通用甲型流感疫苗的制作方法

专利名称：通用甲型流感疫苗的制作方法
通用甲型流感疫苗本申请要求2010年8月16日提交的序列号61/374，024和2011年5月17日提交的序列号61/487，004的权益。本发明是在国立卫生研究院授予的HHSN266200500030C下由政府资助完成。政府对本发明拥有某些权利。该公开中所引用的每个参考文献通过引用全文纳入本文。
背景技术：
甲型流感病 毒是一种负义、单链、分节段RNA病毒，其含有8个RNA区段，编码11种蛋白(HA、NA、NP、M1、M2、NS1、NEP/NS2、PA、PB1、PB1-F2、PB2)。基质蛋白 2 (M2)是甲型流感病毒的四聚体跨膜蛋白。其胞外域(M2e)显示甲型流感病毒株中的保守性。M2e_特异性抗体虽然是非中和抗体，但能降低动物中大范围甲型流感病毒株感染的严重程度。3’4甲型流感核蛋白(NP)是核糖蛋白(RNP)复合物主要的蛋白成分，其也相对保守，这使其成为通用流感疫苗的有力候选。虽然NP蛋白可诱导抗体应答，但该抗体提供保护的作用仍受争议。5’6NP在小鼠和人中诱导强烈的CD8+T细胞应答7’8，如流行病学研究所提示其可有助于抵抗甲型流感病毒感染后的严重疾病。9已试验了各种策略来开发通用流感病毒。大多数策略聚焦在表达流感病毒Ml、M2或NP的疫苗上，3’4’1(1_14’22其在各种毒株中相对保守。Ml和NP均是人体中CD8+T细胞的主要靶标，而M2的胞外域结合非中和抗体，该非中和抗体提供一些(虽然很有限)保护作用。尽管流行病学的证据支持开发针对甲型流感病毒的CD8+T细胞疫苗，9但在动物模型中，CD8+T细胞在针对甲型流感病毒提供保护中的有效性仍受争议；虽然一些研究者报道了诱导保护，22但其他报道了缺乏功效23或甚至病毒攻击之后疾病发生恶化。24我们所研究的诱导高频率NP-特异性CD8+T细胞的疫苗例如表达NP的Ad载体，也只能提供微弱的保护。M2e在天然甲型流感病毒感染中免疫原性较弱，因为其在病毒颗粒上少量表达。25人们开发感染后的M2e特异性抗体但效价较低并且不持久。26在小鼠和雪貂中进行的几个研究表明M2e特异性抗体可限制后续病毒复制并降低广泛范围甲型流感病毒株的发病率和死亡率。3’4虽然已描述M2e在不同毒株间的变异性上相对保守27并且只表达一种M2e形式的疫苗可能因此缺乏针对具有M2e突变的毒株的功效。同样显示抗M2e的抗体选择逃逸突变体。28已测试许多疫苗平台3’4’1(1_14并且其中有数种例如M2e_乙肝病毒核心蛋白疫苗随后进行了确定其安全性和免疫原性的早期临床测试。

图1A-C.M2e (3) -NP 融合蛋白。图 1A.构建体中三种 M2e 和 A/Fort Monmouth/1/47病毒的氨基酸序列。H1N1-M2e, SEQ ID NO:1;H5N1-M2e, SEQ ID NO: 2;H7N2-M2e, SEQ IDN0:3;H1N1-M2e, SEQ ID N0:4。图1B.嵌合 M2e (3)-NP 基因的示意图。图 1C.相比 β-肌动蛋白，受感染细胞中不同载体的M2e (3)-NP蛋白表达。*相同亚株。图2A-B.C57B1/6小鼠或ICR小鼠的体液应答。图2A.将表达H1N1、H5N1或H7N2的M2的三种细胞系用于细胞ELISA以测定在初次免疫3个月后或加强免疫5周后收获的C57B1/6小鼠(n=10)血清中M2e特异性抗体效价。图2B.在初次免疫3个月后或加强免疫5周后收获的ICR小鼠(n=10)血清中的M2e特异性抗体效价。*ρ〈0.05;**ρ〈0.01。图3Α-Β.C57B1/6小鼠中的NP特异性CD8+T细胞应答。图3Α.对接种疫苗2、5、8、10和12周后的小鼠(n=10)PBMC进行NP特异性⑶8+Τ细胞的胞内INF-Y染色。初免一加强小鼠(实心圆)，初次免疫小鼠(空心方块)。图3B.初次免疫4个月后或加强免疫2个月后，通过四聚体染色检测肺、血液和脾脏中NP特异性⑶8+T细胞频率。*p〈0.05;**p<0.01。图4A-F.抗攻击的保护作用。图4A.初次免疫四个月后或加强免疫2个月后，用IOLD5tl的A/PR/8病毒攻击C57B1/6小鼠。5天后测定肺病毒效价。图中显示单个小鼠每克组织的病毒基因组(vgs)效价(空心圆)或作为几何平均效价(X)。初免一加强免疫小鼠(n=15)对比原初小鼠((n=10)，p=0.0003，初次免疫的小鼠(n=10)对比原初小鼠(n=10)，p=0.2。图4B.经10LD50A/PR/8攻击后的体重降低;接种疫苗小鼠(实心圆)，原初小鼠(空心圆)。图4C.经10LD5(IA/Fort Monmouth病毒攻击后的体重降低；接种疫苗小鼠(实心圆)，原初小鼠(空心圆)。图4D.经A/PR/8攻击后的小鼠存活曲线；接种疫苗的小鼠(n=9)对比原初小鼠(n=9)，p=0.0002。图4E.经A/Fort Monmouth病毒攻击后的小鼠存活曲线；接种疫苗的小鼠(n=9)对比原初小鼠(n=9)，p=0.0002。图4F.来自接受初免一加强的小鼠和原初小鼠的经染色肺切片，两者都在用10LD5(lA/PR/8病毒攻击5天后收获。以100 X放大倍数显示HE染色切片。图5A-E.1CR和BALB/c小鼠的保护。图5A.，初次免疫4个月后或加强免疫2个月后，用10LD5(iA/PR/8攻击ICR小鼠。攻击5天后测定肺病毒效价。图中显示单个小鼠每克组织的vgs效价(空心圆)或作为几何平均效价(X)。图5B.BALB/c小鼠的病毒效价。图5C.经150LD5(iA/PR/8攻击的ICR小鼠的体重下降；接种疫苗的小鼠(实心圆);对照小鼠(空心圆);接种疫苗小鼠的存活率(n=10)对比AdC68rab.gp免疫小鼠(n=10)，p=0.01。图5D.经150LD50A/PR/8病毒攻击的ICR小鼠的存活曲线；接种疫苗的小鼠(实心圆);对照小鼠(空心圆);接种疫苗小鼠的存活率(n=10)对比AdC68rab.gp免疫小鼠(η=10)，ρ=0.01。图5Ε.用IOLD50的A/PR/8攻击5天后收获的肺HE-染色切片(100Χ放大倍数)。图6.老年小鼠的保护。老龄和幼龄C57B1/6小鼠用AdC68M2e (3)-NP初次免疫并在2个月后用AdC6M2e (3) -NP加强免疫。3个月后接种疫苗且年龄匹配的原初小鼠用3LD50DA/Fort Monmouth病毒攻击。攻击5天后测定肺病毒效价。接种疫苗的老龄小鼠(n=8 )对比对照老龄小鼠(n=10)，p=0.3。接种疫苗的幼龄小鼠(n=8)对比对照幼龄小鼠(n=10)，p=0.03。图7A-D.保护的关联性。图7Α.β2_微球蛋白敲除小鼠的保护。图中显示经10LD50A/PR/8病毒攻击后原初和接种疫苗(初免/加强方案)的小鼠的存活曲线。接种疫苗的小鼠(n=6)对比原初小鼠(n=6)，p=0.2。图7B.通过免疫血清过继转移的保护。从接种有AdC68M2e(3)-NP/AdC6M2e(3)-NP载体的C57B1/6小鼠中收获的1.0ml血清给予C57B1/6小鼠。原初小鼠接受1.0ml原初血清。24小时后，用10LD5(lA/PR/8病毒攻击小鼠。图中显示存活曲线。接受免疫血清的小鼠(n=10)对比对照小鼠(n=10)，p=0.02。图7C.通过四聚体染色测 定(d)中所示相同小鼠血液攻击前一天的NP-特异性⑶8+T细胞频率。图7D.有或没有免疫血清转移，接种AdC68NP小鼠的保护作用。图中显示该存活曲线。AdC68NP-免疫C57B1/6小鼠组(每组n=10)注射1.0ml来自经AdC68M2e (3)-NP/AdC6M2e (3) -NP初免一加强的C57B1/6小鼠血清。向另一接种AdC68NP的小组给予1.0ml原初血清/小鼠。对照组接受1.0ml原初血清/小鼠。AdC68NP+免疫血清小鼠对比原初小鼠，p=0.01。接种AdC68NP的小鼠对比原初小鼠，p=0.09。接种AdC68NP/AdC6NP的小鼠对比原初小鼠，P=0.2。图8.经10LD5(iA/PR/8病毒攻击后原初和接种疫苗(初免/加强免疫方案)的小鼠的存活曲线。
具体实施例方式通用流感疫苗设计成诱导针对当前和未来甲型流感毒株的广泛交叉反应性免疫。该疫苗使用一种独特适于诱导有效且持久免疫应答的疫苗平台。下文具体实施例中报道的实验证实一种基于连续免疫的疫苗方案诱导抗M2e抗体和对NP病毒-特异性的CD8+T细胞，所述免疫用两种血清学不同的黑猩猩衍生复制缺陷型腺病毒(Ad)载体，所述载体表达与流感病毒核蛋白(NP)融合的来自3种不同甲型流感毒株的基质-2蛋白胞外域(M2e)。在临床前小鼠模型中，表达M2e和NP的Ad疫苗引起强烈的NP-特异性CD8+T细胞应答和对所有3种M2e序列的中等抗体应答。抗体和CD8+T细胞应答均可通过用Ad载体二次免疫加强。用AdC68M2eNP载体初次免疫或先初次免疫再用AdC6M2eNP载体加强免疫的近交以及远交小鼠显示对不同甲型流感病毒株攻击所产生的稳固保护。用高剂量的不同流感病毒株攻击后，接种疫苗的小鼠受到针对发病和死亡的保护。例如，获得抗A/PR/8/34病毒的保护作用，NP和M2e序列之一来自该A/PR/8/34病毒；然而，也获得抗A/FortMonmouth/1/47的保护作用，所述A/Fort Monmouth/1/47携带不同于疫苗表达的M2e序列。相反，虽然所述 疫苗诱导有效的NP-特异性CD8+T细胞应答，但基于黑猩猩血清型68的复制缺陷型腺病毒载体的疫苗在小鼠中显示抗A/PR8感染的功效有限，所述载体表达流感病毒A/PR8的核蛋白(NP)。融合多肽本文所述通用流感疫苗提供包含至少两种组分的融合多肽，所述组分获自至少两种不同的甲型流感毒株。在一些实施方式中，融合多肽包含(I)来自第一甲型流感病毒株的第一基质蛋白胞外域(M2ei);和(2)来自第二甲型流感病毒株的核蛋白(NP)。在一些实施方式中，融合多肽还包含来自第二甲型流感病毒株的第二基质蛋白胞外域(M2e2)。在包含两种基质蛋白胞外域和一种核蛋白的实施方式中，这三种组分中至少两种来自不同的甲型流感病毒株。在其它实施方式中，所有三种组分来自不同的甲型流感病毒株。所述两种(或三种)组分可任意排序。在一些实施方式中，融合多肽包含四种组分，所述组分获自至少两种不同的甲型流感病毒株:(I)来自第一甲型流感病毒株的第一基质蛋白胞外域(M2ei) ；(2)来自第二甲型流感病毒株的第二基质蛋白胞外域(M2e2) ；(3)来自第三甲型流感病毒株的第三基质蛋白胞外域(M2e3);以及(4)来自第四甲型流感病毒株的核蛋白(NP)。可获得融合多肽组分的合适甲型流感病毒株包括:H1N1 (例如A/PuertoRico/8/1934;A/Fort Monmouth/1/1947)、H5N1 (例如 A/Hong Kong/483/1997)、H7N2 (例如 A/Duck/Tasmania/277/2007)、H1N2 (例如 A/Swine/Korea/CY02/02)、H2N2 (例如 A/Leningrad/134/17/57)、和 H3N2 (例如 A/New York/392/2004) 在一些实施方式中,第一毒株是HlNl毒株。在一些这类实施方式中,HlNl毒株是A/Fort Monmouth/1/1947。在其它实施方式中，HlNl 毒株是 A/Puerto Rico/8/1934。在一些实施方式中，第一毒株是H5N1毒株。在一些这类实施方式中,H5N1毒株是A/Hong Kong/483/1997。在一些实施方式中,第一毒株是H7N2毒株。在一些这类实施方式中,H7N2毒株是A/Duck/Tasmania/277/2007。在一些实施方式中，第四毒株是HlNl毒株。在一些实施方式中，第一和第四毒株都是HlNl毒株并可以相同或不同。在一些这类实施方式中，第一 HlNl毒株是A/FortMonmouth/1/1947。在其它实施方式中，第一 HlNl 毒株是 A/Puerto Rico/8/1934。在一些实施方式中，四种组分按N到C末端顺序为M2e1 — M2e2 — M2e3 — NP。在一些实施方式中，NP 和 Μ2θι 来自 A/Puerto Rico/8/1934 ；Μ2θι 来自 A/Hong Kong/483/1997 ；且 M2e3 来自 A/Duck/Tasmania/277/2007。虽然下述具体实施例中来自三种毒株的M2e组分的顺序为HlNl — H5N1 一 H7N2，但它们可以任意顺序使用。核酸分子:腺病毒载体使用标准的重组核酸技术能构建编码融合多肽的核酸分子(核糖核酸或脱氧核糖核酸任一种)，例如下文实施例所述。完善Ad载体的产生、纯化和质量控制方法。17Ad载体诱导先天免疫应答，改善添加佐剂的需要。它们也诱导非常强烈的B细胞和CD8+T细胞应答，由于载体的低水平持久性，该应答显著持续。29通过使用来自其它物种例如黑猩猩(其一般既不在人中流通也不与人血清型交叉反应3°)的血清型能容易避免抗Ad病毒常见人血清型如血清型5的预存在中和抗体，所述抗体影响疫苗功效17。在需要初免一加强方案来获得足够效力的免疫应答的情况下，基于不同Ad血清型的载体可用。17Ad病毒和Ad载体已广泛用于其耐受良好的临床。它们可通过各种途径应用，途径包括黏膜途径例如气道31或甚至衣壳化后口服，如由美军所使用Ad病毒4和7的疫苗所示。32删除El的腺病毒载体为本领域技术人员熟知，并已例如在参考文献17中描述。优选地，腺病毒是来自非人物种的血清型，例如黑猩猩(例如AdC68或AdC6)。也可参见参考文献19和31。疫苗组合物；免疫方法可使用标准技术配制通用流感疫苗，除了编码融合多肽的El已删除腺病毒以外，所述疫苗还可包含药学上可接受的载剂例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或其缓冲液，以及其它组分例如抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂、佐剂等。在一些实施方式中，疫苗组合物与一种或多种其它疫苗联合给予，其它疫苗包括其它流感疫苗(例如季节性疫苗)。在一些实施方式中，其它流感疫苗是基于肽的通用流感疫苗(例如美国专利7，354，589和美国专利 7，527，798)。

可将通用流感疫苗给予需要的个体，以诱导针对获得该疫苗组分毒株以外的甲型流感病毒株的免疫应答。在一些实施方式中，给予遵循“初免一加强”方案，其中第二剂疫苗在第一剂的一段时间后(例如第一剂后1、2、3或4周或1、2、3或4个月)提供。一般剂量范围是IO7-1O11病毒颗粒。给予方法包括但不限于:粘膜(例如鼻内)、腹膜内、肌内、静脉内和口服给予。免疫应答可用本领域已知的合适方法评估，所述方法包括下述具体实施例中教授的那些。本领域的技术人员应理解，对上述实施方式进行的许多变化和变换在所附权利要求的范围之内。实施例1材料和方法腺病毒载体。用以下方法制备表达M2e(3)_NP嵌合蛋白的AdC68和AdC6载体:通过集成DNA技术公司(Integrated DNA Technologies,爱荷华州克拉威尔)合成三种有信号肽的M2e编码序列并克隆到pShuttle (加利福尼亚州芒廷维由的克隆泰克公司(Clontech))。删除起始密码子后，将NP基因框内克隆到M2e序列下游。用1-Ceu I和P1-SceI消化后，将融合基因从pShuttle分别克隆到AdC68和AdC6分子克隆的El结构域。通过将质粒DNA转染到HEK293细胞·来拯救重组Ad载体(AdC68M2e (3) -NP和AdC6M2e (3) -NP)。通过氯化铯密度梯度离心来纯化Ad载体并用分光光度法在260nm测定病毒颗粒(vp)含量。滴定载体来测定感染单位(IU)且载体批料具有低于200的vp与IU比，并清除内毒素污染。用相同方法制备和质量控制仅编码NP或狂犬病毒糖蛋白(rab.gp)的其它载体。疫苗抗原的表达。以每细胞ΙΟ-ΙΟΟΟνρ感染HEK293细胞。感染24小时后进行蛋白质印迹，采用抗M2e (14C2-S1-4.2)的单克隆抗体印记膜。流感病毒。流感病毒A/PR/8/34和A/Fort Monmouth/1/47在鸡胚蛋的尿囊液中生长，并在成年小鼠中于鼻内感染后滴定来测定平均致死剂量(LD50)。小鼠。从ACE动物公司(宾西法尼亚州波伊尔)购买6-8周龄的雌性C57B1/6、BALB/c和ICR小鼠。从杰克逊实验室公司(Jackson Laboratory)(緬因州巴尔港)购买6-8周龄的雌性C57BL/6J小鼠(β 2Wh, B6.129P-B2mtmlUnc系)。在威斯达研究所动物室(WistarInstitute Animal Facility)中饲养所有的小鼠。C57B1/6小鼠在威斯达研究所动物室中成长并且一旦大于20月龄时即使用。该研究的动物方法按照实验动物使用与管理委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)指南实施。免疫小鼠。6-15只小鼠的组用IXIO1oVP的AdC68M2e (3)-NP载体肌内(1.m.)接种疫苗。二个月后，一些组的小鼠采用IXIO1oVP的AdC6M2e(3)-NP载体肌内(1.m.)给予来加强免疫。攻击小鼠。接种疫苗2个月后，麻醉小鼠然后用经30μ I PBS稀释的10或150LD5Q的流感A/PR/8/34病毒或者3或IOLD5tl的流感A/Fort Monmouth/1/47病毒鼻内攻击小鼠。每天对小鼠称重。如果下降的体重超过攻击前体重的30%，对其施以安乐死。在一些实验中，攻击5天后对小鼠施以安乐死。病毒滴定。试验采用经证实抵抗标准空斑试验的先前发表方法33。从实验小鼠中切出肺组织样品，并记录其重量。机械匀化组织样品后，用TR丨/O丨:_:试剂(英杰公司(Invitrogen))分离RNA并重悬于50 μ L的DEPC处理水(Ambion公司)中。每份样品的RNA浓度通过分光光度法在260nm吸光度测定。从全部50 μ LRNA溶液中，用100 μ L反应体积以高容量cDNA库试剂盒(应用生物系统公司(Applied Biosystems))的生产商规定组分比例获得cDNA。在热循环仪(Eppendorf MASTERCYCLER*)上进行反应，一个循环为25°C 10分钟、37°C 120分钟和85°C 5分钟。将cDNA浓度标准化至50ng/5mL，使用流感A/PR8cDNA通过连续稀释建立范围为4ng/5mL-0.0064ng/5mL的标准曲线。在AB丨PRiSM 7000序列
检测仪上用TaqMan 实时PCR试验定量病毒cDNA。用于病毒cDNA定量的引物对甲型流
感基质蛋白基因(MP)具有特异性，其为MP正义(5' -AAGACCAATCCTGTCACCTCTGA-3' ; SEQID NO: 5)和 MP 反义(5' -CAAAGCGTCTACGCTGCAGTCC-3' ; SEQ ID NO:6)。报告探针是序列[6-FAM]-5' -TTTGTGTTCACGCTCACCGTT (SEQ ID NO:7)-3' -[TAMARA]的 TAQMAN κTAMARA (应用生物系统公司)。将cDNA样品一式三份定量。每次反应总体积为25 μ L，包括 12.5 μ L TaqMan 通用 PCR 预混液(TaqMan*.Universal PCR Master Mix)、5pmol 报
告探针、22pmol MP有义引物、22pmol MP反义引物和5 μ L (50ng) cDNA样品模板。反应按如下进行:50°C 2分钟、95°C 10分钟，然后在95°C 15秒和60°C I分钟间循环40次。在分析光谱曲线中，该循环阈值定义为仅高于发射基线从而维持在PCR指数扩增阶段内。病毒拷贝数用原始组织样品质量标准化，以流感A/PR8基因组摩尔质量为基础计算。

对M2e的抗体效价。通过细胞ELISA从单个小鼠血清中测定对M2e特异的抗体应答，该细胞ELISA根据以前公开的方法进行改良。18我们将三种全长M2序列克隆到慢病毒载体上，所述全长M2序列是疫苗的M2e序列来源。在293T细胞中拯救慢病毒，并用其感染HeLa细胞以产生表达全长M2的稳定细胞系。通过用空慢病毒感染293T细胞来产生对照细胞系。这些细胞系在所述ELISA中用作免疫吸附物。18采用识别所有3种M2e序列的纯化抗体标准化该试验(制备手册)。胞内细胞因子染色(ICS)。在接种疫苗后的不同时间点，从所述血液中测定产生NP-特异性IFN-Y的⑶8+T细胞频率。34用EPICS XL (加利福尼亚州贝瑞阿的贝克曼库尔特公司(Beckman-Coulter))分析样品。将FlowJo7.1.1软件(俄亥俄州阿什兰的树星公司(Tree Star Inc.))用于采集后分析。NP-特异性⑶8+T细胞频率显示为所有⑶8+T细胞中的 IFN- Y +CD8+。四聚体染色。攻击前或攻击5天后从单个小鼠的肺、血液和脾脏中分离淋巴细胞。细胞在4°C下用APC标记的MHC I型NP肽四聚体(ASNENTETM;SEQ ID N0:8，四聚体核心研究室(Tetramer Core Facility),佐治亚州艾莫利大学)以及抗-CD8a-PerCP_Cy5.5抗体(加利福尼亚州圣何塞的BD生物科学公司(BD Biosciences))染色I小时。通过Beckman-Coulter XL (加尼福尼亚州贝瑞阿的贝克曼库尔特公司)在威斯达研究所流式细胞术核心室(Wistar Institute Flow Cytometry Core Facility)进行流式细胞术，并用FlowJo7.1.1 (俄亥俄州阿什兰的树星公司)分析数据。组织学。用补充有PBS的1%FBS灌注肺，通过30g针用200 μ 1L10%福尔马林溶液缓慢使侧叶膨胀。将膨胀的肺样品在10%福尔马林中4°C浸没24小时来固定组织。用石蜡包埋经福尔马林固定的肺样品，以4μπι切片并固定在玻片上。切片用Η&Ε染色，检测每份肺样品的两个随机切片。由对样品来源不知情的研究者检测组织病理学变化。如下对肺病理学情况打分:1 -没有可观察到的病理学；2 -血管周围浸润；3 -血管周围和间质浸润影响< 20%侧叶切片；4 -血管周围和间质浸润影响20-50%侧叶切片；5 -血管周围和间质浸润影响> 50%侧叶切片。统计学分析。用来自单个小鼠的样品分析免疫应答、病理级别以及病毒效价。以均值土标准差(SD)显示结果。通过单尾斯氏t检验或ANOVA测定各组间的显著差异。通过威尔科克森双样品检验(Wilcoxon two sample test)分析病理学分数差异。使用菲希尔精确检验(Fisher’ s exact test)测定接种疫苗组中保护相较对照组的统计学显著性。实施例2转基因广品表达M2e (3) -NP嵌合基因编码以下的M2e =HlNl病毒A/PR/8、出现于1997年的致病性H5N1病毒、和分离于2007年的禽H7N2毒株(图1A)。3种M2e序列与全长NP序列组合。将编码三种丙氨酸残基的接头序列插入每种基因之间并将来自HSV-1糖蛋白的信号序列置于嵌合基因上游(图1B)。蛋白质印迹显示AdC68M2e(3)-NP和AdC6M2e(3)-NP的嵌合蛋白体外表达水平相当，使用称作14C2-S1-4.218的抗M2e单克隆抗体(示于图1C)或抗NP抗体(未显示)。实施例3对M2e的抗体应答用IXIOiciVP的AdC68M2e(3)_NP对幼龄C57B1/6小鼠组接种疫苗，2个月后用IXIO1oVP的AdC6M2e(3)-NP对其中一些加强免疫。加强免疫5周后从单个小鼠中收获血清，将其与原初对照血清一起或与单独实验中接种有表达狂犬病毒糖蛋白(rab.gp)的载体的小鼠血清一起，在不同的M2e转染或假转染HeLa细胞系上测试抗M2e抗体(图2A)。抗体效价在所述3种细胞系中测试时相当并且在加强免疫后有所提高。接种对照载体的小鼠血清显示与原初小鼠血清相 似的背景反应性(例如，原初ICR小鼠中抗M2e的平均抗体效价，
1.2 μ g/ml ；AdCrab.gp初免加强方案后ICR小鼠中的平均抗体效价:0.99 μ g/ml)。为确保该疫苗可在遗传学上不同的小鼠系中诱导应答，用相同的疫苗方案测试远交ICR小鼠。初次免疫后获得的抗体效价低于C57B1/6小鼠中的那些，但加强免疫后的抗体效价相当(图2B)。实施例4NP-特异性CD8+T细胞应答接种疫苗后在不同时间点通过就IFN- Y胞内细胞因子染色测试对NP的疫苗诱导CD8+T细胞应答(图3A)。用AdC68M2e(3)-NP初次免疫后，所有小鼠血液中发展出可检测的NP-特异性⑶8+T细胞频率，所述频率逐渐下降。初次免疫2个月后用AdC6M2e (3) -NP加强免疫会影响NP-特异性循环CD8+T细胞的增加。初次免疫4个月后对小鼠施以安乐死，从单个小鼠血液、脾和肺中分离的淋巴细胞测定NP-特异性CD8+T细胞频率(图3B)。接受初免一加强方案的小鼠中的频率较高；肺中的频率最高，脾脏中的最低。主要吸引淋巴组织(例如脾脏)内效应/效应记忆细胞的外周组织中频率较高，这就先前所述Ad载体诱导的T细胞应答而言是典型的。19实施例5保护性免疫对C57B1/6小鼠接种疫苗，然后用IOLD5tl的A/PR/8病毒感染所述小鼠。攻击5天后从单个小鼠的肺叶右下侧中测定肺病毒效价(图4A)。根据以下原因选择该时间点。取决于能阻挡感染效价然后大约在第7天开始下降的小鼠中的攻击病毒剂量，48小时内可快速检测小鼠肺中流感病毒的复制。2°诱导中和抗体的疫苗预期会在开始时降低病毒效价，而疫苗如针对感染细胞诱导免疫机制的我们的疫苗预期会作用延迟。用AdC68M2e(3)-NP初次免疫的小鼠显示平均效价降低，但相比对照小鼠未达到显著(P=0.2)。肺病毒效价的显著降低在初免-加强后实现(P=0.0003)。为确保病毒效价降低可产生临床益处，用初免-加强方案重复该实验并用IOLD5tl的A/PR/8或A/Fort Monmouth病毒攻击小鼠。攻击后，接种疫苗、原初或假接种疫苗的小鼠体重下降。接种疫苗的小鼠的体重下降在攻击后6-8天达到峰值，然后体重开始上升，到攻击21天后大多数小鼠恢复到攻击前体重。原初或假接种疫苗的对照小鼠在攻击后体重继续下降直到死亡或需要安乐死(图4B、4C)。用任一种病毒株攻击后，90%接种疫苗的小鼠存活，而所有对照小鼠死亡(图4D、4E)。用H&E对攻击5天后收获的肺叶进行染色，采用材料和方法部分中描述的评分系统来分析炎症征兆。大多数未接种疫苗的小鼠肺中出现血管周围浸润，其中半数的血管周围浸润的平均病理学分数为
2.35(图4F)。接受初免-加强疫苗接种的小鼠中的病理学情况不太明显，并且其肺的平均分为1.85 (p=0.04)。初次免疫4个月后通过该实验感染小鼠。接受第二剂疫苗的那些小鼠在初次免疫2个月后接受加强免疫，然后在2月后进行攻击。该操作方案使我们可以一起初次免疫并攻击小鼠，因此减少实验差异性。有人可能会产生以下争议，接种疫苗和攻击之间的时间间隔差异可能使结果偏向。因此我们在附加的实验中测试接种疫苗2个月后只接受一剂AdC68M2e (3) -NP疫苗的小鼠，保护作用与免疫4个月后攻击的小鼠中观察到的相当。用ICR和BALB/c小鼠重复该实验。初次免疫4个月后或加强免疫2个月后用IOLD50的A/PR/8病毒攻击小鼠。到攻击后第5天，经初次免疫(p=0.0002)或初免和加强(p=0.0003)的ICR小鼠中肺病毒效价显著降低(图5A)。在30%的初次免疫小鼠和50%的接受初免-加强方案的小鼠中，病毒已从其肺中完全清除，而两个对照组中所有小鼠的滴度超过IO5个基因组拷贝。采用BALB/c小鼠得到相似的结果(图5B)。接下来用递增剂量的150LD5(lA/PR/8病毒攻击接种疫苗的ICR小鼠(图5C,5D)0尽管该攻击很严重，其杀死90%的对照小鼠，但70%接种疫苗的小鼠存活。攻击5天后对ICR小鼠肺切片进行组织学分析 (图5E)，揭示接种疫苗小鼠中炎症显著减少，平均组织学分数分别为:原初小鼠的2.7，接种疫苗小鼠的1.9 (p=0.009)。流感疫苗主要导致老龄小鼠死亡，并且市售可得疫苗通常在这些群体中免疫原性较差。21为测试AdM2e (3) -NP载体是否诱导老龄小鼠中的保护，我们用AdC68M2e (3) -NP免疫20月龄的C57B1/6小鼠组，然后在2个月后用AdC6M2e (3)-NP对其进行加强免疫。加强免疫3个月后用3LD5(i的A/Fort Monmouth病毒攻击小鼠，并在5天后测定肺的病毒效价。对幼龄小鼠组进行平行测试。虽然老龄原初小鼠背景效价略高(老龄小鼠中对M2e的平均抗体效价:17μ g/ml ;老龄小鼠的平均背景效价:6μ g/ml)，对M2e的抗体应答在老龄和幼龄接种疫苗小鼠中相当。老龄小鼠中的NP-特异性CD8+T细胞频率在攻击时较高(％NP特异性⑶8+T细胞/所有⑶8+T细胞:老龄小鼠:10.2% ;幼龄小鼠:5.9%，p=0.03)。到攻击后第5天，幼龄接种疫苗小鼠中的肺病毒效价显著低于幼龄原初小鼠的那些，而这种差异未见于老龄小鼠，虽然它们相对幼龄小鼠平均效价较低(图6)。另外，攻击后接种疫苗的幼龄小鼠相较原初幼龄小鼠显示体重降低减少，这再次未见于老龄小鼠，表明虽然该疫苗在老龄小鼠中诱导免疫应答，然而在该群体中缺乏功效。实施例6保护的免疫相关性为阐明在接种疫苗小鼠中引起保护的免疫机制，在β 2-微球蛋白敲除的CD8+T细胞缺乏小鼠中测试该疫苗。小鼠接受初免-加强方案或保持原初。加强免疫5周后测定的抗体效价与野生型C57B1/6小鼠中达到的那些相当(抗M2e/ml的抗体平均效价为10.7μ g)。用IOLD5tl的A/PR/8攻击小鼠后，只有33.3%(2/6)的接种疫苗小鼠存活而所有原初小鼠死于感染(图7A)。该差异不显著，这说明单独抗体无法提供针对严重攻击的保护作用。在第二个实验中，抗体作用由过继转移实验评估。供体C57B1/6小鼠接受采用AdCM2e(3)-NP载体的初免-加强方案，将收集的Iml血清转移至原初C57B1/6受体中，24小时后用IOLD5tl的A/PR/8攻击该受体，所述血清在收集时包含14.3 μ gM2e-特异性抗体/ml ο对照小鼠接受来自原初供体的血清。M2e免疫血清的转移保护50%的受体，而所有注射对照血清的小鼠在攻击后死亡(图7B)。为进一步评估保护的相关性，小鼠用仅表达NP的AdC68载体(AdC68NP)接种疫苗，或小鼠用AdC68NP初次免疫然后在2个月后用AdC68NP加强免疫。2个月后从血液中测定NP特异性⑶8+T细胞频率(图7C)，并发现所述频率与采用AdC68M2e (3) -NP疫苗或采用所述两种异源Ad载体进行初免-加强方案所达到的频率相当。还应该注意的是，接种AdNP的小鼠发展出抗NP的抗体。接种疫苗2个月后，一组接种AdC68NP的小鼠接受1.0ml血清，该血清获自用AdM2e(3)-NP载体接受初免-加强方案的C57B1/6小鼠，其它组接受1.0ml来自原初小鼠的血清。24小时后采用IOLD5tl的A/PR/8病毒攻击小鼠。所有对照动物死亡，而33.3%转移有原初血清的AdC68NP接种小鼠存活(图7D)。该存活度没有达到统计显著性。在接种AdC68-NP并接受免疫血清的`小鼠中存活率显著，达到了 55.6%，说明针对高剂量攻击的疫苗诱导保护作用需要抗M2e的抗体和针对NP的CD8+T细胞。通过加强免疫来增强NP-特异性CD8+T细胞不引起保护增加，但小鼠还表现出可能加速死亡的趋势，说明有效的NP-特异性⑶8+T细胞应答可能加剧疾病。另外，这些结果显示T细胞和抗NP抗体的组合不足以提供保护作用，抗M2e的抗体是必需的。实施例7采用M2e和NP的免疫与仅采用M2e或NP的免疫接种的比较相比仅使用M2e或NP，病毒载体中的M2e和NP组合针对流感病毒感染达到的保护作用更强。来自以下实验的结果对该陈述提供了支持。采用初免和加强方案对四组6-8周龄的雌性C57B1/6小鼠接种疫苗，初次免疫和加强免疫间的休止期为2个月。所有免疫通过肌内给予。每实验组中有10只小鼠，对照组中是9只小鼠。第一组小鼠组用AdC-M2e (3) -NP接种疫苗，第二组用AdC_M2e (3)接种疫苗，第三组用AdC-NP接种疫苗。最后一组小鼠是对照组并接种有含非相关转基因的载体(rab.gp、狂犬病毒G蛋白)。采用的腺病毒载体是用于初次免疫的是黑猩猩血清型C68，用于加强免疫的是C6。下表中显示了每组采用的免疫。
权利要求
1.一种融合多肽，所述多肽包含四种组分: 来自第一甲型流感病毒株的第一基质蛋白胞外域(M2el);和 来自第二甲型流感病毒毒株的第二基质蛋白胞外域(M2e2)； 来自第三甲型流感病毒毒株的第三基质蛋白胞外域(M2e3);和 来自第四甲型流感病毒毒株的核蛋白(NP )， 其中所述第一、第二、第三和第四毒株中至少两种是不同的毒株。
2.一种融合多肽，所述多肽包含: 来自第一甲型流感病毒毒株的第一基质蛋白胞外域(M2el);和 来自不同甲型流感病毒株的核蛋白(NP)。
3.如权利要求2所述的融合多肽，其特征在于，所述多肽还包含来自第二甲型流感病毒株的第二基质蛋白胞外域(M2e2)。
4.如权利要求1所述的融合多肽，其特征在于，所述四种组分从N到C末端顺序为M2ex 一 M2e2 一 M2e3 一 NP。
5.如权利要求1至4中任一项所述的融合多肽，其特征在于，所述第一毒株是HlNl毒株。
6.如权利要求1至4中任一项所述的融合多肽，其特征在于，所述第一毒株是H5N1毒株。
7.如权利要求1所述的融合多肽，其特征在于，所述第一毒株是H7N2毒株。
8.如权利要求1所述的融合多肽，其特征在于，所述第四毒株是HlNl毒株。
9.如权利要求1所述的融合多肽，其特征在于，所述第一和第四毒株是相同的。
10.一种编码权利要求1-9中任一项所述融合多肽的核酸分子。
11.一种删除El的腺病毒载体，所述载体包含如权利要求10所述的核酸分子。
12.如权利要求11所述的删除El的腺病毒载体，其特征在于，所述载体获自黑猩猩血清型。
13.如权利要求12所述的删除El的腺病毒载体，其特征在于，所述黑猩猩血清型选自C68 和 C6。
14.一种诱导针对两种或多种甲型流感病毒株的免疫应答的方法，所述方法包括向需要的个体第一次给予如权利要求11-13中任一项所述的删除El的腺病毒载体。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法还包括第二次给予所述删除El的腺病毒载体。
16.如权利要求14或15所述的方法，其特征在于，所述给予选自下组:粘膜、口服、肌内、静脉内和腹膜内给予。
17.—种编码权利要求1-9中任一项所述融合多肽的核酸分子作为药物的应用。
18.如权利要求17所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含在删除El的腺病毒载体中。
19.一种编码权利要求1-9中任一项所述融合多肽的核酸分子在针对甲型流感病毒免疫中的应用。
20.如权利要求19所述的应用，其特征在于，所述核酸分子包含在删除El的腺病毒载体中。
全文摘要
公开通用流感疫苗。该疫苗诱导针对大范围甲型流感病毒的广泛和持久的保护，减少用基于预测为主要流通毒株的病毒株的疫苗的每年免疫接种运动需求，缓解将来可能致死上百万人的大流行的威胁。
文档编号A61K39/00GK103154021SQ201180049824
公开日2013年6月12日 申请日期2011年8月16日 优先权日2010年8月16日
发明者H·C·J·埃特尔, 周东明 申请人:威斯特解剖及生物研究所