专利名称：木犀草素的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及木犀草素，具体涉及一种木犀草素的新用途。
背景技术：
脂肪肝现已成为我国发病率上升最快的慢性疾病。近年来查出脂肪肝的比例逐年上升，人群中发病率为5%，并且还有年轻化的趋势。专家指出，40%以上肥胖人都患有脂肪肝，营养过剩、酗酒、糖尿病是致病主要因素，其他疾病也可导致脂肪肝，比如结核病、严重贫血、肺心病等；另外，某些药物或毒物也可致脂肪肝。脂肪肝的危害很多，主要包括(1) 形成肝纤维化、肝硬化。肝细胞中脂滴增多，使肝细胞脂肪变性，长期的肝细胞变性会导致肝细胞再生障碍和坏死，进而形成肝纤维化、肝硬化。(2)诱发或加重高血压、冠心病、动脉粥样硬化。脂肪肝的病情进展研究表明，酒精性脂肪肝患者多合并高血压、冠心病，容易导致心肌梗死。(3)脑病脂肪肝综合征。一些发生脂肪肝的肥胖者常常表现为恶性肥胖，这类病人极易并发致命性心脑血管疾病。(4)诱发或加重糖尿病。据调查，糖尿病患者中合并脂肪肝的约50%，脂肪肝患者中合并糖尿病的为30% 40%。(5)诱发肝癌。脂肪肝与原发性肝癌的发生虽无直接关系，但是脂肪肝的病因，如饮酒、营养不良、药物作用及有毒物质损害等，可诱发肝癌。因此，脂肪肝也可增加肝癌的发病几率。脂肪肝属于肝脏代谢障碍性疾病，故是可逆的，经合理治疗后完全可以恢复正常。 现除饮食、运动疗法外，多使用药物治疗，主要的治疗药物包括(1)保肝类药物。保肝治疗是大多数脂肪肝患者所不可缺少的治疗措施，一经确诊脂肪肝，在病因治疗及饮食疗法的同时都应辅以保肝药物，以利于肝功能的尽快恢复。常用的保肝药有肝太乐、维生素C、肌苷等。(2)降脂类药物。脂肪肝患者因脂肪代谢障碍，体内甘油三酯及胆固醇均有不同程度升高，且常伴有高脂血症。故不可避免地需要降脂药物，如多烯康、绞股兰总甙、降脂灵、烟酸肌醇酯和蛋氨酸等。也可以服一些祛脂中草药。(3)其它辅助药物。脂肪肝患者常伴有维生素缺乏，故还应服用维生素C、维生素B12、叶酸等，维生素C可以促进胆固醇的分解、转化，能加强肝脏去除胆固醇的作用。核黄素、吡哆酸等也有去脂作用。当患者伴有消化道不适症状如恶心、食欲不振、腹胀、便秘或稀便时，可以给予对症治疗，口服酵母片等相应的对症药物。目前，临床常用降脂类药物主要包括(1)他汀类。三甲基戊二酰辅酶A (HMG -CoA)还原酶抑制剂，即胆固醇生物合成酶抑制剂(他汀类药物)，是细胞内胆固醇合成限速酶，即HMG - CoA还原酶的抑制剂，为目前临床上应用最广泛的一类调脂药物。由于这类药物的英文名称均含有“statin”，故常简称为他汀类。近年来，他汀类药物常被被发现有严重的毒副作用。2001年曾发生轰动一时的“拜斯亭”事件。我国国家药品监督管理局与2001 年8月9日发出紧急通知，禁止使用西立伐他汀钠(拜斯亭)。据悉，他汀类药上市以来，全世界仅有600万人用过它；而拜斯亭作为他汀类药之一，因毒副作用过大导致30多个美国人失去生命。最近一段时期，国外媒体纷纷报道他汀类药在降脂的同时，也带来了肝功下降、肌肉疼痛等毒副作用。(2)贝特类。贝特类药物的主要适应症为高甘油三酯血症或以甘油三酯升高为主的混合型高脂血症。目前临床应用的贝特类药物，主要有环丙贝特、苯扎贝特、非诺贝特及吉非贝齐。据临床实践，这些药物可有效降低甘油三酯22% 43%，而降低TC仅为6% 15%，且有不同程度升高高密度脂蛋白的作用。该药的不良反应为胃肠反应、恶心、腹泻，有报道长期使用可导致肝损害。(3)烟酸类。烟酸类药物属B族维生素，当用量超过其作为维生素作用的剂量时，可有明显的降脂作用。该类药物的适用范围较广，可用于除纯合子型家族性高胆固醇血症，及I型高脂蛋白血症以外的任何类型高脂血症。但是，该药的速释制剂不良反应大，一般不单独应用。(4)胆酸螯合剂。这类药物也称为胆酸隔置剂。有考来烯胺(Cholestyramine)，常用药物有降胆宁。该药常见的不良反应为胃肠反应、恶心、便秘或腹泻，肠梗阻或头痛等。(5)胆固醇吸收抑制剂。此类药物主要通过抑制肠道内饮食和胆汁中胆固醇的吸收，来达到降低血脂的目的。目前，该类药物上市很少。木犀草素(luteolin)是一种天然黄酮类化合物，存在于多种植物中。具有多种药理活性，如消炎、抗过敏、抗肿瘤、抗菌、抗病毒等，临床主要用于止咳、祛痰、消炎、治疗心血管疾病、治疗“肌萎缩性脊髓侧索硬化症”，SARS，肝炎等。但在治疗脂肪肝疾病中，没有任何研究和报道。
发明内容
发明目的针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种木犀草素的新用途，以实现使其在制备治疗脂肪肝药物中有广泛的应用。技术方案为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下 一种木犀草素的新用途，为在制备用于治疗脂肪肝药物中的应用。一种用于治疗脂肪肝的药物，有效成分为木犀草素。木犀草素，化学名3’，4’，5，7-四羟黄酮，别名黄色黄素、黄示灵， CasNo 491-70-3，化学式=C15H10O6,分子量286. 23。物理性状黄色针状结晶，熔点 3^-330°C。微溶于水，具弱酸性，可溶于碱性溶液中，正常条件下稳定。木犀草素多以糖苷的形式存在于多种植物中，这些植物以全叶青兰、辣椒、野菊花、金银花、紫苏含量较高，具有镇咳和祛痰作用。研究表明，木犀草素抑制巨噬细胞磷酸化，抑制转录因子NF-kB的活性，能够抑制脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞产生细胞因子IL-6、TNF-a。木犀草素还能提高 IFN- γ，降低特异性Ig-E，减少嗜酸性粒细胞的浸润。另外，木犀草素除了抗炎、抗过敏作用以外，还具有抑制PDE、抗SARS、HIV病毒特性。本发明，通过动物实验表明，木犀草素可以降低血液中胆固醇和甘油三酯的增加， 减少肝脏中甘油三酯的合成，从而阻断了肝脏中脂质堆积的来源，在制备用于治疗脂肪肝药物中将有广泛的用途。有益效果与现有的用于治疗脂肪肝药物相比，本发明的木犀草素类治疗脂肪肝药物具有的突出优点包括通过动物实验表明，木犀草素可以降低血液中胆固醇和甘油三酯的含量，减少肝脏中甘油三酯的合成，从而阻断了肝脏中脂质堆积的来源，在制备用于治疗脂肪肝药物中将有广泛的用途；具有很好的实用性，能够产生较好的经济效益和社会效
图1是小鼠给药干预8周后的血脂含量图2是小鼠给药干预8周后的肝脏中的甘油三酯含量图； 图3是各组小鼠的随机血糖含量图； 图4是各组小鼠禁食1 后的糖耐量结果图； 图5是给药干预8周后各组小鼠肝脏的特征图6是给药干预8周后各组小鼠肝脏的超声影像图(A)、肝脏中的脂质图(B)、肝脏中糖原图(C)和脂肪组织图(D);
图7是通过western blot方法检测脂肪酸合成的限速酶的表达结果图； 图8是木犀草素对人肝癌细胞系HepG2和小鼠原代肝细胞的脂质合成中的影响结果图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。实施例1
(1)木犀草素购自中国药品生物制品检定所，非酒精性脂肪性肝自发性动物模型db/db 小鼠购自南京大学模式动物所。(2)实验组db/db小鼠雄性，6周龄，体重^ 33g/只；分组共18只，随机分成 3组，每组6只。同窝阴性小鼠(C57BL/KsJ)雄性，6周龄，体重18 22g/只；分组共6只， 作为对照组。(3)给药处理腹腔注射给药，20mg/kg/只或100mg/kg/只，每两天给药一次，持续给药6、周。(4)血样的采集眼眦取血，置于肝素钠抗凝的干燥0. 5ml EP管中，3000r/min，离心5min，每只小鼠每次取血清20ul，用于小鼠血脂的检测。结果血脂含量如图1所示，甘油三酯含量如图2所示。db/db小鼠作为一个自发肥胖的动物模型，血液中的胆固醇和甘油三酯是显著性增加的。在db/db小鼠连续给药干预后，进行的血脂的常规检测中，发现木犀草素可以减少血液中胆固醇和甘油三酯的增加，同时也阻断了肝脏中脂质堆积的来源。(5)血糖的测定通过尾静脉微创采血，采用雅培安妥血糖仪进行小鼠血糖的检测。测量随机血糖结果如图3所示。由于db/db小鼠是自发高血糖模型，过度摄取含糖量较高的食物也会导致肥胖。通过检测木犀草素对db/db小鼠血糖的作用实验，结果表明木犀草素可以增加葡萄糖的摄取，而这部分摄入体内的葡萄糖以糖原的形式贮存在肝脏内， 并没有大量的转化为脂肪，而对照组小鼠结果相反。(6)腹腔葡萄糖耐量实验采用经腹腔注射2g/kg葡萄糖的方法，分别监测注射后 0、15、30、60和120min时的小鼠血糖的变化情况。糖耐量结果如图4所示。在持续给药过程中，通过小动物B超仪也多次观测活体内脂肪肝的发展情况，同时在给药8周时，取出小鼠的肝脏和脂肪进行了切片检测和肝脏蛋白western检测。(7)小鼠肝脏的B型超声成像选用VEV02100小动物超声仪进行活体脂肪肝的实时诊断与监测；
(8)肝脏的油红0和苏木素的复合染色先用D-hanks将样本细胞或者组织切片冲洗充分，然后加入油红稀释染色1(Γ15分钟，接下来用75%的乙醇溶液将样本分化至间质清
5晰，然后蒸馏水冲，最后再用苏木素对细胞核部分进行复染，并于100倍镜下观察拍照。以每组样本随机选取5 10视野进行拍照观察以考察脂质积累的效果。(9)肝脏的糖原颜色肝脏标本切片，以过碘酸-Schiff氏法(PAS)行肝糖原染色， 镜下观察切片，以每组样本随机选取5 10视野进行拍照观察以考察肝脏中糖原的含量。(10)脂肪组织的苏木素-伊红(HE)染色将脂肪组织切片至于60°C烘箱4 ，95% 酒精固定，苏木素染色15min后，进行盐酸酒精分化，室温返蓝lOmin，伊红染色5min，脱水， 封片。(Il)Western bolt 将取出的新鲜肝脏标本，放人液氮中，转至_80°C保存。用组织裂解法提取蛋白后-20°C保存，用考马斯亮蓝法测量蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳采用 39 g/L浓缩胶、100 g/L分离胶，上样量50 μ g，蛋白Marker 5 μ L，电压60 V待蛋白跑出浓缩胶后调至120 V，电泳结束后取出凝胶，用Quantity One软件分析光密度值。在持续给药过程中，通过小动物B超仪多次观测活体内脂肪肝的发展情况，同时在给药8周时，取出小鼠的肝脏和脂肪进行了切片检测和肝脏蛋白western检测。给药干预8周后各组小鼠肝脏的特征图如图5所示，给药干预8周后各组小鼠肝脏各项检测指标如图6所示，其中A图为超声影像，B图为肝脏中的脂质，C图为肝脏中糖原，D图为脂肪组织；通过western blot方法检测小鼠肝脏中脂肪合成相关蛋白的表达情况，结果如图7所示；各实验结果表明木犀草素可以减少db/db小鼠肝脏中的脂肪酸合成相关基因的表达和脂肪堆积，显著性的改善自发性的脂肪肝。实施例2
原代肝细胞的分离与培养将C57BL/KsJ小鼠腹腔注射1%的戊巴比妥钠进行麻醉处理，从小鼠的门静脉插管并且间断下腔静脉后，以2ml/min流速灌入Kreb溶液，待肝脏内的血液冲洗干净后，继续以anl/min流速灌入胶原酶IV 30ml。待肝脏充分消化后，将组织块剪碎，加入DMEM完全培养液50ml终止消化并且充分混勻，以200目筛子过滤。以50G/min 离心5min，浓缩肝细胞。为了在细胞水平观察到较为明显的脂肪积累，预先采用了肝脏X受体激动剂 T0901317对H印G2细胞和小鼠原代肝细胞进行处理，在处理4 后，进行了苏木素-油红染色。实验结果如图8所示，结果表明，激动剂T1317可以激活肝脏X受体的活性，上调下游的脂肪酸合成相关基因，从而使细胞内的脂肪酸和甘油三酯的含量增加。但在观察过程中， 经过木犀草素和激动剂T1317共同处理的细胞内的脂质含量明显少于T1317处理组。说明了木犀草素可以减少肝脏细胞中的脂质合成。与现有的预防与治疗脂肪肝的药物相比，天然化合物木犀草素具有明显的优势， 药效明显、毒副作用小。
权利要求
1.木犀草素在制备用于治疗脂肪肝药物中的应用。
2.一种用于治疗脂肪肝的药物，其特征在于有效成分为木犀草素。
全文摘要
本发明公开了一种木犀草素的新用途，该新用途为在制备用于治疗脂肪肝药物中的应用。通过动物实验表明，木犀草素可以降低血液中胆固醇和甘油三酯的含量，减少肝脏中甘油三酯的合成，从而阻断了肝脏中脂质堆积的来源，在制备用于治疗脂肪肝药物中将有广泛的用途；具有很好的实用性，能够产生较好的经济效益和社会效应。
文档编号A61P1/16GK102552238SQ20111043087
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月21日 优先权日2011年12月21日
发明者吴越, 孙玉洁, 朱云霞, 韩晓, 高璐 申请人:南京医科大学