miR-223的新用途的制作方法

专利名称：miR-223的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及miR-223的新用途。
技术背景
在2000年，随着人类基因组计划(human genome project, HGP)中人类基因 组草图绘制工作的完成，揭开了组成人体10万个基因的30亿个碱基对的秘密。研究 人员发现编码基因的数目大约2-2. 5万左右，只占整个基因组长度的1.5%，而剩下 的98. 5 %为非编码序列。非编码RNA包括核糖体RNA (rRNA)、转运RNA (tRNA)在内的 组成性表达RNA (constructive RNA)和小干扰RNA (siRNA)、microRNA在内的调控性 RNA(regulatoryRNA)。MicroRNA这种非编码调控RNA，是由机体自我产生，具有18-25个碱 基，主要通过与靶基因信使RNA(mRNA)3’非翻译区(3’ -UTR)配对结合来实现对基因的调 控。microRNA在个体的生长发育、细胞分化凋亡、疾病发生、免疫调节等过程起着重要作用， 它可以以转录水平或者转录后水平方式调节其他基因的表达。目前，根据miRNA数据库显 示miRNA总数达五千个左右，miR-223就是其中的一个。肿瘤是危害人类身体健康的首要疾病之一，据报道癌症患者的平均生存率仅为5 年，而癌症治愈率只有20% -30%左右。过去十年我国虽然在肿瘤的防治方面取得了很大 进展，出现了许多新技术新方法，发展了多种抗肿瘤免疫治疗，但到目前为止，这些方法远 没有达到人们的预期效果，一个重要的原因就是缺少生物治疗。目前肿瘤治疗中发展最为 迅速的一个领域是靶向药物治疗，被大家广泛重视，同时基因治疗代表着未来肿瘤防治方 向。髓系来源抑制细胞(MDSC)是近来研究发现在肿瘤患者体内大量聚积的一类细 胞，参与肿瘤细胞的免疫编辑，包括免疫清除，免疫对抗，免疫逃逸三个过程，其在人类外 周血的增高表达已经在肾细胞癌，乳腺癌，结肠癌等中得到证实。在小鼠模型中，MDSCs 可积聚在骨髓、脾和外周血中。MDSCs是一群具有高度异质性的髓系细胞群体，包括包括 1/3为末成熟巨噬细胞和树突样细胞，其他的是处于分化早期的髓系细胞。MDSCs在人表 达为⑶33+HLAT)R-细胞，在小鼠表达为CDllb+Gr-Γ细胞。小鼠⑶llb+Gr-Γ细胞通过形 态学、分子组成和功能学三方面分成了两个亚型单核细胞型(MO-MDSCs)类似炎症性的 单核细胞，表达Ly6C标记；低密度的多形核白细胞型(PMN-MDSCs)类似不成熟的白细胞， 表达Ly6G标记，它们都对T淋巴细胞有抑制作用。研究发现在小鼠⑶llb+Gr-Γ细胞中 白介素-10 (IL-10)，转化生长因子β (TGF- β )，白介素_6 (IL-6)，血管内皮细胞生长因子 (VEGF)，类前列腺素，前列腺素E2(PGE2)和基质细胞衍生因子α (SDF α )这些肿瘤相关因 子的释放抑制了免疫调节细胞的成熟和分化，从而影响了细胞分化的正常途径，导致MDSCs 的大量积聚。但是目前对于遗传因素究竟如何影响MDSCs在肿瘤细胞中积聚的机制还没有 具体阐明。肿瘤患者体内大量积聚髓系来源抑制细胞(MDSCs)，这类细胞可造成肿瘤细胞的 免疫逃逸。虽然具体抑制免疫的机制尚不明确，但MDSCs可抑制淋巴细胞的增殖并促使其凋亡；另外MDSCs可通过影响一氧化氮合酶、精氨酸酶的活性来影响肿瘤的生长。因此通过 降低这群细胞，或促使其分化，可有助于肿瘤免疫激活，将是很有前景的肿瘤免疫辅助治疗方法。因此，发现和研究可以抑制MDSCs在肿瘤细胞中积聚的因子对于肿瘤的预防、治
疗等方面有着重要的意义。

发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供miR-223的新用途。为解决上述技术问题，本发明的技术方案是miR-223具有抑制髓系来源抑制细胞积聚的用途。优选的，所述miR-223通过阻碍髓系来源抑制细胞(MDSCs)的积聚从而具有抑制 肿瘤生长的用途。优选的，所述肿瘤为肾细胞癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌或卵巢癌。优选的，所述肿瘤为结肠癌、肺癌或卵巢癌。优选的，所述肿瘤为结肠癌。优选的，所述miR-223在制备用于抑制肿瘤生长的药物中的用途，即制备以 miR-223为靶点的药物来抑制肿瘤生长。优选的，所述miR-223在制备用于抑制结肠癌、肺癌或卵巢癌生长的药物中的用途。优选的，所述miR-223在制备用于抑制结肠癌生长的药物中的用途。本发明的有益效果是本发明利用现代生物学技术和生物信息学分析对miR-223的功能进行了初步研 究，发现miR-223具有抑制MDSCs的功能，进而发现miR-223具有抑制肿瘤生长的用途， 可以将miR-223设计为靶向药物来治疗肿瘤，对肿瘤临床免疫治疗有着潜在的巨大应用价 值，并且为进一步研究miR-223的生物学功能奠定了基础。


图1是；实施例中所使用的引物图谱；图2是流式细胞分析对MDSCs分群结果图谱；图3是肿瘤鼠体内MDSCs对miR-223的抑制图谱；图4是miR-223在不同实验模型中的表达图谱；图5是不同miRNA对MDSCs积累的影响图谱；图6是miR-223及其抑制剂对MDSCs积累的影响图谱；图7是不同实验模型中MDSCs表达图谱；图8是miR-223及其抑制剂对MO-MDSCs和PMN-MDSCs积累的影响图谱；图9是MEF2C对MDSCs积累的影响图谱；图10是MEF2C对MDSCs不同亚群细胞的积累的影响图谱；图 11 是MEF2C 图谱；图12是miR-223对靶分子MEF2C表达的影响验证图谱；
图 13 是miR-223、miR-223 抑制剂、MEF2C3，UTR 及 MEF2C3，UTR 突变体及对 MDSCs 的影响图谱；图14是miR-223抑制剂对肿瘤鼠体内Grl+⑶lib+细胞分化的影响图谱；图15是不同肿瘤细胞上清和PGE2对MDSCs的分化的影响图谱；图16是与不同肿瘤细胞上清和PGE2共培养的BMCs中miR-223前体、成熟miR-223及MEF2C表达水平随时间变化的图谱；图17是miR-223、MEF2C对BMCs分化的影响图谱；图18是miR-223与肿瘤生长速度关系图谱。
具体实施例方式为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图及具体实 施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。实施例1构建肿瘤小鼠模型、BMCs的制备以及miRNA基因和3’ -UTR的表达构建(1)肿瘤鼠模型的建立使用4-6周的雌性BALB/C鼠和C57BL/6鼠(北京动物中心)，并且至少在实验前 一周将鼠饲养在不存在对鼠致病的病原体的环境内，保证鼠处于病原体免疫状态。实验构 建了 s. c.肿瘤模型(静脉注射肿瘤模型)，包括在BALB/C鼠内构建CT26结肠癌(ATCC)模 型，以及在C57BL/6鼠体内构建Lewis肺癌模型和1D8卵巢癌模型(Ruby，Texas大学)，鼠皮 下一次性注射100微升PBS，内含5 X IO5肿瘤细胞。模型构建时每个模型所注射的肿瘤细胞 的数量是以在注射后3-4周内能形成一个直径约为1. 5厘米的肿瘤为依据的，对于构建好 的实验鼠，在肿瘤直径约为0. 25厘米时，通过球后静脉向模型鼠体内一次性注射2. 5X IO6 转染BMCs。(2)免疫磁珠法制备BMCs从患有CT26结肠癌、Lewis肺癌、1D8卵巢癌的小鼠的脾脏和血液中获取细胞，按 照MACS公司拟定好的计划通过免疫磁珠法制备BMCs，使用⑶4T淋巴细胞、⑶8T淋巴细胞 和B淋巴细胞的阳性选定磁珠去除获得的BMCs中⑶4+T淋巴细胞、⑶8+T淋巴细胞和B淋巴 细胞。具体实现上，杀死CT26结肠癌模型鼠，以无菌注射器分别从小鼠的脾脏和血液中获 取细胞，使用水破坏红细胞，并进行血清封闭；用3mlPBS悬浮细胞，首先加入⑶8+T淋巴细 胞、⑶4+T淋巴细胞和B淋巴细胞的抗体30 μ 1，在冰上静置15分钟后，用PBS洗一遍；之后 加入⑶4+Τ淋巴细胞、⑶8+Τ淋巴细胞和B淋巴细胞的阳性选定的磁珠(MACS) 35 μ 1，冰上静 置30分钟，用PBS洗两遍，得到不含⑶8+淋巴细胞、⑶4+Τ淋巴细胞和B淋巴细胞的BMCs。 除非特殊指明，下述实施例中所使用的BMCs均不含CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和B淋 巴细胞。(3) miRNA基因和3，-UTR的表达构建将鼠的基因组中的miR223，miR142-5p，miR181a-l 基因于 Hind III 和 Xho I 位点 克隆到pcDNA3. 1表达载体上。从ATCC购买含有SP0RT6/MEF2C完全编码序列(cDNA clone MGC :67973IMAGE =4500786)的表达载体，此编码序列中包含一个含有miR-223种子序列的 3’_UTR。按照说明书，通过PCR(聚合酶链式反应)的方法从鼠脾脏细胞的基因组DNA克隆MEF2C的3，UTR，并将其在Sac I和Not I位点连接到pIS2荧光素酶报告载体(Addgene)上。如图1所示，设计4种不同的引物并通过上述PCR的方法构建MEF2C的3’-UTR的突变 体1、突变体2，突变体经过质粒DNA测序进行确认。本发明中miR-223通过设计引物后克隆得到，其碱基序列为tctgg ccatctgcag tgtcacgctc cgtgtatttg acaagctgag ttggacactctgtgtggtag agtgtcagtt tgtcaaatac cccaagtgtg gctcatgcct atcag 与公开的 miR-223的碱基序列一致。实施例2miR-223在小鼠MDSCs中的表达量(1)流式细胞分析使用研磨法分别从患有CT26结肠癌的小鼠的脾脏和血液中取细胞制备单细胞悬 液1)小鼠用CO2处死，立即无菌取脾；2)将脾浸入装有冷PBS的培养皿中，用钝头剪刀剪去白色的结缔组织，换入另一 个装有冷PBS的培养皿中以清洗脾脏；3)再次换入一个装有冷PBS的培养皿中；4)用小的弯头手术剪剪切脾脏成3mm左右的小块；5)用IOml塑料一次性注射器的尾部背面轻轻按压研磨脾脏小块，此时会看到很 多脾单细胞进入PBS中；6)使用Falcon(BD生物公司)过滤获得单细胞悬液，用冷PBS洗涤2次，每次 1000r/min，离心 10 分钟；7)将细胞悬浮于RPMI 1640 (含10%热灭活胎牛血清)中，用台酚兰染色计数活 细胞数(在95%上)；8)调节细胞浓度为2 X IO6细胞/ml。从BD生物公司购买异硫氰酸荧光素、聚乙烯和与抗原呈递细胞结合的 CD-I lb (Ml/70)、Gr-I (RB6-8C5)、Ly6G(lA8)以及 Ly6C(AL21)抗体。细胞染色后在含有 1 %仲甲醛和1 % FCS (胎牛血清)的PBS溶液中再悬浮，得到MDSCs。在进行流氏细胞分析 (FAScan, Becton Dickson)前将悬液在4°C条件下保存，每组分析过程都用同型的单克隆抗 体对照作为负对照。如图2所示，通过流式细胞分析对MDSCs进行分群，包括Pl (⑶llb+Gr-Γ细胞)及 它的两个亚群P2 (Ly6C+ly6G+细胞)和P3 (IyeGlyeC+细胞)。(2)通过RT-PCR检测miR-223在模型鼠MDSCs中的表达量用RT-PCR 的方法在 CDllb+Gr-Γ 细胞(Pl)，Ly6C+ly6G+细胞(P2)和 ly6Gly6C+细 胞(P3)中，从miR-223前体和成熟miR-223两个方面共同检测miR-223在鼠MDSCs中的表 达水平，扩增U6(内参基因)的小RNA(用于成熟miRNA的，应用生物系统公司)作为每一 个实验样品的内源性对照。所有的反应都平行进行三组，因为折叠产生的变化按照制造商 的说明(应用生物系统公司)采用Δ ACt的方法进行计算。RT-PCR 反应体系AMV 逆转录酶0. 5 μ L
RNA 酶抑制剂IyL上下游弓丨物混合物2 μ LRNA 0. 5 μ gdNTP<10mM/each> 4μ L
Taq 酶(2. 5u/μ L) 0. 5 μ L10 X RT-PCR Buffer 2. 5 μ L_加双蒸水至25 μ LRT-PCR 反应程序45 "C30min
94。C 5 min 94 0C 30s
50 0C 30s I 25 循环 72 0C Imin 72 0C 5 rain」如图3所示，首先测量了 miR-223在来自肿瘤鼠和无病鼠的脾脏的⑶llb+Gr-Γ 细胞的表达，RT-PCR结果显示来自肿瘤鼠脾脏的⑶1 lb+Gr-Γ细胞内miR-223前体和 成熟miR-223的表达水平均低于无病鼠体内的表达水平。进一步研究表明，不论是在 MO-MDSC (CDl lb+Ly6G-Ly6C+)细胞还是 PMN_MDSC(CDllb+Ly6C+Ly6G+)细胞中，miR-223 前 体和成熟miR-223的表达水平与无病鼠体内的表达水平相比也都受到抑制。(3)使用基因芯片技术检测miR-223的表达水平根据制造商的说明用提取液(Irwitrogen公司Mtrizol裂解细胞的上清)和 RNeasy试剂盒(QIAGEN公司)从经过流式细胞分群的PI、P2、P3细胞中提取RNA。对于 miR-223,定量RT-PCR方法使用应用生物系统公司的7900的一羟色胺的序列检测系统的标 准荧光定量PCR试剂盒。扩增U6的小RNA (用于成熟miRNA的，应用生物系统公司)和管 家基因(U6)的mRNA(用于基因和miRNA前体的，应用生物系统公司)作为每一个实验样品 的内源性对照。所有的反应都平行进行三组，因为折叠产生的变化按照制造商的说明(应 用生物系统公司)采用Δ ACt的方法进行计算。RT-PCR 反应体系AMV 逆转录酶0. 5 μ LRNA 酶抑制剂IyL上下游弓丨物混合物 2 μ LRNA 0. 5 μ gdNTP<10mM/each> 4μ LTaq 酶(2. 5u/μ L) 0. 5 μ L10 X RT-PCR Buffer 2. 5 μ L_
加双蒸水至25 μ LRT-PCR 反应程序45 "C 30min
<formula>formula see original document page 8</formula>
miRCURY LNA 微小RNA基因芯片和miRCURY LNA 微小RNA基因芯片由中国上海 康成生物公司提供。将基因芯片与肿瘤鼠的P2、P3细胞和无病鼠的P2、P3细胞进行杂交 (交由上海康成生物公司处理)。如图4所示，通过荧光发光检测可以发现，系统化的miRNA 表达谱的哺乳动物miRNA的分析上执行的是来自患有CT26肿瘤的BALB/c mice鼠的脾脏 的MO-MDSC和PMN-MDSC细胞，这些细胞也抑制了较低水平的miR-223，肿瘤鼠体内P2、P3 细胞的数量均高于无病对照鼠体内P2、P3细胞的数量，结果表明肿瘤相关MDSCs也降低了 miR-223的表达，即miR-223在MDSCs中表达量减少。实施例3转染miR-223使miR-223表达量升高后对MDSCs的积累的影响1.移植和转染按照生产协议(Amaxa，Germany)，运用核转染(nucleofection)的方法对CT-26 结肠癌BALB/C鼠的不同结构的BMCs进行转染，即杀死小鼠取骨髓细胞，用1640培养基将 BMCs吹下来，加PBS离心；用PBS稀释至1*107/100 μ 1个细胞，加质粒5 μ g\100 μ 1，混勻 后放入电转仪；将电转仪调至Stemcell程序进行电转，每次加样100 μ 1，电转后打入老鼠 体内即可。从Dharmacon购买miRNA抑制剂和抑制剂对照，从Santa Cruz购买siRNA和siRNA 的对照。对于寡核苷酸(miRNA抑制剂和抑制剂对照以及siRNA和siRNA对照)的转染，在 IOOnM的指示寡核苷酸浓度下，运用脂质体(Invitrogen)用IOOnM的指示寡核苷酸转染细 胞。同时转染了两个与造血组织有关的特异性的miR142-5p和miR181-a-l的前体作为对 照组进行转染。在500μ1的PBS培养液中，大约有IX IO7个细胞通过尾部血管被移植到 同种CD-26肿瘤模型鼠中。三个星期后，取外周血细胞和脾细胞。2.流式细胞分析(1)直接染色1)取上述约IO6的BALB/C鼠的外周血细胞和脾细胞置于尖底离心管内，管内液体 要少些，加入 CD-llb(Ml/70)，Gr-1(RB6-8C5)、Ly6G(lA8)以及 Ly6C(AL21)抗体，在 4°C温 度下静置25分钟；2)用冷的10%小牛血清、0. 叠氮钠溶液，l/15mol/l PBS(pH4. 4)离心清洗细 胞 2 次，IOOOrpm 离心 5min ；3)加入500 μ 1 PBS缓冲液待测。
(2)用固定剂固定其中固定液配方是用0.37% 1.5%甲醛和PBS配成pH7. 4的固定液，固定方法是将上述经免疫荧光染色的细胞离心沉淀，再加入固定液混勻，放在4°C温度下保存。(3)使用流式细胞分析仪进行测量分析如图7所示，CT-26结肠癌和Lewis肺癌s. c.接种后，脾脏的⑶llb+Grl+MDSCs在 肿瘤发生后几周内产生了明显的增多。如图5、图6所示，用miR-223转染的BMCs的模型鼠 的脾脏中Grl+CDllb+细胞的比例明显的低于移植了用mirl42-5p、mirl81a-l或者对照组 转染的BMCs的模型鼠的脾脏中Grl+CDllb+细胞所占的比例；当给BALB/c肿瘤鼠注射了转 染了 miR-223抑制剂(0. 5nM左右)的BMCs后，脾脏内Grl+⑶lib+细胞随着肿瘤的生长明 显的增加，而只转染了抑制剂对照组的鼠，Grl+⑶lib+细胞的比例并不发生变化。3. RT-PCR对成熟的miR223、miR142_5p和miR181-a_l，通过定量RT-PCR方法使用应用生 物系统公司的7900的一羟色胺的序列检测系统的标准荧光定量PCR试剂盒、扩增U6的小 RNA (用于成熟miRNA的，应用生物系统公司)和管家基因的mRNA (用于基因和miRNA前体 的，应用生物系统公司)作为每一个实验样品的内源性对照。所有的反应都平行进行三组， 因为折叠产生的变化按照制造商的说明(应用生物系统公司)采用△ ACt的方法进行计 笪弁。RT-PCR 反应体系AMV 逆转录酶0. 5yLRNA 酶抑制剂IyL上下游弓I物混合物 2 μ LRNA 0. 5μ gdNTP<10mM/each> 4μ LTaq 酶(2. 5u/μ L) 0. 5 μ L10 X RT-PCR Buffer 2. 5 μ L_加双蒸水至25 μ LRT-PCR 反应程序45 "C 30min
<formula>formula see original document page 9</formula>如图5所示，RT-PCR结果显示与移植了只用miR-223空白对照转染的BMCs的鼠 脾脏的细胞内miR-223的表达相比，移植了用miR-223、mir-142和mir-181转染的BMCs的 鼠脾脏的细胞内miR-223的表达水平明显升高；如图6所示，而在与移植了只用miR-223空白对照转染的BMCs的鼠脾脏的细胞内miR-223的表达相比，移植了用miR-223转染的BMCs 的鼠脾脏的细胞内miR-223的表达水平明显升高的同时，用miR-223抑制剂空白对照和用 miR-223抑制剂转染的BMCs的鼠脾脏的细胞内miR-223的表达相比则没有明显变化。与从无病鼠的脾脏取出的Grl+⑶lib+细胞相比，由于肿瘤相关的 Grl+CDllb+MDSCs的作用，减少了肿瘤鼠体内miR-223的表达。这暗示着miR-223参与了在 患有肿瘤的小鼠体内MDSCs积累的过程。流氏细胞分析的结果暗示miR-223在肿瘤鼠骨髓细胞内的表达过程中，阻止了 BMCs分化成为MDSCs。通过使用miR-223的抑制剂使miR-223 处于低表达水平，当给CT-26肿瘤鼠注射了转染了 miR-223抑制剂的BMC s后，脾脏内 Grl+⑶lib+细胞随着肿瘤的生长明显的增加，而只转染了抑制剂对照的鼠，Grl+⑶lib+细 胞的比例并不发生变化。综上表明miR-223的表达对MDSCs的积累起抑制作用。实施例4转染miR-223对MO-MDSCs和PMN-MDSCs的积累的影响为了进一步验证miR-223对MDSCs积累的影响，在进行了 BMCs细胞移植三个星 期后，使用通过⑶lib、Ly6C及Ly6G三种表面标记的荧光抗体，分别取外周血细胞和脾细 胞进行荧光染色用于流式细胞分析(方法同实施例3)。其中CDllb+Ly6C+Ly6G+的细胞为 PMN-MDSCs，而CD1 lb+Ly6G_Ly6C+的细胞则为MO-MDSCs。如图8所示，通过分析结果可以发现 与移植了只用对照转染的BMCs的小鼠相比，在移植了用miR-223转染了的BMCs的小鼠脾 脏中，不论是Ly6G+Ly6C+或者CDllb+Ly6C+还是CDllb+Ly6G+细胞所占的比例都降低；相 反的，与移植了只用miR-223抑制剂对照转染的BMCs的小鼠相比，移植了用miR-223抑制 剂转染的BMCs的小鼠脾脏中Ly6G+Ly6C+、CDllb+Ly6C+和CDllb+Ly6G+的比例都明显的升 高。由于Gr-I细胞是Ly6G和Ly6C双阳性，并且几乎所有的Gr-I细胞都是⑶lib阳性，所 以 miR-223 对肿瘤鼠的 CDllb+Ly6G_Ly6C+ 的 MO-MDSCs 和 CDllb+Ly6C+Ly6G+ 的 PMN-MDSCs 的分化都具有抑制作用。实施例5转染MEF2C后MDSCs的积聚1.转染 MEF2C按照说明书的步骤，通过核转染的方法，杀死小鼠取骨髓细胞，用1640培养基将 BMC s吹下来，加PBS离心；用PBS稀释至1*107/100 μ 1个细胞，加质粒5 μ g\100 μ 1，混 勻后放入电转仪；将电转仪调至Stemcell程序进行电转，每次加样100μ 1，电转后打入老 鼠体内即可。用MEF2C、MEF2C的空载对照、靶向MEF2C的siRNA以及siRNA的空载对照对 CT-26患有结肠癌的鼠的BMC进行转染(Amaxa，Germany)。2.流氏细胞分析在进行了 BMC s细胞移植三个星期后，使用通过⑶llb、Gr_l的表面标记的荧光抗 体，分别取外周血细胞和脾细胞进行荧光染色用于流式细胞分析(方法同实施例3)。如图 9所示，结果表明与只移植了用对照转染的BMCs的小鼠相比，移植了用MEF2C转染的BMCs 的小鼠不论是脾脏还是外周血中⑶llb+Grl+细胞数量都增多，而且靶向MEF2C的siRNA消 除了 MEF2C对⑶llb+Grl+细胞分化的作用，而对照的siRNA空载并没有产生有效的影响。3. RT-PCR对于MEF2C 基因在 Pl (CDllb+Gr-I+ 细胞)、P2 (Ly6C+ly6G+ 细胞)和 P3 (ly6G-ly6C+细胞)细胞中的表达检测，定量RT-PCR方法引物使用定时定量PCR试剂(Qiagen)。所有的 反应都平行进行三组，因为折叠产生的变化按照制造商的说明(应用生物系统公司)采用 Δ ACt的方法进行计算。如图10 所示，MEF2C 在肿瘤鼠脾脏内的 CDllb+Gr-1+、CDllb+Ly6C+Ly6G+ 和 ⑶1 lb+Ly6G-Ly6C+细胞内在转录水平的表达也高于无病鼠，这更进一步的指明了 MEF2C对 肿瘤鼠体内MDSCs积累的促进作用，从而证明了作为miR-223的靶分子，MEF2C参与肿瘤鼠 体内MDSCs的扩增、分化过程，并起着重要的促进作用。RT-PCR 反应体系AMV 逆转录酶0. 5 μ LRNA 酶抑制剂IyL上下游弓丨物混合物 2 μ LRNA 0. 5μ gdNTP<10mM/each> 4μ LTaq 酶(2. 5u/μ L) 0. 5 μ LIOXRT-PCR Buffer 2. 5 μ L_加双蒸水至25 μ LRT-PCR 反应程序45 "C30min<formula>formula see original document page 11</formula>实施例6miR-223以MEF2C作为靶分子对MDSCs的分化进行调控应用TargetScan结合PicTar和miRanda软件进行分析，如图11所示，发现在 鼠的miR-223的175个保守位点和35个不完全保守位点中至少含有172个保守的靶位 点。在MEF2C的3，UTR中包含两个靶区，一个保守区(1264-1270)和一个不完全保守区 (1674-1680)。软件预测miR-223的3，UTR能与MEF2C结合并抑制其表达。1. Western 印迹分析在室温下封闭液中与第一抗体反应一个小时，通过用过氧化物酶偶联的二抗(试 剂盒)和增强化学发光剂(Amersham公司)对这种蛋白质抗体复合物进行检测，具体实现 为(1)转染按照说明书的步骤，通过核转染的方法，用MEF2C、MEF2C的空白对照、miR-223和 miR-223的空白对照分别转染RAW264. 7细胞，共转48小时后进行Western Blot (兔子抗MEF2C的多克隆抗体是从Abnova Corporation购买的)。(2)蛋白样品的制备1)倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液；2)每瓶细胞加3ml4°C预冷的PBS，平放轻轻摇动1分钟洗涤细胞 ，然后弃去洗液； 重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液，然后把培养瓶置于冰上；3)按Iml裂解液加10 μ LPMSF (苯甲基磺酰氟)(IOOmM)，摇勻置于冰上；4)每瓶细胞加400 μ L含PMSF的裂解液，于冰上裂解30分钟，为使细胞裂解充分 培养瓶要经常来回摇动；5)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧，然后用加样器将细胞碎片 和裂解液移至1. 5ml离心管中；6) 4"C 12000rpm 离心 5 分钟；7)将离心后的上清分装转移到0. 5ml的离心管中放平_20°C保存。(3)电泳1) SDS-PAGE 凝胶配制SDS-PAGE凝胶使用SDS-PAGE凝胶配制试剂盒进行配置。2)样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，于沸水浴中加 热4分钟，以充分变性蛋白。3)上样与电泳冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE凝胶加样孔内即可。为了便于观 察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，使用预染蛋白质分子量标准，200V电压 电泳60min。(4)转膜1)取一块PAGE胶，浸泡于电转缓冲液中，同时把两张同样大小的滤纸和两张海绵 也浸泡于缓冲液中；2)剪一块同样大小的PVDF膜，做如下处理首先浸于100%甲醇溶液10秒，然后 浸于去离子水3分钟，最后浸于转移缓冲液中3分钟；3)电转三明治顺序如下正极(白色) 海绵滤纸PVDF 膜PAGE 膜滤纸海绵负极(黑色)。(5)将三明治夹子放入预装有电转缓冲液的电泳槽中，加盖，接通电源恒压100V， 30分钟；(6)将完成后的PVDF膜用去离子水冲洗，放入5%脱脂奶粉中，室温30分钟，用 TBST (电泳缓冲液)洗膜三次，每次5分钟；(7)加入一抗，室温一小时，用TBST洗膜3次，每次5分钟；
(8)加入酶标二抗，室温一小时，用TBST洗膜3次，每次5分钟；(9) ECL显色A液和B液按1 1混合加到膜上，暗室压片7分钟，显影液1分钟， 定影液1分钟。如图12所示，与软件预测的结果一致，miR-223抑制MEF2C在mRNA水平和蛋白水 平的表达。 2. Luciferase (荧光素酶报告基因分析)对于转染的肾(人胚肾)293T细胞，转染前一天用250毫升细胞密度为4Χ IO4的 培养基将细胞在48孔板进行铺板，根据制造商的建议，使用核转染技术(Amaxa生物系统； PIS2柏林，德国)将细胞与显示表达式质粒、海肾荧光素酶报告质粒和对照质粒(试剂盒) 用脂质体2000 (Invitrogen公司)进行共转染，通过转染后24小时使用双荧光素酶试剂盒 测定海肾和萤火虫荧光素酶的活动，海肾荧光素酶的活性根据萤火虫荧光素酶活性进行标 准化，具体实现为1)转染按照说明书的步骤，通过核转染(nucleofection)的方法，杀死小鼠取骨 髓细胞，用1640培养基将BMCs吹下来，加PBS离心；用PBS稀释至1*107/100 μ 1个细胞， 加质粒5 μ g\100 μ 1，混勻后放入电转仪；将电转仪调至Stemcell程序进行电转，每次加样 100 μ 1，电转后打入老鼠体内即可。用MEF2C的3，UTR转染肾(人胚肾)293Τ细胞、MEF2C 的3，UTR和miR-223空白对照共同转染肾(人胚肾)293T细胞、miR-223和MEF2C的3，UTR 共同转染肾(人胚肾)293T细胞、miR-223和MEF2C的3，UTR突变体1共同转染肾(人胚 肾)293T细胞以及miR-223和MEF2C的3，UTR突变体2共同转染肾(人胚肾)293T细胞； 另外构建一组由miR-223抑制剂对照和0. InMUOnM和IOOnM miR-223抑制剂转染的293T 细胞；2)制备被动裂解缓冲液IXPLB 将1倍体积的5XPassive Lysis ；Buffer (PLB) 加到4倍体积的蒸馏水中，混合均勻，在4°C储存1个月；3)制备 LAR II 用 Luciferase Assay Buffer II (目录号 E1980105ml)溶解冻干 粉 Luciferase Assay Substrate, _20°C存储 1 个月；4)制备 Stop & Glo 试剂加 0. 2ml 的 50 X Stop & Glo 酶到 IOml 的 Stop & Glo 缓冲液中，制成IXStop & Glo 试剂；5)根据说明书的建议使用核转染技术(Amaxa生物系统；pIS2柏林，德国) 将细胞与显示表达式质粒、海肾荧光素酶报告质粒和对照质粒(Promega)用脂质体 2000 (Invitrogen公司)进行共转染，将用MEF2C的3，UTR转染的肾(人胚肾)293T细胞、 用MEF2C的3，UTR和miR-223空白对照共转的肾(人胚肾)293T细胞、用miR-223和MEF2C 的3，UTR共转的肾(人胚肾)293T细胞、miR-223和MEF2C的3，UTR突变体1共转以及 miR-223和MEF2C的3，UTR突变体2共转的肾(人胚肾)293T细胞，在转染前一天用250 毫升细胞密度为4X104的培养基将细胞在48孔板进行铺板。如图13所示，转染后24小 时使用双荧光素酶试剂盒(Promega)测定海肾和萤火虫荧光素酶的活动并进行统计分析， 统计分析时采用了检定的方法，95%的置信限度被认为是有意义的，定义为P < 0. 05。如图12所示，对MEF2C的3’UTR进行荧光素酶报告检测进一步确认了 miR-223调 控MEF2C基因表达的特异调节。如图13所示，MEF2C的3，UTR种子序列的突变体解除了 miR-223的抑制活性，暗示着这个负调控过程特异性的作用于先前预测的miR-223的靶位点；而且miR-223的抑制 剂也能明显的阻塞miR-223对荧光素酶活性的负调控。6)细胞裂解(1)除去培养细胞中的培养基；(2)用1 XPBS清洗培养细胞，去掉清洗液；(3)按48孔65ul将IXPLB加入到培养孔中。7)被动裂解在室温轻缓晃动培养板15分钟，把裂解液转移到检测试管中。8)转染后24小时测定海肾和萤火虫荧光素酶的活动设置自动进样器1和2分别分装100ul的LARII和Stop&Glo 试剂；测量时，使用1_2秒延迟和5_10秒读数。在萤光 发光仪上(Luminometer)(1)加入 20ul PLB 裂解液(2)加入 lOOulLARII(3)检测萤火虫萤光素酶(4)加入 100ulStop&Glo 试剂(5)检测海肾萤光素酶的活性(6)其它孔如此循环操作。对MEF2C的3，UTR进行荧光素酶报告检测也进一步确认了 miR-223调控MEF2C基 因表达特异的调节。如图13所示，MEF2C的3’ UTR种子序列的突变体解除了 miR-223的 抑制活性，暗示着这个负调控过程是特异性的作用于先前预测的mi R-223的靶位点；而且 miR-223的抑制剂也能明显的阻塞miR-223对荧光素酶活性的负调控，随着miR-223抑制剂 浓度的增大对荧光酶活性的负调控作用就越小。实施例7血液分析为了进一步了解miR-223对MDSCs分化的影响，进行血液分析。如实施例3所述的方法进行转染和移植，三个星期后，取外周血细胞。首先使用 CDllb (M1/70)和Grl (RB6-8C5)抗体对BMCs进行流氏细胞分析(方法如实施例2)，结果如 图14所示(图14右侧第二幅图上箭头为红色箭头，第四幅图上箭头为蓝色箭头)，与只移 植了用对照转染的BMCs的鼠相比，移植了被miR-223转染的BMCs的鼠的外周血中的Grl 和CDllb处于高表达水平的细胞比例降低；相反的，与只移植了用抑制剂对照转染的BMCs 的鼠相比，移植了被miR-223抑制剂转染的BMCs的鼠外周血中Grl和⑶lib处于高表达水 平的细胞比例升高，这显示了移植了被miR-223转染的BMCs的鼠的外周血中，低水平的Grl 和⑶lib表达细胞的异常的积累，提示着miR-223的确影响BMCs分化成为MDSCs。然后制 备血涂片，在显微镜下(400倍)进行细胞形态学观察，与移植了只转染对照的BMCs相比， 移植了用miR-223转染的BMCs的鼠的外周血中有更多粒细胞(红色箭头)；同样的，对于 粒细胞前体细胞，这些粒细胞显示不规则的细胞核分裂和核染色质的凝聚不足。而在移植 了转染了 miR-223抑制剂的BMCs的鼠外周血中，粒细胞样的细胞增多(蓝色箭头)，这些细 胞有一个不寻常的熟核成熟，分叶增多的形态特征。总体来说，结果都表明miR-223对肿瘤 鼠体内MDSCs数量的增加和分化有着重要的抑制作用。
实施例8体外肿瘤相关的miR-223调节⑶llb+Gr_l+细胞的分化研究将小鼠BMCs暴露在PGE2 (前列腺素2)或与CT_26、1D8肿瘤细胞上清液或者只与 空白对照共同培养后，使用⑶llb(Ml/70)和Grl (RB6-8C5)抗体对BMCs进行流氏细胞分 析(方法如实施例2)，可以发现如图15所示与对照组相比，与CT-26、1D8肿瘤细胞上清或 者与PGE2共同培养时，BMCs可以分化成⑶llb+Gr-l+细胞的比例明显上升；而在共同培养 0,6,24. 48. 72小时后，取上述四种处理的BMCs细胞进行RT-PCR检测可以发现，如图16所 示，虽然在暴露于肿瘤相关因子之后，miR-223的前体和成熟mir-23的表达水平有短暂的 上调，但是随着BMCs分化为⑶llb+Grl+细胞，在肿瘤相关的MDSCs中，miR-223的前体和 成熟miR-223的表达水平都下调，这暗示着miR-223的表达可能受到能被肿瘤相关因子感 应的功能分子的调控；相反的，作为miR-223的靶分子，MEF2C的表达水平在短暂的下调之 后上调。

RT-PCR反应体系
AMV逆转录酶0. 5 ii L
RNA酶抑制剂1 P L 上下游引物混合物2yL
RNA 0. 5u g
dNTP<10mM/each> 4u L
Taq 酶(2. 5u/ u L) 0. 5 u L
10XRT-PCR Buffer 2. 5u L
加双蒸水至 RT-PCR反应程序 45 °C 30min
<formula>formula see original document page 15</formula>为了进一步确定miR-223及其靶分子MEF2C在调节BMCs分化成为⑶llb+Grl+细 胞中的作用，在转染后2天和4天后使用CDllb(Ml/70)和Grl(RB6-8C5)抗体对miR-223 和MEF2C转染的BMCs进行分析。如图17所示，与培养的只用对照组分转染的BMCs相比， 培养的用miR-223转染的BMCs细胞中CDllb+Grl+细胞的比例要低；相反的，在培养的转 染了 MEF2C的BMCs细胞中⑶llb+Grl+细胞的比例明显上调，这就证明了 MEF2C在诱导 ⑶llb+Grl+细胞分化中的促进作用。实施例9miR-223与肿瘤生长速度的关系在7、11、15、19、23、27天杀死小鼠，取出移植了用]\^卩2(、]\^卩2(空白对照、11111 -223和miR-223的空白对照转染的BMCs的肿瘤小鼠体内CT26肿瘤，测量其大小、重量、体积。如 图18所示，与只移植了用对照质粒转染的BMCs的小鼠相比，移植了用miR-223转染的BMCs 的小鼠肿瘤的生长速度减慢；相反的，与只移植用对照载体的小鼠相比，移植了 MEF2C的小 鼠体内肿瘤的生长速度加快。因此，miR-223不只抑制了⑶llb+Gr-Ι+细胞的积累，而且也 抑制了肿瘤的生长。综上所述，髓系来源抑制细胞(MDSCs)可造成肿瘤细胞的免疫逃逸，同时MDSCs可抑制淋巴细胞的增殖并促使其凋亡；另外MDSCs能通过影响一氧化氮合酶、精氨酸酶的活 性来影响肿瘤的生长。因此降低这群细胞或促使其分化，将是很有前景的肿瘤免疫辅助治 疗方法。本发明中通过上述实施例的研究表明，MDSCs在抑制T细胞应答和在癌症时诱导T 细胞耐受中起着重要的作用，而miR-223可以有效抑制MDSCs的积累，并且通过抑制MDSCs 积聚从而减缓肿瘤生长速度，进而实现了 miR-223对肿瘤的生长和发展的抑制作用。上述参照具体实施方式
对该miR-223的新用途进行的详细描述，是说明性的而不 是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的 变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
权利要求
miR-223具有抑制髓系来源抑制细胞积聚的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述miR-223具有抑制肿瘤生长的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于所述肿瘤为肾细胞癌、乳腺癌、结肠癌、肺 癌或卵巢癌。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述肿瘤为结肠癌、肺癌或卵巢癌。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述肿瘤为结肠癌。
6.根据权利要求2-5之一所述的用途，其特征在于所述miR-223在制备用于抑制肿 瘤生长的药物中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于所述miR-223在制备用于抑制结肠癌、肺 癌或卵巢癌生长的药物中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于所述miR-223在制备用于抑制结肠癌生 长的药物中的用途。
全文摘要
本发明利用现代生物学技术和生物信息学分析对miR-223的功能进行了初步研究，发现miR-223具有抑制MDSCs的功能，进而发现miR-223具有抑制肿瘤生长的用途，可以将miR-223设计为靶向药物来治疗肿瘤，对肿瘤临床免疫治疗有着潜在的巨大应用价值，并且为进一步研究miR-223的生物学功能奠定了基础。
文档编号A61P35/00GK101804207SQ20091024480
公开日2010年8月18日 申请日期2009年12月15日 优先权日2009年12月15日
发明者刘乔飞, 张园, 张苗苗, 杨荣存, 王萌萌, 陈颖莹 申请人:南开大学