专利名称：具有抑制血小板凋亡活性的一种穿膜糖蛋白寡肽或其修饰物/衍生物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的合成的可穿膜寡肽，其氨基酸序列及其抑制GPIb-IX与VWF
结合诱导的血小板凋亡的能力。 本发明属于分子生物学和血液病学范畴。
背景技术：
细胞凋亡是生命的基本特征之一，是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自
身的程序，由基因控制的细胞自主性死亡过程。细胞正常的凋亡功能是维持机体正常生长 发育和内环境稳定的前提，凋亡失衡可导致许多疾病的发生。 血小板是参与血栓、特别是动脉血栓形成的主要有形成份。近几年的研究发现，血 小板同样表达死亡受体、半胱氨酸蛋白酶caspases及Bcl-2蛋白家族等凋亡调控蛋白，可 发生凋亡。机体内血小板凋亡可能引起皮肤、黏膜、内脏出血为特点的疾病。血栓性血小板 减少性紫癜(TTP)是一种少见的微血管血栓-出血综合症，该病起病急骤，常于短期内死 亡，至今仍是一种潜在致死性疾病。TTP的主要病理特征为血小板减少、贫血，可引起脑部 等广泛性继发出血。TTP的发病机制目前认为是患者有广泛的微血管内皮细胞损伤导致释 放大量异常的超大分子量血管性血友病因子(uLVWF)多聚体，与VWF多聚体相比，uLVWF与 血小板表面的VWF膜糖蛋白(Glycoprotein, GP) Ib-IX受体具有更高的亲和性，在血流剪 切力的作用下uLVWF与GPIb-IX的结合介导血小板的粘附与聚集，促进循环中的血小板形 成微血栓，导致大量血小板消耗性减少。研究显示，病理情况下，血小板GPIb-IX复合物与 VWF的结合使得血小板以滚动方式粘附在损伤的血管内皮表面，与此同时，启动血小板细胞 信号转导机制，导致血小板内发生Ca++浓度增加，蛋白质磷酸化，PI3K、 PKC活化，ADP释放 等一系列反应，从而诱导血小板表面另一受体GPIIb/IIIa(integrin alpha lib beta3)的 活化，活化的GPIIb/IIIa与血浆中纤维蛋白原结合，最终导致血小板相互聚集成团，形成 血小板血栓，因此，血小板表面GPIb-IX与VWF的结合是血小板参与血栓形成、止血的起始 关键步骤。我们的最新研究表明，GPIb-IX受体与VWF的结合不仅可以诱导血小板的活化 和聚集反应，同时可以启动血小板胞内凋亡信号，诱导血小板凋亡的发生，此过程中细胞内 信号分子14-3-3蛋白与GPIbaC胞质结构域的结合起着关健作用。 血小板表面凋亡标志物磷脂酸丝氨酸(PS)的表达是内皮网状系统识别并清除循 环中凋亡血小板的标志，因此，除了血小板血栓形成以外，GPIb-IX与VWF结合诱导的血小 板凋亡 可能是导致TTP患者体内血小板减少的另一主要机制。有效抑制血小板的减少， 是治疗TTP疾病的一个基本思路和有效途径。目前国内外临床上常用血浆置换、抗血小板 药物等抑制血小板活化的方法治疗TTP疾病，基于我们已有的研究基础，以抑制GPIba与 VWF结合诱导的凋亡发生为靶标，创制一种可抑制血小板的始动凋亡途径，从而抑制血小 板减少或活性丧失的新型抗血小板凋亡药物，必将会对TTP疾病的治疗产生意想不到的效
3果，同时亦可有望提高医用血小板体外储存期。在GPIb的胞质结构域，已知有3个14-3-3 蛋白结合位点，分别为GPIba 609位点，GPIba 587-590位点和GPIb P 166位点，这些位点 都是以磷酸化Ser为中心的结构域。其中GPIba 609位点的存在是14_3_3蛋白与GPIb稳 定结合的前提。本发明在现有研究基础上，本室研究创建了新的可穿膜寡肽。
发明内容
本发明目的合成新的可穿膜寡肽，对其抑制血小板凋亡的功能进行研究验证，最 终创制一种具有自主知识产权，可有效抑制血小板凋亡，对TTP等血小板减少疾病的治疗 以及提高医用血小板体外储存期具有潜在应用价值的新型药物。 技术方案本发明分别应用瑞斯托霉素和高剪切力诱导血小板GPIb-IX受体和 VWF的结合，流式细胞术和Western-blot技术检测血小板与VWF的结合情况及血小板凋亡 指标；瑞斯托霉素分别诱导VWF与表达GPIba野生型(lb9) 、GPIba_551 (不含GPIba_551氨 基酸以后的C-末端序列，A 551)和GPIba-609A(GPIba 609位点Ser突变为Ala， S609A) 三种细胞株结合，检测各细胞株的凋亡指标；基于GPIba胞质C-末端氨基酸序列(GPIba 605-610位点)设计合成新的GPIba 609Ser磷酸化可穿膜寡肽，瑞斯托霉素诱导血小板 GPIb-IX和VWF的结合实验对可穿膜寡肽功能进行研究。结果表明可穿膜寡肽可有效抑制 GPIb-IX与VWF结合诱导的血小板凋亡。
本发明的优点在于 1.可穿膜寡肽可特异性的抑制血小板GPIba与VWF结合诱导的凋亡信号，即对血 小板凋亡的起始有抑制作用。 2. —定浓度的可穿膜寡肽，可完全抑制GPIba与VWF结合诱导的血小板凋亡，具有 良好的药物开发潜力。 3.可穿膜寡肽分子量较小，对人体免疫原性低，可直接用于人体。 4.可穿膜寡肽分子结构稳定，易于合成与纯化，可大量生产，具有广阔的产业化前
旦 豕。 现有国内外临床上只是从抑制血小板活化角度治疗TTP等血小板减少性疾病，尤 其是医用血小板体外储存时，血小板容易发生凋亡，导致其储存期大大縮短。因此，本发明 有望从另一全新角度治疗血小板减少性疾病，同时有望大大提高医用血小板体外储存期。
图1显示瑞斯托霉素诱导的血小板GPIb-IX受体和VWF的结合结果。
图2显示在瑞斯托霉素诱导下GPIb-IX和VWF结合诱导的血小板凋亡指标检测结 果。A为GPIb-IX和VWF结合诱导血小板PS暴露；B， C分别为GPIb-IX和VWF结合诱导血 小板膜电位降低和gelsolin蛋白的酶切。 图3显示在高剪切力作用下GPIb-IX和VWF结合诱导的血小板凋亡指标检测结 果。A为PS暴露；B， C分别为膜电位降低和gelsolin蛋白的酶切。 图4显示瑞斯托霉素诱导下GPIb-IX和VWF结合诱导的各细胞株凋亡指标检测结 果。A为PS暴露；B，C分别为膜电位降低和gelsolin蛋白的酶切。
图5显示本发明合成的可穿膜寡肽的氨基酸序列。
图6显示在瑞斯托霉素诱导下可穿膜寡肽(100 ii M)对GPIb-IX和VWF结合诱导 的血小板凋亡指标表达的影响。A为可穿膜寡肽(100 M)抑制GPIb-IX和VWF结合诱导的 PS暴露；B， C分别为可穿膜寡肽(100 iiM)抑制膜电位降低和gelsolin蛋白的酶切。6AP 为可穿膜寡肽，6A为对照寡肽，匿S0为阴性对照。
具体实施例方式
以下借助非限制性实施例举例详细描述本发明。 实施例1 :瑞斯托霉素诱导的血小板GPIb-IX和VWF结合及血小板凋亡特征性指 标检测。 1.材料与试剂VWF (本室自备)；抗VWF单克隆抗体SZ29由阮长耿院士馈赠(苏 州大学)；Annexin V-FITC试剂盒、TMRE染料购自Bender Medsystem公司；瑞斯托霉素、单 克隆gelsolin抗体购自Sigma公司；FITC-羊抗鼠IgG购自Santa Cruz公司；其余均为国
产分析纯试剂；新鲜健康人全血。
2.方法 健康人全血ACD(2.5X柠檬酸三钠，2.0X D_葡萄糖，1. 5%柠檬酸)抗凝，分离 富含血小板血浆(PRP)。使用血小板洗涤液CGS(O. 12M NaCl，O. 0129M柠檬酸三钠，0. 03M D-葡萄糖，O. 1X牛血清白蛋，pH 6. 5)洗涤后，Modified Tyrode，s Buffer(2.5mM H印ese， 150mMNaC1，2. 5mM KCl，12mM NaHC03，5.5mM D-葡萄糖，lmM CaCl2， lmM MgCl2， lmg/mlBSA， pH 7. 4)重悬血小板浓度至3X 107ml，室温静止1_2小时。 (1)瑞斯托霉素诱导的血小板GPIba与VWF结合检测实验稀释血小板至终浓度 5X 107mL，与瑞斯托霉素(终浓度为1. Omg/mL)和VWF(终浓度为35 y g/mL)室温共孵育 30分钟，洗涤1次后，分别继续与单克隆抗体SZ29和FITC-羊抗鼠IgG室温孵育30分钟， 流式细胞术检测VWF的结合。瑞斯托霉素(1.0mg/mL)处理组为对照。由图l可见，瑞斯托 霉素可诱导较高比例的血小板与VWF结合。 (2)瑞斯托霉素作用下GPIba与VWF结合诱导的血小板凋亡指标检测实验A. PS 暴露检测稀释血小板至终浓度5X107mL，与瑞斯托霉素(1. Omg/mL)和VWF (35 y g/mL)室 温共孵育30分钟，洗涤1次后，Annexin V binding buffer(10mM H印es， 10mM NaOH， 140mM NaCl，2.5mM CaCl2，PH 7.4)重选血小板，以1 : 50的比例加入Annexin V-FITC，室温避光 孵育15分钟，流式细胞术检测血小板表面PS表达情况。由图2A可见，GPIba与VWF结合 导致了PS暴露。B.血小板内膜电位检测稀释血小板至终浓度5X107mL，与瑞斯托霉素 (1. Omg/mL)和VWF (35 ii g/mL)室温共孵育30分钟，加入TMRE (tetramethyl-rhodamine-et hylester， 100nM)荧光燃料于37"C避光孵育20分钟，流式细胞术检测内膜电位。由图2B可 见，GPIba与VWF结合导致了血小板内膜电位的降低(荧光结合降低)。C. gelsolin蛋白酶 切检测血小板(浓度为3X 107ml)与瑞斯托霉素(1. Omg/mL)和VWF (35 y g/mL)室温共孵 育30分钟，加入lysis buffer(O. lmM E64， lmMphenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) and 1/100即rotinin)冰上裂解30分钟，利用gelsolin特异性抗体(1 : 2500) 、Western-blot 技术检测gelsolin蛋白酶切状况。由图2C可见，GPIba与VWF结合诱导了骨架蛋白 gelsolin的酶切。 实施例2 :高剪切力作用下GPIb-IX和VWF特异性结合诱导血小板凋亡。
1.材料与试剂VWF (本室自备)；Annexin V-FITC试剂盒、TMRE染料购自 BenderMedsystem公司；单克隆gelsolin抗体购自Sigma公司；抗GPIba单克隆抗体AK-2 购自Research Diagnostics公司；锥形板黏度计；其余均为国产分析纯试剂；新鲜健康人全血。 2.方法 体外分离健康人血小板，方法同实施例1。加入纯化的VWF(35 ii g/mL)于血小板 (浓度为3X 107ml)中，利用锥板黏度计对血小板在剪切率高达7000s—1条件下剪切90s， 立即收集处理的血小板，分别检测血小板凋亡指标，方法同实施例1。为了验证高剪切力作 用下血小板凋亡来自于GPIba与VWF的特异性结合，血小板首先于室温和AK-2抗体(终浓 度为20 g/mL)孵育5分钟，然后在7000s—1剪切率条件下剪切90s，分别检测血小板凋亡 指标。由图3可见，高剪切力作用下，GPIb-IX和VWF特异性结合可诱导血小板的凋亡。
实施例3 :GPIb-IX和VWF结合诱导不同细胞株凋亡指标的检测。
1.材料与试剂VWF (本室自备)；Annexin V-FITC试剂盒、TMRE染料购自 BenderMedsystem公司；瑞斯托霉素、单克隆gelsolin抗体购自Sigma公司；其余均为国产 分析纯试剂；lb9、 A 551和S609A细胞株(本室自备)。
2.方法 lb9、 A 551和S609A细胞株分别被重悬在Modified Tyrode， s Buffer(2.5mM H印ese，150mM NaCl，2.5mM KCl，12mM NaHC03，5.5mM D-葡萄糖，lmM CaCl2， lmM MgCl2， lmg/mlBSA， pH 7. 4)至终浓度2. 5X 106/mL，将三株细胞分别与VWF (35 y g/mL)和瑞斯托 霉素(l.Omg/mL)室温孵育30分钟，然后分别检测PS暴露、内膜电位，方法同实施例1。检 测gelsolin蛋白的酶切状况，孵育过的细胞中加入lysis buffer(O. 2mM E64， lmM PMSF， and 0. 08U/mL即rotinin)于冰上裂解30分钟，然后于2000Xg离心5分钟除掉细胞核，利 用gelsolin特异性抗体(1 : 2500) 、Western-blot技术检测溶液中gelsolin蛋白酶切状 况。由图4可见，瑞斯托霉素诱导的GPIba和VWF结合诱导了 lb9细胞的凋亡，但是未诱导 A 551和S609A细胞株的凋亡，表明14_3_3蛋白与GPIba胞质结构域的结合起着关键的调 控作用。 实施例4 :可穿膜寡肽对GPIba和VWF结合诱导的血小板凋亡影响的研究。 [OO37] 1.材料与试剂可穿膜寡肽(序列如图5所示)；VWF(本室自备)；A皿exin V-FITC试剂盒、TMRE染料购自Bender Medsystem公司；瑞斯托霉素、单克隆gelsolin抗体 购自Sigma公司；其余均为国产分析纯试剂；新鲜健康人全血。
2.方法 体外分离健康人血小板，方法同实施例1 。可穿膜寡肽(100 M)与血小板(浓度 为3X 107ml)室温共孵育10分钟，同时取寡肽溶剂匿SO作为对照(另1种合成的寡肽同 为对照)，加入瑞斯托霉素(1. Omg/mL)和VWF (35 y g/mL)继续于室温共孵育30分钟，分别 检测血小板PS暴露、内膜电位及gelsolin蛋白的酶切，方法同实施例1中(2)。由图6可 见，可穿膜寡肽对GPIba和VWF结合诱导的血小板凋亡指标表达有有效的抑制作用。
氨基酸序列表
YSGHS(p)L [OO42] (p)是指丝氨酸(S)磷酸化。
专利序列.ST25. txt
SEQUENCE LISTING
〈110〉北京航空航天大学 〈120〉 一种血小板膜糖蛋白寡肽或其修饰物/衍生物以及它们的应用 <130>Acritical role for 14-3-3 「protein in regulating the
VWF-GPIbabinding—mediated platelet apoptosis〈160>1〈170>PatentIn version 3. 3〈210>1〈211〉6〈212>PRT<213>Artifical sequence〈220〉〈221〉M0D_RES〈222〉 (3) (3)<223>PH0SPH0RYLATI0N〈400>1YSGHS LTyr Ser Gly His Ser Leu1 权利要求
一种可穿膜寡肽，其特征在于该寡肽的氨基酸序列为YSGHS(p)L，其中(p)是指丝氨酸(S)磷酸化。
2. —种如权利要求1所述的寡肽的修饰物，其特征在于，所述寡肽的修饰物是对寡肽YSGHS (p) L的N端进行修饰后得到的产物，所述修饰包括化学修饰和具有膜穿透作用的多肽修饰。
3. 如权利要求2所述的寡肽的修饰物，其特征在于，所述化学修饰为十四烷酰化修饰和十六烷酰化修饰。
4. 如权利要求3所述的寡肽的修饰物，其特征在于，所述化学修饰为十四烷酰化修饰。
5. 如权利要求2所述的寡肽的修饰物，其特征在于，所述多肽修饰为HIV-TAT修饰。
6 . —种如权利要求l所述的寡肽的衍生物。
7. 如权利要求1 6中任一项所述的寡肽或其修饰物/衍生物的应用，其特征在于，用于选择性地阻断血小板膜糖蛋白Ibalpha与VWF结合诱导的血小板凋亡，从而抑制其所对应的血小板减少现象。
8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于，用于制备治疗TTP等血小板减少相关疾病或预防医用血小板体外储存时失活的药物。
9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于，用于与血小板膜糖蛋白Ibalpha与VWF结合诱导的凋亡所对应的有关血小板减少相关疾病；所对应的血小板失活现象为医用血小板体外储存时间的縮短。
10. 如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述动脉血栓性疾病包括心肌梗塞和脑梗塞。
全文摘要
本发明涉及一种能够抑制血小板凋亡功能的寡肽Y-S-G-H-S(p)-L或其修饰物/衍生物，以及该寡肽Y-S-G-H-S(p)-L或其修饰物/衍生物在治疗血栓性血小板减少性紫癜(TTP)等血小板减少性疾病以及提高医用血小板体外储存期方面的应用。本发明的寡肽或其修饰物/衍生物能够完全抑制GPIba与VWF结合诱导的血小板凋亡现象，从而有望治疗血小板减少相关疾病，同时有望提高医用血小板体外储存期。因此，本发明的寡肽或其修饰物/衍生物可用于临床抗TTP等患者体内血小板减少或提高医用血小板体外储存期药物的研发。
文档编号A61P7/02GK101747413SQ20091024434
公开日2010年6月23日 申请日期2009年12月29日 优先权日2009年12月29日
发明者戴克胜, 李素萍 申请人:北京航空航天大学