种新的在牛体外制备牛胆结石(即体外培育牛黄)的方法。该方法既适应规模化生产要求，生产出的产品又能满足新的《中国药典》 要求。并于2001年申报了专利(申请号01133550. 5)。该方法是在牛胆汁加入一定量的大肠杆菌、肠球菌、变形杆菌的单一菌液或其组合菌液，对牛胆汁进行细菌发酵处理。再利用发酵牛胆汁和澄清饱和钙盐溶液制取有效成份的沉淀物，然后根据药用要求加入适量的胆红素、胆酸、去氧胆酸和无机盐后，制作复合胆红素钙。再利用复合胆红素钙和发酵牛胆汁在体外培育牛胆结石。由于现在生产规模不断扩大，原方法中的有效成份容易分解，外形不均一，自然干燥方式周期太长，已不能适应更大规模的工业化生产要求。发明内容
本发明是在ZL01133550. 5发明专利的基础上，根据更大规模的工业化生产要求和成本控制原则而研制的一种生产周期更短，成本更低的在牛体外制作牛胆结石(即体外培育牛黄)的方法。
本发明的技术方案如下1、制备成石胆汁在15 37°C下，每千克干燥的复合胆红素钙混合发酵牛胆汁50(Tl500ml、0. 4g 1. 2g 焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠或硫代硫酸钠的单一组份或其混合物作为抗氧剂，再按发酵牛胆汁纯化水(广3) 1的体积比例加入纯化水，充分搅拌后，静置，制成成石胆汁；2、培育牛胆结石对成石胆汁用酸液调节PH值在6. 8以下，然后对成石胆汁进行偏轴定向旋转，待形成类球形结石后，停止旋转，静置培育，取出结石；3、牛胆结石的整形取出结石，放入整形机中，在转速300 500转/分钟，温度18l6°C的条件下整形15 30 分钟，4、牛胆结石的低温真空干燥将整形后的牛胆结石放入低温真空干燥箱中，在温度2(T40 °C，真空度 0. 015 0. 045MPa的条件下干燥18 30小时。
抗氧剂是一类能够有效阻止或延缓自动氧化的物质，主要用于防止药物的氧化变质。药物的氧化反应是引起药物不稳定的主要因素之一。胆红素的氧化分解是含有自由基的自氧化过程，在这一过程中仅有很少的氧就能引起反应。而空气中的氧气占21% (ν/ν), 在如此多氧的存在下，胆红素不需要其他氧化剂的参与，室温就能自发引起“自氧化反应”。 这种反应的过程很复杂，属于游离基诱发的“链反应”，光和热能加速这种反应的进行，微量的金属离子或过氧化物也会催化这种反应。在自氧化过程中，抗氧剂的作用是提供电子或有效氢离子，供给自由基接受，使自氧化链反应中断。胆红素氧化的结果，使有效成份的含量降低，影响了产品疗效。抗氧剂本身是一种还原剂，与有效成份同时存在时，抗氧剂遇氧后首先被氧化，对易氧化的有效成份起到保护作用，从而保证有效成份的稳定性。因此，为了抑制氧分子对氧化反应的作用，就有必要加入抗氧剂。
成形后的牛胆结石在整形机中不断地、连续地、重复地做出复杂的多轨迹运动，从而使牛胆结石表面坚固、致密、平整、光滑，有效地改善了产品的均一性，提高了成品率，杜绝了表面物料的脱落，减少了有效成份的损耗，提高了产品质量。
根据2010版《中国药典》的规定，体外培育牛黄的水分应控制在9%以下。牛胆结石中的水分子在负压的环境下，沸点降低，从而能够在较低的温度下迅速从产品的孔隙中变成气态并被抽走，最终能够在较短的周期内达到干燥的目的，符合2010版《中国药典》的要求。而且，始终保持低温环境，也最大程度地避免了胆红素等有效成份的降解。
本发明方法中的发酵牛胆汁按照现有技术中方法制备，一般包括如下步骤(1)调节天然牛胆汁中的牛磺酸含量，使其达到药用要求39Γ7%，(2)将大肠杆菌、变形杆菌或肠球菌的单一菌液或其组合菌液接种到牛胆汁中，进行发酵处理。
本发明方法中的复合胆红素钙按照现有技术中方法制备，一般包括如下步骤(1)取出一定量的发酵牛胆汁，加入广4倍体积的澄清饱和氧化钙溶液，对其进行搅拌，加热至沸腾，滤取棕红色沉淀物；(2)在棕红色沉淀物中，加入适量水对其搅拌、洗涤，静置后滤去上清液，再依据药用要求加入适量的胆红素、胆酸、去氧胆酸和无机盐，搅拌混勻。
根据本发明制备的牛胆结石各项指标均符合2010版《中国药典》关于体外培育牛黄的要求，而且生产周期大大缩短，有效减少了能源耗用，成本明显下降。具有较好的社会效益和经济效益。
图1利用发酵牛胆汁和复合胆红素钙制备牛胆结石的工艺流程图。
具体实施方式
实施例1(1)制备发酵牛胆汁①取出新鲜牛胆汁，按优质牛黄的要求，调节牛磺酸含量使其达到7%(g/ml)，置于消毒罐内，低温保存备用。
②将牛胆汁置于发酵罐，按每10000ml牛胆汁接种IOOml菌体溶液的比例，将大肠杆菌和变形杆菌的组合菌液接种至牛胆汁中，发酵80小时，即得。
(2)制备复合胆红素钙①取发酵牛胆汁10000ml加入11000ml澄清饱和氧化钙溶液，搅拌、煮沸，冷却后，取出棕红色沉淀物。
②棕红色沉淀物加纯化水10000 ml，充分搅拌，静置后倾去上清液，每569g沉淀 (干重)加入胆红素350g，再加入胆酸50g、去氧胆酸25g、硫酸锌3g、硫酸镁3g，搅拌、混勻。
(3)取500ml的发酵牛胆汁，在37°C下加入到IKg的复合胆红素钙中(复合胆红素按干燥后的重量计算)，再加入0. 4g焦亚硫酸钠，再加入500ml纯化水，充分搅拌后，静置， 制成成石胆汁。成石胆汁用酸液进行PH调节，使其PH值在6.0以下。然后对成石胆汁进行偏轴定向旋转，待其形成类球形结石后，停止旋转，静置培育，取出结石。
(4)取出结石，放入整形机中，调整转速至300转/分钟，在温度18°C、相对湿度 60%的条件下整形15分钟，取出结石。
(5)将整形后的结石放入低温真空干燥箱中，在温度20°C，真空度0. 015MPa的条件下干燥30小时。即得牛胆结石成品。
上述成品呈均一的球形，直径0. 5-3cm，表面光滑，呈黄红色至棕黄色。体轻，质松脆，断面有同心层纹。经紫外分光光度计检测胆红素含量，薄层扫描仪检测胆酸含量，符合 《中国药典》2010版P162中体外培育牛黄的标准规定。
实施例2(1)制备发酵牛胆汁①杀牛时，在无菌操作重要条件下，摘取胆囊，先用无杂质、未受污染、金黄色者，倾出胆汁于消毒罐内，按优质牛黄的要求，调节牛磺酸含量使其达到6% (g/ml)，低温保存备用。
②将牛胆汁置于发酵罐，按每10000ml牛胆汁接种200ml菌体溶液的比例，将大肠杆菌接种至牛胆汁中，发酵96小时，即得。
(2)制备复合胆红素钙①取发酵牛胆汁10000ml加入30000ml澄清饱和氧化钙溶液，搅拌、煮沸，冷却至50°C， 取出棕红色沉淀物。
②棕红色沉淀物加冷开水10000 ml，充分搅拌，静置后倾去上清液，每390g沉淀物(干重)加入胆红素450g，再加入胆酸100g、去氧胆酸50g、硫酸锌5g、硫酸镁5g，搅拌、混勻，即得。
(3)取IOOOml的发酵牛胆汁，在下加入到IKg的复合胆红素钙中(复合胆红素按干燥后的重量计算)，再加入0. Sg亚硫酸氢钠，再加入500ml纯化水，充分搅拌后，静置， 制成成石胆汁。成石胆汁用酸液进行PH调节，使其PH值在6. 4以下。然后对成石胆汁进行偏轴定向旋转，待其形成类球形结石后，停止旋转，静置培育，取出结石。
(4)取出结石，放入整形机中，调整转速至400转/分钟，在温度22°C、相对湿度 65%的条件下整形15分钟，取出结石。
(5)将整形后的结石放入低温真空干燥箱中，在温度30°C，真空度0. 03MPa的条件下干燥M小时。即得牛胆结石成品。
上述成品呈均一的球形，直径0. 5-3cm，表面光滑，呈黄红色至棕黄色。体轻，质松脆，断面有同心层纹。经紫外分光光度计检测胆红素含量，薄层扫描仪检测胆酸含量，符合 《中国药典》2010版P162中体外培育牛黄的标准规定。
实施例3(1)制备发酵牛胆汁①取出新鲜牛胆汁，置于消毒罐内，低温保存备用。
②将牛胆汁置于发酵罐，按每10000ml牛胆汁接种300ml菌体溶液的比例，将肠球菌接种至牛胆汁中，发酵92小时，即得。
(2)制备复合胆红素钙①取发酵牛胆汁10000ml，滤过加入40000ml澄清饱和氧化钙溶液，搅拌、煮沸，冷却后取出棕红色沉淀物。
②棕红色沉淀物加水充分搅拌，静置后倾去上清液，每213g沉淀物(干重)加入胆红素550g，加入胆酸150g、去氧胆酸75g、硫酸锌6g、硫酸镁6g，搅拌、混勻，即得。
(3)取1500ml的发酵牛胆汁，在15°C下加入到IKg的复合胆红素钙中(复合胆红素按干燥后的重量计算)，再加入1. 2g硫代硫酸钠，再加入500ml纯化水，充分搅拌后，静置， 制成成石胆汁。成石胆汁用酸液进行PH调节，使其PH值在6. 8以下。然后对成石胆汁进行偏轴定向旋转，待其形成类球形结石后，停止旋转，静置培育，取出结石。
(4)取出结石，放入整形机中，调整转速至500转/分钟，在温度^°C、相对湿度 70%的条件下整形15分钟，取出结石。
(5)将整形后的结石放入低温真空干燥箱中，在温度40°C，真空度0. 045MPa的条件下干燥18小时。即得牛胆结石成品。
上述成品呈均一的球形，直径0. 5-3cm，表面光滑，呈黄红色至棕黄色。体轻，质松脆，断面有同心层纹。经紫外分光光度计检测胆红素含量，薄层扫描仪检测胆酸含量，符合 《中国药典》2010版P162中体外培育牛黄的标准规定。
权利要求
1.一种利用发酵牛胆汁和复合胆红素钙制备牛胆结石的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)制备成石胆汁在15 37°C下，每千克干燥的复合胆红素钙混合发酵牛胆汁50(Tl500ml、0. 4g^l. 2g 焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠或硫代硫酸钠的单一组份或其混合物作为抗氧剂，再按发酵牛胆汁纯化水(广3) 1的体积比例加入纯化水，充分搅拌后，静置，制成成石胆汁；(2)培育牛胆结石对成石胆汁用酸液调节PH值在6. 8以下，然后对成石胆汁进行偏轴定向旋转，待形成类球形结石后，停止旋转，静置培育，取出结石；(3)牛胆结石的整形取出结石，放入整形机中，在转速300 500转/分钟，温度18l6°C的条件下整形15 30 分钟，(4)牛胆结石的低温真空干燥将整形后的牛胆结石放入低温真空干燥箱中，在温度2(T40 °C，真空度 0. 015 0. 045MPa的条件下干燥18 30小时。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的发酵牛胆汁的制备，包括调节天然牛胆汁中的牛磺酸含量，使其达到药用要求；将大肠杆菌、变形杆菌或肠球菌的单一菌液或其组合菌液接种到牛胆汁中，进行发酵处理。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述的复合胆红素钙的制备，包括如下步骤(1)取出一定量的发酵牛胆汁，加入广4倍体积的澄清饱和氧化钙溶液，对其进行搅拌，加热至沸腾，滤取棕红色沉淀物；(2)在棕红色沉淀物中，加入适量水对其搅拌、洗涤，静置后滤去上清液，再依据药用要求加入适量的胆红素、胆酸、去氧胆酸和无机盐，搅拌混勻。
全文摘要
本发明涉及一种利用发酵牛胆汁和复合胆红素钙制备牛胆结石的方法。在15~37℃下，每千克干燥的复合胆红素钙混合发酵牛胆汁500~1500ml、0.4g~1.2g焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠或硫代硫酸钠的单一组份或其混合物作为抗氧剂，再按发酵牛胆汁纯化水(1~3)1的体积比例加入纯化水，充分搅拌后，静置，制成成石胆汁；对成石胆汁用酸液调节pH值在6.8以下，然后对成石胆汁进行偏轴定向旋转，待形成类球形结石后，停止旋转，静置培育，取出结石；对结石进行整形和干燥，得到成品牛胆结石。该方法添加抗氧剂，对易氧化的有效成份起到保护作用。
文档编号A61K35/413GK102512451SQ201110430840
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月21日 优先权日2011年12月21日
发明者石聿新, 罗张龙, 蔡红娇 申请人:武汉健民大鹏药业有限公司