专利名称：：胸腺素α1的一种新用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及胸腺素al(Thymosinal，Tal)，尤其是涉及胸腺素al的一种新用途。
背景技术：
：胸腺肽的临床应用始于20世纪70年代中期，其最主要的贡献是对胸腺依赖性疾病的治疗，由于它对于维持原发性免疫缺陷病、自身免疫疾病和癌症患者的免疫反应性，刺激其特异性淋巴细胞的活性起着主要作用，因此广泛应用于治疗系统性红斑狼疮、白塞氏综合征、类风湿性关节炎、重症感染、支气管哮喘、急慢性肝炎和肿瘤等疾病。另外，由于人类的老化明显地反映胸腺组织的萎縮和功能的衰竭，胸腺肽可以推迟一些老年性疾病的出现，因此应用胸腺肽抗衰老也有着极其广阔的前景。随着研究的深入，人们已经将研究重点转向胸腺素中的单一肽，以期发现更有效的临床治疗药物。文献表明，胸腺素a原(prothymosina，ProTa)和Tal是当前胸腺素研究中的热点。Tal是一种具有热稳定性的酸性多肽，由28个氨基酸组成，pl值为4.2，相对分子量为3108，且不含有甲硫氨酸、半胱氨酸及芳香族氨基酸。其氨基酸序列(l、GoldsteinAL，GaraciE.CombinationTherapiess[M].NewYork:springer，.1993:39—48)为NH2-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-COOH。Tal具有生物反应调节功能，其主要内容包括(l)Tal可恢复T细胞的功能，并促进成熟T细胞的增殖、细胞因子及其受体的产生，从而增强机体对肿瘤的免疫应答能力；(2)修饰肿瘤细胞，诱导宿主产生强烈的免疫反应；(3)促进肿瘤细胞的分化成熟，使恶性增殖细胞恢复正常化；(4)减轻化疗、放疗的副作用。胸腺素al是从胸腺第五组分(TF5)中提取并纯化具有生物活性的酸性多肽，作为免疫增强剂，可以调节免疫系统的许多环节，包括活化NK细胞、T细胞、单核和巨噬细胞，还可以刺激骨髓造血细胞的增殖分化;其中最主要的是对T细胞分化的调节。现在主要用于治疗乙肝、丙肝等感染性疾病，非小细胞肺癌、黑素瘤、肝癌、胃癌等恶性肿瘤，自身免疫性疾病，如类风湿关节炎、重症无力、系统性红斑狼疮等，以及免疫缺陷病的治疗。国内外研究(2、RubinLA'，KurmanCC，FriezME，etal.Solubleinterleukinreceptorsarereleasedfromactivatedhumanlymphoidcellinvitro.JImmun，1985，135:3172;3、孙永良.可溶性白细胞介素II受体与感染性疾病.国外医学流行病学传染病学册，1991，18:34)均发现，SIL-2R是一种重要的免疫抑制物质，它的作用类似封闭因子，其水平的增高多伴有NK细胞活性的下降和CD4细胞的减少，并可能反映机体免疫反应下降和病情的严重程度。胸腺素是由胸腺上皮细胞合成和分泌的多种生化性质不同的具有激素样活性的多肽类物质的总称(4、张符光，刘佃辛.胸腺和胸腺素研究进展.国外医学免疫学分册，1996，19:187)。以健康小牛胸腺为原料含胸腺素a等多种活性多肽的胸腺肽注射液，主要作用于T淋巴细胞分化、发育及成熟的各个阶段，从而发挥调节细胞免疫功能的作用，同时能增强NK细胞的吞隨能力(5、MuzzioliM'MocchegianiE，BressaniN，etal.InvitrorestorationbythymulinofNkactivityofcellsfromoldmice.IntJI腿unopharmaCol，1992,14:57)。蔡文玮等(6、蔡文玮，陆平，朱健.临床中老年保健，2002，5(2):90-91)和王兆海(7、临床肺科杂志，2004，9(4):357-358)采用胸腺肽增强糖尿病以及糖尿病合并肺结核患者的细胞免疫功能，取得一定的疗效。证明胸腺肽在提高机体免疫功能和调节机体免疫能力方面具有明显效果。I型糖尿病的重要原因与自身免疫疾病密切相关，其中主要是因为胰岛P细胞受到自身免疫细胞的攻击，造成抗原暴露，引起免疫系统进一步的反应，使得胰岛p细胞大量损失，正常胰岛素的分泌受到影响，血糖升高，形成糖尿病症状。链脲佐菌素(STZ)在I型糖尿病模型制备中已经得到广泛应用，大鼠在50mg/kg—次性注射情况下并可以造模成功，而小鼠则在相同剂量经过5次连续注射后基本达到造模目的。目前认为STZ的作用机理是通过使机体产生过量的NO，攻击破坏胰岛P细胞，引起胰岛细胞抗原暴露，激活机体免疫机制，大量巨噬细胞进入胰岛细胞从而加剧胰岛细胞的损伤，最后造成胰岛素分泌减少，引起血糖增高，诱发糖尿病。诱导的小鼠胸腺萎縮，肾脏明显肿大，并且血清抗氧化能力显著下降。近年来，糖尿病的病因和发病机理研究表明氧化应激与糖尿病的发生和发展密切相关(8、曹文彬等，抗氧化微量营养素防治糖尿病的研究进展，长春中医药大学学报，2006，22(2):73-74)，为了防止糖尿病的发生发展，人们对一些具有防治糖尿病作用的天然抗氧化物进行了系统的研究，发现它们通过表达不同的机制与作用环节打断氧化侵袭引致胰岛P细胞损害的恶性循环，从而为天然抗氧化治疗糖尿病提供了一个新的策略。刘仁海等(9、刘仁海，等.转胸腺素al基因聚球藻抗氧化作用的研究，中国海洋药物杂志，2002.2:4-7;10、刘仁海，等.口服转胸腺素al基因聚球藻对小鼠T细胞亚群作用的研究，厦门大学学报(自然科学版)，2003，4:517-520)分别证明了转胸腺素al基因聚球藻在抗氧化和调节小鼠T细胞亚群方面具有显著的效果，能够显著提高健康小鼠CD3，CD4亚群水平，提高机体CD4/CD8比值。进一步说明胸腺素al是一种有效的免疫增强剂。前胸腺素a原(prothymosin)与胸腺素al具有N端相同的28个肽，其全长是108110个氨4基酸，体内外实验证明它具有调节平衡免疫功能的作用，能够使过激的免疫功能下调，避免自身免疫疾病的发生，同时，最近研究(11、Malicet，C.，Dagom，J.C.，Neira，j丄andIovanna，J丄.P8andprothymosinalpha:unityisstrenthe.Cellcycle，2006，5(8):829-830)还表明，ProTct与细胞凋亡因子P8能够形成复合体，共同起到抑制细胞凋亡，促进细胞分裂的功能。此外，最近研究(12、Mallo，G.V.，Fiedler,F.，Calvo，E丄.，Ortiz,E.M.，Vasseur，etal.cloningandexpressionontheratp8cDNA，anewgenepancreasduringtheacutephaseofpancreatitis,pancreasdevelopment,andregeneration,andwhichpromostescelluarproduction.J.Biol.Chem.1997，272(51):32360-32369)还证明，P8能够刺激胰岛素(3细胞细胞增殖，因此，推测ProTa不仅能够保护胰岛细胞避免自身免疫细胞的攻击，同时能够促进胰岛细胞的分裂，从而增加胰岛素的分泌功能。早在20世纪80年代Tabata，T(13、Tabata，T.，Kinoshita，Y.，Fujin，S.，Hato，F.，etal.pretectionbythymosinfraction5fromstreptozotoeininducediabetesinmice-Cellularandmolecularbiology1989，35(2):121-127)采用从猪的胸腺分离到的肽腺因子进行抵抗STZ诱导的糖尿病的发生，有一定的效果，但所用的是含有多种成分的复合物。
发明内容本发明的目的在于提供胸腺素al的一种新用途。本发明所述的胸腺素cd用于制备糖尿病药物。通过动物实验证实，胸腺素al不仅能够减缓小鼠体重的增加，降低正常小鼠空腹血糖值，明显增强小鼠的糖耐量作用，而且能够抵抗STZ诱导小鼠糖尿病的发生；此外对于保护胰岛细胞结构和胰岛素的分泌水平具有重要作用。本发明所述的胸腺素al可用于维持正常糖代谢，保护胰岛细胞结构和功能；通过口服胸腺素al的方法，还能够明显减缓体重增加的功效，因此胸腺素al可在制备预防糖尿病发生和治疗糖尿病的药物和临床上应用。采用日达仙(意大利，赛百胜产品，1.6mg/瓶)为实验材料，选择昆明小鼠和C57BL/6为实验动物，通过口服和皮下注射两种途径给药，可验证胸腺素al的上述生理功能。本发明所述的胸腺素al的一种新用途的实验方法包括以下步骤1)通过口服和皮下注射两个途径将胸腺素al按10ng/只剂量给药；2)每隔5天称小鼠体重；3)14天后测小鼠空腹血糖及进行糖耐量实验；4)口服给药的小鼠一部分捕杀，剥取小鼠体内脂肪(肾周脂肪和生殖器脂肪)，称重。计算总脂肪重量(等于肾周脂肪重量和生殖器脂肪重量之和)和脂/体比值[等于(总脂肪重量/体重xl00);5)口服给药的小鼠另一部分，一次性腹腔注射STZ，按100mg/kg剂量，自注射后，每10天测血糖一次；6)预先皮下注射胸腺素al，14天后，小鼠经腹腔注射STZ，每天一次，按50mg/kg剂量，连续4天，自注射STZ后，每510天测血糖。30天后取血分离血清，采用胰岛素检测试剂盒检测血清胰岛素水平；7)胸腺素al皮下注射的同时，小鼠经腹腔注射STZ，每天一次，按50mg/kg剂量，连续4天，自注射STZ后，每510天测血糖。通过动物体内实验，证明胸腺素al具有很好的抵抗STZ诱导的糖尿病的发生，表现出很好的抵抗糖尿病诱发因素的影响，并且在具备增强糖耐量作用的功能。此外，经过口服发现，胸腺素al能够，明显减缓体重增加速度的功效，通过解剖检査发现，其体内肾周脂肪重量和生殖器脂肪重量明显比对照组低，证明该蛋白在减少肥胖，抵抗糖尿病的发生中具有重要保护作用，为今后开发糖尿病基因工程潜在药物奠定基础。图l为口服胸腺素al对小鼠体重的影响。在图1中，横坐标为口服药后天数(d)，纵坐标为小鼠体重(g);—令一为对照组，一國一为胸腺素al组。图2为口服胸腺素al(10d)抵抗STZ诱导糖尿病小鼠效果。在图2中，横坐标为注射STZ后天数(d)，纵坐标为血糖值(mmol/L);—令一为对照组，一画一为胸腺素al组；与对照组相比，PO.05,差异显著；与对照组相比，P<0.01，差异极显著。图3为皮下注射胸腺素al对增强小鼠糖耐量作用的效果。在图3中，横坐标分别为l:对照组，2:胸腺素al组，纵坐标为曲线下面积。图4为皮下胸腺素al(预先注射14天)对小鼠抵抗STZ诱导糖尿病的作用。在图4中，横坐标为注射链脲佐菌素(STZ)后天数(d)，纵坐标为血糖值(mmol/L);—命一为拧檬酸组，一B—为胸腺素al组。图5为胸腺素al对血清胰岛素水平的影响。在图5中，横坐标为Tal,control,纵坐标为Pg/mL;与对照组相比，PO.01差异极显著。图6为皮下胸腺素al对小鼠抵抗STZ诱导糖尿病的作用(胸腺素al与STZ同时注射)。在图6中，横坐标为天数(d)，纵坐标为血糖值(mmol/L);—命一为柠檬酸组，一■—为胸腺素al组。具体实施例方式以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。实施例所采用的材料与方法说明如下。1.实验取材和主要生物试剂试验动物为C57BL/6小鼠，(20土2)g,6-7周龄，雄性，SPF级，小鼠60只，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，合格证号SCXK(沪)200320003。单笼喂养，室温1825°C，相对温度50%80%，每日光照12h，自由摄食、饮水。链脲佐菌素(streptozotocinSTZ，SIGMA.USA)，批号0S3K1569;拧檬酸(成都鸿鹤化工试剂厂)，批号:20040821。胰岛素试剂盒(上海西唐生物科技有限公司)。血糖检测仪为强生公司Llifscan产品及配套检测试纸。2.将40只小鼠平均分为2组，每组20只，l组口服途径喂词胸腺素cd,—组以相同体积生理盐水作为对照组。连续10天，期间每5天称体重一次，口服胸腺素al对小鼠体重的影响结果见表l和图l。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>~*:与对照组相比，P<0.05，差异显著；**:与对照组相比，PO.01差异极显著第5d、10d测空腹血糖。连续口服胸腺素al5d,10d后小鼠空腹血糖值结果见表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*:与对照组相比，PO.05第20天实验后，各组分别取10只，剥取小鼠体内脂肪(肾周脂肪和生殖器脂肪)，称重。计算总脂肪重量(等于肾周脂肪重量和生殖器脂肪重量之和)和脂/体比值[等于(总脂肪重量/体重x100)。口服胸腺素al对小鼠脂肪重量的影响结果见表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>**:与对照组相比，P<O.01差异极显著.剩余实验组小鼠一次性腹腔注射STZ，按100mg/kg剂量，自注射后，每10天测血糖一次。对照组给予相同体积的柠檬酸缓冲液。检测步骤同实验组。口服胸腺素al(10d)抵抗STZ诱导糖尿病小鼠效果结果见表4和图2。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*:与对照组相比，P<0.05，差异显著；**:与对照组相比，PO.01差异极显著3.将20只小鼠平均分为2组，每组10只，l组皮下途径给胸腺素al，一组以相同体积柠檬酸缓冲液作为对照组。连续14天，期间每5天称体重一次，第14天进行糖耐量实验，而后连续腹腔注射STZ，每天一次，按50mg/kg剂量，连续4天，自注射STZ后，每5-10天测体重和血糖，测5次。皮下注射胸腺素al(连续14天)对增强小鼠糖耐量作用的结果见表5和图3，皮下胸腺素al(预先注射14天)对小鼠抵抗STZ诱导糖尿病的作用见表6和图4。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表6<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*:与对照组相比，P<0.05,差异显著；**:与对照组相比，PO.01差异极显著30天后眼眶取血，分离血清，置一20。C冰箱，采用ELISA方法检测其中胰岛素水平，胸腺素al对血清胰岛素水平的影响结果见图5。'4.将20只小鼠平均分为2组，每组10只，l组皮下途径给胸腺素al，一组以相同体积柠檬酸缓冲液作为对照组。给药的同时腹腔注射STZ，每天一次，按50mg/kg剂量，连续4天，自注射STZ后，每5天测体重和血糖，领!I5次。皮下注射胸腺素al对小鼠抵抗STZ诱导糖尿病的作用(Tal与STZ同时注射)结果见表7和图6。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*:与对照组3fi比，PO.05,差异显著；**:与对照组相比，PO.01差异极显著糖耐量实验按以下公式计算AUC=0.25x(BSvalueat0hour+4xBSvalueat0.5hours+3xBSvalueat2hours)。本实验所有数据通过SPSS(version13.0，SPSSInc.)软件进行分析处理。胸腺素al是ProTaN端前28个肽，研究表明它具备同样的生物活性。胸腺5肽作为胸腺素的有效成分也表现出与其他胸腺因子类似的调节血糖和保护胰岛的功能，因此，本发明证明胸腺素al在糖尿病的预防和治疗方面的功能具有科学的理论依据。权利要求1.胸腺素α1用于制备糖尿病药物。全文摘要胸腺素α1的一种新用途，涉及胸腺素α1。提供胸腺素α1的一种新用途。所述的胸腺素α1用于制备糖尿病药物。通过动物实验证实，胸腺素α1不仅能够减缓小鼠体重的增加，降低正常小鼠空腹血糖值，明显增强小鼠的糖耐量作用，而且能够抵抗STZ诱导小鼠糖尿病的发生；此外对于保护胰岛细胞结构和胰岛素的分泌水平具有重要作用。本发明所述的胸腺素α1可用于维持正常糖代谢，保护胰岛细胞结构和功能；通过口服胸腺素α1的方法，还能够明显减缓体重增加的功效，因此胸腺素α1可在制备预防糖尿病发生和治疗糖尿病的药物和临床上应用。文档编号A61P3/10GK101361962SQ20081007191公开日2009年2月11日申请日期2008年10月7日优先权日2008年10月7日发明者刘升发,吴汉州,周克夫,王世媛,伟韩申请人:厦门大学;厦门伯赛基因转录技术有限公司