专利名称：新用途的制作方法
新用途本发明涉及低聚糖，特别是低聚半乳糖(galactooligosaccharide)，在预防或治疗炎症中的用途，特别是在预防或治疗肠道炎症中的用途。低聚半乳糖是非消化性的碳水化合物，其对哺乳动物胃肠道消化酶具有抗性，但是可以被特定的结肠细菌所发酵。人的肠道菌群(flora)包括致病的、良性的和有益的微生物菌属。前者占主导地位可以导致肠道病症，其可以是急性的(如肠胃炎)和慢性的(如炎性肠疾病和一些肠道癌症)O益生元，其被定义为一种通过选择性刺激结肠中一种或有限数量的细菌的生长和 /或活性而对宿主产生有益影响，从而改善宿主健康的非消化性的食品成分，已经显示出其对大量炎症状态如炎性肠疾病(IBD)具有直接的保护作用。已经发现在一些IBD患者中，适应性免疫系统对共生的肠道菌群的超反应性(参见Guarner F,Malagelada TR, Best Pract. Res. Clin. Gatroenterol. , (2003) ；H ；793-804)。因此，益生元已经被用于增强有益的肠道微生物菌群，这已经帮助预防病症的复发(参见Sartor RD. ,Gastroenterology, (2004),126,1620-1633)。被分类为益生元的化合物中的一组是低聚半乳糖。它们是包含半乳糖的低聚糖， 其式为Glc β 1-4[Gal β 1_6]η，其中η = 2_5，并且它们是通过使用酶β -半乳糖苷酶的转半乳糖基酶(transgalactosylase)活性而从如乳糖糖浆中制备的(Crittenden，(1999) Probiotics :A Critical Review,Tannock,G. (ed)Horizon Scientific Press,Wymondham, pp 141-156)。EP 1 644 482公开了一种产生半乳糖苷酶活性的两歧双歧杆菌 (Bifidobacterium bidifum)新型菌株，其转化乳糖为新型的低聚半乳糖的混合物。该低聚半乳糖的混合物包括二糖 ( β 1-3) Glc ；Gal ( β 1-3) -Gal ；Gal ( β 1-6) -Gal ； Gal ( α 1-6) -Gal ；三糖 Gal ( β 1-6) -Gal ( β 1-4) -Glc ；或 Gal ( β 1-3) -Gal ( β 1-4) -Glc ；四糖 Gal ( β 1-6) -Gal ( β 1-6) -Gal ( β 1-4) -Glc 或五糖 Gal ( β 1-6) -Gal ( β 1-6) -Gal ( β 1-6 )-Gal (β 1-4)-Glc，并且已经显示出其含有益生元性质和增加有益细菌双歧杆菌和乳酸杆菌的种群。该低聚半乳糖的混合物以Bimimo (注册商标)的名称商业销售并且可从Clasado Ltd (Milton Keynes, UK)得到。在Am. T Clin. Nutr. , (2008)，巡1438-46 中，Vulevic，J et al 描述了怎样将低聚半乳糖给予健康年长的人以在粪便的微生物群落组成和免疫应答两者上产生积极的效^ ο目前已经发现具有3或更高DP (聚合度)的低聚半乳糖可以直接调节哺乳动物肠道粘膜的炎症应答。特别是，当炎症因子存在时，它减轻了促炎症趋化因子应答。因此，这样的低聚半乳糖在治疗肠道炎症病况，如炎症肠病、结肠炎、肠坏死性结肠炎、假膜性结肠炎、 溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、憩室炎、缺血等中有益。根据本发明，提供了具有3或更高DP的低聚半乳糖，其用途是用于预防或治疗炎症，优选用于预防或治疗肠道炎性病症。优选该低聚半乳糖具有3至5的DP。该低聚半乳糖具有下式三糖Gal-Gal-Glc，四糖Gal-Gal-Gal-Glc或五糖通式Gal-Gal-Gal-Gal-Glc，其中Gal代表半乳糖残基并且Glc代表葡萄糖残基。该低聚半乳糖的结构是 Gal (β 1-6)-Gal (β 1-4)-Glc，Gal ( β 1-3)-Gal (β 1-4) -Glc, Gal (β 1-6)-Gal (β 1-6)-Gal (β 1-4)-Glc 和 Gal ( β 1-6)-Gal (β 1-6)-Gal (β 1-6)-Gal (β 1-4)-Glc。该低聚半乳糖优选地选自由上述低聚半乳糖所组成的组。肠上皮细胞形成单极性的上皮细胞层，将腔环境与宿主分隔开。它们是宿主防御的积极贡献者。它们对任何炎症刺激的先天免疫应答主要负责迅速再生上皮细胞的屏障功能。上皮细胞可以被诱导表达促炎症因子和趋化因子，如果需要，所述促炎症因子和趋化因子开启了募集先天免疫细胞，如嗜中性粒细胞的至受损粘膜的过程。例如，促趋化因子，如IL-8，可以在免疫应答期间被上皮细胞和被巨噬细胞刺激以募集嗜中性粒细胞和 PMN' s(多形核白细胞)至发炎的粘膜。巨噬细胞炎症蛋白-3α (ΜΙΡ-3 α )或CCL20是通过激活淋巴细胞和树突状细胞引发先天免疫系统的另一种趋化因子，所述激活是通过趋化因子受体CCR6的激活。IL-8和ΜΙΡ-3α (CCL20)的诱导表明对炎症攻击的应答程度。已经研究了低聚半乳糖对不同成人结肠细胞培养模型的炎症应答的作用。出人意料地发现，在生理浓度时，其减轻在肠道上皮细胞即人肠上皮细胞的中，由TNF-α炎症刺激所诱导的促炎症趋化因子应答。该低聚半乳糖可以从商业上可获得的名称为Bimimo的低聚半乳糖混合物中制备，其中通过使用例如尺寸排阻色谱、使用例如保持在室温下的Biogel P2柱的纯化。通过溶解粉末于10% w/v的水中和用去离子水以2ml/min的速率洗脱而制备样品。备选地，Bimimo混合物的活性级分可以通过使用合适酶的酶促转半乳糖基化进行制备。所述低聚半乳糖可以以粉末、糖浆或以软锭剂的形式存在。可以将其给予患有炎性病症，例如肠道炎性病症的患者，每日以l-10g，优选2-5g，最优选2. 75g的活性低聚半乳糖的有效剂量。这可以采用在一个单剂量或相隔几小时的两个单独剂量。低聚半乳糖粉末可以被添加到热饮料中或洒在食物上。糖浆可以以本身进行消耗或任选地混合在饮料中或涂抹在食物上。软锭剂在嘴里咀嚼。为了预防炎症，低聚半乳糖可以以l-10g，优选2_5g，最优选2. 75g的有效每日剂
量给予个体。根据本发明的另一方面，提供了一种治疗或预防炎症，如肠道炎症的方法，包括给于有效量的低聚半乳糖。本发明将通过参考下列的实施例和附图而被进一步描述。附
图1显示在T84细胞中，B-GOS对TNF- α诱导的IL-8分泌的影响；附图2 (A)和(B)显示在^ 60细胞中，8-605对1咿-0诱导的IL-8和ΜΙΡ_3α 分泌的影响；附图3 (A)和(B)显示在TNF- α处理的NCM-460细胞中，B-G0S对IL-8和ΜΙΡ-3 α mRNA表达的影响； 附图4 (A)、(B)和(C)显示B-GOS对NF- κ B ρ65蛋白移位至TNF- α处理的 NCM-460细胞的细胞核中的影响；附图5和6显示在NCM-460细胞中，B-GOS对TNF- α诱导的IL-8分泌的影响；附图7 (A)禾Π⑶显示在DSS处理的小鼠中，B-GOS对IL_6和MIP-2分泌的影响；
附图8 (A)和(B)显示低聚半乳糖的不同级分分别对IL-8和MIP-3 α的产生的影响；和附图9 (A)禾Π⑶显示当NCM460细胞用Bimuno和其DP3和DP > 3的级分进行处理时，分别对TNF- α诱导的IL 8和ΜΙΡ_3 α的产生的影响。实旋例1低聚半乳糖对细胞因子分泌的影响从起始浓度5 X IO5细胞/mL，将肠道上皮细胞在M孔平板上培养至融合。当细胞达到70%融合时，将它们以四等份按照如下进行处理(i)阴性对照，(ii)TNF-a (lOng/ mL)阳性对照，(iii) B-GOS (5g/L)和(iv)含有 B-GOS (5g/L)的 TNF-α (10ng/mL)。使用浓度为5g/L的低聚糖，由于这是在人奶中发现的低聚糖的生理学浓度。16小时之后，收集上清并在_20°C存储以用于随后的通过ELISA测量IL-8和MIP-3 α的分泌。在下列试验中， TNF-α被ILl β或鞭毛蛋白所替代。IL-8的定量。如先前所描述的通过ELISA测量IL-8的浓度(Claud EC, Savidge Τ,Walker WA 2003 Modulation of human intestinal epithelial cell IL-8 secretion by human milk factors. Pediatr Res 53:419-425)。简而言之,96 孔高粘性板(Nunc Immulon, Fisher Scientific，Middletown，VA，USA)的每个孔用 100 μ L 的 3 μ g/mL 小鼠抗人IL-8单克隆抗体包被过夜，用200 μ L的含1 % BSA的PBS洗涤3次，并用100 μ L的样品在37°C下温育1小时。然后将这些孔洗涤3次，用100 μ L的0. 1 μ g/mL生物素标记的小鼠抗人IL-8抗体温育1小时。再一次洗涤之后，每个孔用100 μ L的辣根过氧化物酶温育，再次洗涤，然后用100 μ L的0-苯二胺二盐酸盐和过氧化氢温育。用100 μ L的2Ν H2SO4终止反应，在490nm读取吸光度。从IL-8标准曲线计算样品中IL-8的浓度。ΜΙΡ-3 α的定量。与IL-8类似，通过ELISA测量ΜΙΡ-3 α分泌的量，除了用IOOyL 的2.(^8/1^小鼠抗人肌 -3(1单克隆抗体包被平板之外。检测抗体，生物素标记的小鼠抗人ΜΙΡ_3α抗体，用作在10(^1^本积中501^/1^浓度的检测抗体。从ΜΙΡ_3α标准曲线估算样品中MIP-3ci的浓度。细胞活力测定。使用台盼蓝拒染试验研究B-GOS细胞毒性。从起始浓度2Χ IO5 细胞/mL，将NCM-460细胞培养在盖玻片上。细胞以三等份用B-GOS (5g/L)或对照培养基进行处理。16小时之后，通过台盼蓝拒染试验就细胞活力测定NCM-460细胞(Raimondi F， Crivaro V,Capasso L,Maiuri L,Santoro P,Tucci M,Barone MV,Pappacoda S,Paludetto R 2006 Unconjugated bilirubin modulates the intestinal epithelial barrier function in a human-derived in vitro model. Pediatr Res 60 :30-33)。在该浓度下， B-GOS对细胞活力没有显著影响。B-GOS对诱导细胞因子转录的影响。从起始浓度5X IO5细胞/mL，将NCM-460细胞在6孔平板上培养至融合。当细胞达到70%融合时，将它们以四等份按照如下进行处理⑴阴性对照，(ii)TNF-a或ILl β或鞭毛蛋白(10ng/mL)阳性对照，和(iii)含有 B-GOS (5g/L) m TNF- α或ILl β或鞭毛蛋白(10ng/mL)。18小时之后，通过Trizol-氯仿提取来分离总细胞 RNA。使用 Superscript III Platinum SYBR Green One-Step qRT-PCR 试剂盒，IL-8、MIP-3 α和MCP-I的mRNA表达在MJ Opticon 2上进行测量并相对于GAPDH 的mRNA表达进行标准化。
B-GOS对NF-K B移位的影响。NCM-460细胞在盖玻片上培养至70%融合，然后以两等份按照如下处理10或30分钟(i)阴性对照，(ii)TNF-a (10ng/mL)阳性对照，和(iii) 含有B-G0S(5g/L)的TNF-a (lOng/mL)。移除培养基并将细胞在4%多聚甲醛中固定。用甲醇透化和在含0. 25% BSA的TBS中用10%山羊血清封闭之后，用兔抗人NF-κ B ρ65多克隆抗体来探针检测这些细胞。洗涤之后，用CyTM 3-缀合的山羊抗兔抗体温育这些细胞。 洗涤盖玻片并封固在载玻片上以便在显微镜下观察(Nikon Eclipse TE2000-S)。材料TNF-α细胞因子、ILl β、鞭毛蛋白、抗生蛋白链菌素-HRP和人 CCL20-MIP-3 a ELISA 开发试剂盒(Quantikine)来自 R&D Systems (Minneapo 1 is, MN, USA)。 抗人IL-8和小鼠抗人IL-8抗体来自Pierce Endogen (Woburn，MA，USA)。0-苯二胺片剂来自 Pierce(Rockford,IL,USA)ο Trizol、SuperScript III Platinum SYBR Green One-Step qRT-PCR试剂盒和其它 qRT-PCR所需的试剂来自 hvitrogen (Carlsbad, CA, USA)。DMEM/F12 培养基、CMRL培养基、青霉素、链霉素和Ifepes缓冲液来自GibcoHnvitrogen (Carlskid， CA, USA)。胎牛血清来自 Atlanta Biologicals (Lawrenceville, GA, USA)。M3D 来自 hcell Corp. (San Antonio, TX, USA)。兔抗人 NF-κ B(p65)多克隆抗体来自 Calbiochem(Gibbstown，NJ，USA)。CyTM 3-缀合 F(ab' ) 2 片段山羊抗兔 IgG 来自 Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA)。免疫荧光用的所有其它试剂均来自Vector Lab (Burlingame, CA, USA)。所有的其它试剂均是 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)的分析级或分子生物级。B-低聚半乳糖 B-G0S。Bimuno ⑧由 Clasado Ltd.，Milton Keynes, UK 提供。肠道上皮细胞系。在这些研究中使用了两个成人的肠道上皮细胞培养模型T84 和NCM-460细胞分别是经转化和未经转化的结肠上皮细胞。在37°C下、水蒸汽饱和的95% O2和5 % CO2的气氛中，将细胞在con细胞培养皿中培养。T84培养基由补充有FBS (5 % )、 Hepes缓冲液、谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素和链霉素(12)的DMEM/F12培养基组成。 NCM-460培养基由补充有如上所述的FBS (10%)、青霉素和链霉素(1 的M3D培养基组成。统计学分析。细胞因子的诱导针对具有代表标准误差(SE)的误差线的阳性对照进行标准化。组间比较采用双尾学生t检验(two-tailed Student' s t test)进行。通过qRT-PCR所获得的基因表达数据表示为带有SE的平均值。组间比较在对数变换之后采用学生双尾t检验进行。小于0. 05的ρ值被认为有统计学显著性，并用一个星号(*)表示， 小于0. 01的ρ值用两个星号(**)表示并且小于0. 001的ρ值用三个星号(***)表示。结果在T84细胞中，低聚半乳糖B-GOS对细胞因子分泌的影响(附图1)。在T84细胞中，TNF-α诱导的IL_8分泌被标准化为100%以进行4个独立实验之间的比较。未经处理的T84细胞具有20. 5%的基础IL-8分泌。TNF-α刺激后，IL-8的分泌显著增加到4. 9倍(ρ < 0. 001)。为了确定B-GOS的影响，在低聚半乳糖B-GOS (5g/L)存在下，用或不用TNF-α刺激T84细胞。B-GOS处理的T84细胞所分必的IL-8是16. 4%。这与未经处理的T84细胞的基础水平没有显著差异。用TNF-a刺激后，B-GOS显著减少38. 5%的IL-8的分泌(ρ < 0. 001)。
在NCM-460细胞中，低聚半乳糖B-GOS对细胞因子分泌的影响(附图2、附图5、附图6)。在NCM-460细胞中，TNF- α诱导的IL-8分泌和ΜΙΡ-3 α分泌被际准化为100 %以进行4个独立的实验之间的比较。未经处理的NCM-460细胞分别具有1. 7%,4. 0%的基础 IL-8和ΜΙΡ_3α分泌。TNF-α刺激后，IL-8和ΜΙΡ-3 α分泌分别显著增加到58. 8倍(ρ < 0. 001)(附图 2Α)和 25. 0 倍(ρ < 0. 001)(附图 2Β)。为了确定B-GOS的影响，当低聚半乳糖B-GOS (5g/L)存在时，用或不用TNF-α刺激NCM-460细胞。B-GOS处理的NCM-460细胞所分泌的IL-8和ΜΙΡ-3 α分别是1. 1 %和 3. 9%;这与未经处理的NCM-460细胞的基础水平没有显著差异。用TNF-α刺激后，B-GOS分别显著减少 43. 5% (ρ < 0. 001)的 IL-8 分泌(附图 2Α)和 52. 1% (ρ < 0. 05)的 ΜΙΡ-3 α 分泌(附图2Β)。以同样的方式，当NCM-460细胞在TNF-α刺激之前用B-GOS预洗涤时，即使缺乏B-GOS，IL8的分泌显著减少32% (ρ < 0. 001)(附图6)。这表明B-GOS混合物的组分与上皮受体如toll样受体(TLR)相互作用以防止细胞的炎症刺激。相似地用鞭毛蛋白刺激之后，B-GOS显著减少21. 5%的IL-8分泌(ρ < 0. 05)(附图5)。用ILl β刺激之后，没有观察到影响。为了确定B-GOS是否有细胞毒性，在有或没有B-GOS的情况下，孵育NCM-460细胞 16小时。通过方法中所描述的台盼蓝拒染试验确定B-GOS不影响细胞活力。低聚半乳糖B-GOS对细胞因子表达的影响(附图3)。分离经TNF- α处理的NCM-460细胞的总RNA并用于通过qRT_PCR测定IL_8、 ΜΙΡ-3 α和MCP-I的mRNA表达。当用TNF- α刺激之后，IL-8和ΜΙΡ-3 α的mRNA表达分别显著增加到12. 2倍(ρ < 0. 001)(附图3A)和99. 4倍(ρ < 0. 001)(附图3Β)。在任可处理之间没有观察到MCP-I的mRNA表达发生变化(p = 0. 19)(未附数据)。为了确定B-GOS 的影响，在B-GOS (5g/L)存在时，用TNF- α刺激NCM-460细胞。低聚半乳B-GOS分别显著减少5. 7倍的TNF- α诱导的IL-8的mRNA表达(ρ < 0. 05)(附图3Α)和58. 9倍的TNF- α 诱导的ΜΙΡ-3 α的mRNA表达(ρ < 0. 05)(附图3Β)。MCP-I的mRNA表达被B-GOS所减少， 但是没有达到显著水平(P = 0. 06)(未附数据)。低聚半乳糖B-GOS对NF- κ B移位的影响(附图4)。 用TNF- α (10ng/mL)处理成人结肠NCM-460细胞并就NF- κ B ρ65蛋白的核移位进行测定。在载体处理的对照细胞中(附图4A)，NF-kB p65的染色主要在细胞质中，并且细胞核没有P65蛋白。在TNF- α刺激30分钟后，NF- κ B ρ65清晰地移位入细胞核(附图 4Β)。然而，当B-GOS存在时，TNF- α诱导的NF- κ B的移位在30分钟时被部分地抑制 (附图4C)。实施例2B-GOS在葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎小鼠模型中影响的体内研究材料方法两个组(每组η = 24)的成年C57BL/6 小鼠(Jackson Laboratories，BarHarbour， ME, USA)、常规方法饲养的(CR)小鼠和无菌(BD)小鼠，用于诱导结肠炎。所有的动物都被安置于12小时光/暗循环周期下，并且可以自由的饮水和进食。
在6周龄，常规方法饲养的小鼠被安置在含有未经处理的水的常规条件下(CR 组)，而BD组中的小鼠在它们饮用水中被饲喂2周的抗生素混合物。该抗生素混合物包括卡那霉素(8mg/ml)、庆大霉素(0. 7mg/ml)、粘菌素(34，000U/ml)、甲硝唑(4. 3mg/ml)和万古霉素(0.9mg/ml)。基于年龄组中消耗的平均水量计算抗生素在水中的浓度。在8周龄，两组(CR和BD)中所有小鼠通过喂养含3. 5%DSS(葡聚糖硫酸钠)(MP Biomedicals, Aurora, OH, USA)的饮用水5天而诱导肠结肠炎。在10周龄，各组的一半小鼠开始接受7天的Bimimo (5g/L)。在第10周结束时，将动物安乐死及收集其结肠用于分析。细胞因子测量根据制造商的说明书，通过ELISA(Quantikine，R&D Systems，丽，USA)在结肠组织勻浆上分析鼠IL-6和MIP-2细胞因子。简而言之，收集每组的近端结肠，并用含补充有蛋白酶抑制剂混合物的Triton X-100的PBS缓冲液进行勻浆。将勻浆溶液在12，OOOrpm 下离心10分钟，并将上清等分并且保存于-70°C。结果确定与对照小鼠(没有给予Bimuno)相比，两组小鼠(CR和BD)中Bimuno减少 DSS结肠炎损伤和炎症的能力。在常规DSS-处理的小鼠中，IL-6和MIP-2的分泌被分别显著诱导至2. 2倍(ρ
<0. 0001)和 8. 3 倍(P < 0. 0001)。Bimuno 显著减少 IL-6 和 ΜΙΡ-2 的分泌至 6. 6 倍(ρ
<0. 0001)和 5. 5 倍(ρ < 0. 0001)。在BD的DSS-处理的小鼠中，IL_6和IP_2的分泌被分别显著诱导至6. 2倍(ρ
<0. 0001)和 27. 2 倍(P = 0. 0005)。Bimuno 显著减少 IL-6 的分泌至 3. 6 倍(ρ < 0. 0001)。 MIP-2的分泌被减少至1. 3倍，但是这被认为是不显著的(p = 0. 126)。综上所述，与未处理的小鼠相比，常规DSS处理的小鼠发生了结肠炎。补充有 Bimimo的DSS处理的小鼠具有显著降低的炎症标志物(IL-6和MIP-2)并缓解结肠炎的症状。在无菌的DSS处理的小鼠中观察到同样的效果。这意味着观察到的由于Bimimo的炎症减少不仅仅是通过微生物群落介导的。Bimimo对DSS结肠炎中的肠上皮具有直接的免疫调节作用。实施例3在炎症细胞因子TNF- α存在下，Bimuno低聚半乳糖混合物对ΜΙΡ-3 α和IL-8细胞因子的生产的影响材料和方法从Bimuno混合物收集GOS级分为了分离和收集低聚半乳糖的不同级分(去除乳糖的DP2，DP3和DP > 3)，使用保持在室温下的Biogel Ρ2柱(IOOcmX5cm) (Pharmacia, UK)的尺寸排阻色谱法。所有样品用去离子水以2ml/min的速率洗脱和用132RI探测器(Gilson)进行检测。经由 TENN0JI-KU (Osaka, Japan)所提供的β -半乳糖苷酶BI0LACTA FNS，将乳糖从DP2级分中去除。在40°C、pH 6. 4下，使用IOOmM磷酸钠溶液作为缓冲液和ImM MgCl2作为辅助因子而进行水解。在装配有 LaChrom RI 检测器 L-7490 (Merck)的 RCM-MONOSACCHARIDES Rezex HPLC柱上通过离子排阻和离子交换色谱法，分析每个级分的碳水化合物含量。在84. 4°C下以0. 5ml/min在去离子水中洗脱低聚糖。细胞培养NCM460细胞株，衍生自正常人结肠粘膜上皮，由INCELL CORPORATION LLC提供， 并且在37°C、95%空气和5% CO2的湿度环境中，将其维持在补充有10% [V/V]胎牛血清的 MIBBase 培养基(INCELL CORPORATION LLC)中。测量由NCM460培养物的细胞因子产生将NCM460细胞，以5X105细胞/ml的浓度，接种于M孔板并在37°C、95%空气和 5% CO2下温育。经过M小时的温育后，对应于70%融合，将细胞以三等分用TNF-α (lOng/ ml)(重组人 TNF- α /TNFSF1A-R&D SYSTEMS)、低聚半乳糖的级分(0. 138g/ml 的 DP2 ； 0. 049g/ml的DP3 ；0. 041g/ml的DP > 3)和TNF- α与每个级分的混合物进行处理。对照由培养基中生长的细胞组成。随后将细胞在37°C、95%空气和5% CO2下温育16小时。温育之后，收集上清并将200 μ L等份试样冷冻，在测试之前，在400 X g下离心5分钟。通过ELISA 测定法使用由R&D Systems (MN, USA)提供的QUANTIKINE试剂盒，测定细胞因子(MIP-3 α 和IL-8)的浓度。结果与讨论使用尺寸排阻色谱法收集的3种不同的级分，具有如下量的低聚半乳糖a)级分DP2包括90%的半乳糖双糖，其余的10%是由单糖(1%)、乳糖(6%)、三糖)和五糖(1% )组成；b)级分DP3包括97 %的半乳糖三糖和3 % DP4低聚糖；c)级分DP > 3包括96%的DP4和DP5的低聚半乳糖，和4%的DP3的低聚半乳糖。级分对IL-8和ΜΙΡ-3 α的生产的影响分别显示在附图8 (A)及(B)中。对于这两个实验，级分DP3和DP > 3降低了细胞因子的分泌a)与单独使用TNF-α相比，DP3减少的IL-8产生和25%的ΜΙΡ-3 α产生；b)对于级分DP > 3，IL-8和ΜΙΡ-3 α的减少分别是35%禾口 51%。级分DP2的结果尚不清楚。IL-8分泌的减少是49%，但该级分对ΜΙΡ_3 α的产生没有任何影响。实施例4与Bimuno相比，当炎症细胞因子TNF-α存在时，Bimuno低聚半乳糖混合物的级分对IL-8和ΜΙΡ-3 α的生产的影响材料和方法如实施例3中所述，从Bimuno制备GOS级分。细胞培养从如实施例3所述的相同来源获得NCM460细胞系的细胞培养物，并且以相同的方法进行维持。测量由NCM460培养物的细胞因子产生将NCM460细胞，以5Χ IO5细胞/ml的浓度，接种于M孔板并在37°C、95%空气和5% CO2下温育。24小时的温育后，对应于70%融合，将细胞以三等分用TNF-α (lOng/ ml)(重组人 TNF- α /TNFSF1A-R&D Systems)、以及 TNF- α 和 Bimuno (0· lg/ml)的混合物、TNF- α 和 Bimuno 的 DP = 3 的级分(0. lg/ml)或 TNF- α 与 Bimuno 的 DP > 3 的级分(0. Ig/ ml)进行处理。对照由培养基中生长的细胞组成。细胞然后在37°C、95%空气和5% CO2下温育16小时。温育之后，收集上清并将200 μ L等份冷冻，在测试之前，在400 Xg下离心5 分钟。通过ELISA测定法使用由R&D Systems提供的QUANTIKINE试剂盒，测定细胞因子 (ΜΙΡ-3 α 和 IL-8)的浓度。结果使用尺寸排阻色谱法收集的2种不同的级分，具有如下量的低聚半乳糖a)包括DP3级分b)包括DP > 3级分低聚半乳糖级分和Bimuno对IL_8和ΜΙΡ-3 α的产生的影响分别显示在附图9 (A) 及⑶中。从附图9㈧及⑶可以看出当与Bimuno相比时，级分DP3减少35%以上的 IL-8的产生。当与Bimuno相比时，使用DP3级分减少了 37%以上的ΜΙΡ-3 α的产生。与Bimuno相比，使用DP > 3的级分的IL-8产生的减少为40%以上，并且ΜΙΡ-3 α 产生的减少为55%以上。结论当DP3级分和DP > 3级分以与全部低聚半乳糖混合物(Bimimo)相等的量存在时， 抗炎症的保护作用显著更。
权利要求
1.具有3或更高聚合度的低聚半乳糖，其用途是用于预防或治疗炎性病症。
2.根据权利要求1的用途的低聚半乳糖，其选自三糖Gal( β 1-6) -Gal ( β 1-4) -Glc, Gal ( β 1-3) -Gal ( β 1-4) -Glc,四糖 Gal ( β 1-6) -Gal ( β 1-6) -Gal ( β 1-4) -Glc 和五糖 Gal ( β 1-6)-Gal (β 1-6)-Gal (β 1-6)-Gal (β 1—4)-Glc。
3.根据权利要求1或2的低聚半乳糖，其用途是用于预防或治疗肠道炎性病症。
4.根据权利要求1至3的任一项的低聚半乳糖，其用途是用于预防或治疗结肠炎、肠坏死性结肠炎、假膜性结肠炎、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、憩室炎、缺血或炎性肠病。
5.根据权利要求1至4的任一项的低聚半乳糖，以粉末、糖浆或以软锭剂的形式存在。
6.根据权利要求5的低聚半乳糖，其中每天使用Ig-IOg低聚半乳糖，优选2g-5g低聚半乳糖，最优选2. 75g低聚半乳糖，以治疗炎性病症。
7.根据权利要求5的低聚半乳糖，其中每天使用Ig-IOg低聚半乳糖，优选2g-5g低聚半乳糖，最优选2. 75g低聚半乳糖，以预防炎性病症。
8.具有3或更高聚合度的低聚半乳糖在预防或治疗炎性病症中的用途。
9.根据权利要求8的用途，其中低聚半乳糖选自三糖Gal( β 1-6) -Gal ( β 1-4) -Glc, Gal ( β 1-3) -Gal ( β 1-4) -Glc,四糖 Gal ( β 1-6) -Gal ( β 1-6) -Gal ( β 1-4) -Glc 和五糖 Gal ( β 1-6)-Gal (β 1-6)-Gal (β 1-6)-Gal (β 1—4)-Glc。
10.一种治疗和/或预防炎性病症的方法，包括口服给予哺乳动物有效量的具有3或以上聚合度的低聚半乳糖。
11.根据权利要求10的方法，其中低聚半乳糖选自三糖Gal( β 1-6) -Gal ( β 1-4) -Glc, Gal ( β 1-3) -Gal ( β 1-4) -Glc,四糖 Gal ( β 1-6) -Gal ( β 1-6) -Gal ( β 1-4) -Glc 和五糖 Gal ( β 1-6)-Gal (β 1-6)-Gal (β 1-6)-Gal (β 1—4)-Glc。
12.根据权利要求10或11的方法，其中炎性病症是肠道炎性病症。
13.根据权利要求10的方法，其中炎性病症是结肠炎、肠坏死性结肠炎、假膜性结肠炎、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、憩室炎、缺血或炎性肠病。
14.根据权利要求10的方法，其中哺乳动物是人。
15.根据权利要求10的方法，其中低聚半乳糖是以粉末、糖浆或以软锭剂的形式给予。
16.根据权利要求10的方法，其中用于治疗炎性病症的活性低聚半乳糖的有效每日剂量是lg-lOg，优选2g-5g，最优选2. 75g。
17.根据权利要求10的方法，其中用于预防炎性病症的活性低聚半乳糖的有效每日剂量是lg-lOg，优选2g-5g，最优选2. 75g。
全文摘要
本发明涉及低聚半乳糖在预防或治疗炎性病症，特别是肠道炎性病症中的用途。
文档编号A61P29/00GK102427818SQ201080018040
公开日2012年4月25日 申请日期2010年4月23日 优先权日2009年4月23日
发明者F·阿塔纳西奥, G·恰佐尔提斯, J·武莱维奇 申请人:科拉萨多公司