专利名称：一种多模态成像微气泡构造、制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医学、材料及纳米医药的交叉领域，具体涉及ー种多模态靶向成像微气泡构建、制备方法及用途。
背景技术：
随着医学影像学的发展，各类造影剤在临床中的应用也越来越广泛。造影剂能够増加组织对比度，提高影像定性定位的能力，提高诊断正确率。目前，各种成像技术均有各自的造影剤，如用于超声成像的微泡造影剤，用于CT成像的碘造影剤，用于磁共振成像的Gd-DTPA及超顺磁性氧化铁等。同一病人为明确诊断，常常需在短期内接受大量、多种造影齐U，不但加重了机体代谢负担以及造影剤副反应发生的风险，也増加了医疗费用，因而，临床上迫切需要一种能同时用于多种成像技术的造影剤，即多功能造影剤。国内外学者已经对多功能造影剂进行了相关研究，超声成像与磁共振成像、核素显像、荧光成像联合以及荧 光成像与核素显像联合的造影剂已陆续被报道，但能同时用于超声、荧光及磁共振成像的造影剤尚未见报道。超声成像是ー种常用的临床诊断方法，以其快速、安全、廉价、便携等特性，在世界范围内得到广泛的应用。但由于超声诊断方法本身的限制，超声成像的分辨率和准确性远远不能满足先进临床诊断的要求。超声对比剂可以显著增强医学超声诊断信号，得到比普通超声成像更丰富、更准确的诊断信息，为疾病的诊断治疗提供更多依据。应用于科研和临床上最多的超声造影剤为微泡(MBs)对比剂，它由外层包膜壳层(磷脂、表面活性剤、高分子等)和内部包裹的气体(空气、氮气、全氟化碳、六氟化硫等)组成。Gd-DTPA (Magnevist)是临床使用的ー种磁共振成像剂，稳定性好，且磁学性质优良。然而近年来发现Gd-DTPA会引起肝细胞慢性纤维化，有些国家已停止使用。能否在保持Gd-DTPA优良性能的同时又能从体内顺利排出是新的策略，如使Gd-DTPA分子与蛋白、糖类连接及用适宜高分子微球包裹等修饰，取得较好的进展。量子点(quantumn dots QDs)是作为一种半导体突光纳米颗粒，由于其优良的光学特性，近年来是纳米生物医学领域的ー个研究热点。一般由第二族和第六族元素或第三族和第五族元素构成。量子点具有很宽的吸收峰范围，窄而対称的发射波长，较大的斯托克斯位移，较高的量子产率以及很强的抗光漂白性，具有传统有机荧光物质不可比拟的光学特性。近年来国际ー些著名刊物不断报道量子点在生物医学及纳米医药领域的应用研究，量子点应用已经逐渐滲透到生物医学的各个领域，包括细胞生物学，分子生物学、蛋白组学及纳米探针，成为了ー种理想的体外和体内细胞/组织荧光成像诊断试剂。如何快捷，低成本的获得，高产率、毒性小的量子点微球是生物医学应用领域急待解决的问题。不同特性、不同功能量子点微球及微气泡具有极高的研究价值和应用前景。
发明内容
本发明针对不同成像技术需使用不同造影剤，不仅增加机体代谢负担，以及造影剂副反应的问题，提供一种多模态超声成像剂，以期实现“ー探针多功能”的目的，本发明还提供制备所述微气泡的方法。为达到上述目的，本发明所提供的技术方案是这样的—种多模态成像微气泡，为壳核结构，所述壳核结构的壳膜材料由高分子聚合纳米材料和磷脂组成，核材料为水溶性量子点和惰性气体，所述水溶性量子点为巯基丙酸修饰的碲化镉，粒径半径为3. 2-9. Onm。制备所述多模态成像微气泡的方法，包括以下步骤步骤一、将磷脂与含有端羧基的高分子聚合材料按I : 8. 75-9. 25的摩尔比溶解于ニ氯甲烷溶剂中，然后加入水溶性量子点，声振35-45S得到初乳液；将所述初乳液与浓度为3% -5%的聚こ烯醇溶液混合，并在转速为2000-10000r/min的均质机中分散均质作 用5min，得到微球复溶悬液，再加入浓度为2% _4%的异丙醇溶液，在室温下搅拌2_5h，经离心漂洗，收集下层微球，并将收集到的微球经冷冻干燥后充入惰性气体即得到呈冻干粉状多模态成像微气泡。进ー步，所述惰性气体为八氟丙烷。进ー步，所述壳膜上设有通过化学共价偶联法-酰胺键连接的特异性靶向配体。进ー步，所述高分子聚合材料为端基为羧基的由乳酸、羟基こ酸聚合后的均聚物或共聚物。进ー步，所述特异性靶向配体包括具有游离氨基的抗体、小分子复合物或适配子。进ー步，所述磷脂为甘油磷脂。进ー步，还包括步骤ニ、取步骤ー制得多模态成像微气泡冻干粉于无核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶水溶液或PH = 6. O的MES-TRIS缓冲液中溶解，并加入偶联活化剂EDC/NHS，采用冰浴或摇床恒温孵育30 45min，然后将所述PH = 6. O的MES-TRIS缓冲液离心漂洗三次，并限定离心转速为3000r/min，用以去除微气泡中未反应的EDC/NHS，将离心漂洗后所得的微气泡溶解到无核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶水溶液或PH = 8.0的MES-TRIS缓冲液中，并加入靶向配基混匀低温孵育2-4h ;再用所述无核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶水溶液或PH = 8. O的MES-TRIS缓冲液离心漂洗三次，收集的微气泡即为多模态靶向成像微气泡。所述多模态成像微气泡具有用于制备MRI对比剂的用途。本发明用双乳化冷冻干燥法成功制备包埋量子点微气泡，其性质稳定，易于贮存；合成エ艺简易，所需材料简单，价格低廉，耗时少，便于批量生产。本发明所述的多模态成像微气泡，细胞毒性小，具备荧光成像功能，同时不仅能增强超声显像，在不添加现有公开的MRI成像材料的前提下而且还能够用作MRI对比剂，体内外均具有显像效果，而体外加有靶向抗体或小分子复合物的多模态成像微气泡显像效果尤为显著。本发明所述的多模态成像微气泡，能初步实现靶向肿瘤的显像。不同于传统超声微泡造影剤、磁共振Gd-DTPA造影剤，荧光成像剂，本发明所述的多模态成像微气泡，在体内循环半衰期长，经静脉注射后，被网状内皮系统细胞吞噬，从而实现肝、脾等脏器的持久被动靶向強化，便于病变的重复检查、动态监测以及疗效评估等。偶联靶向配基的多模态成像靶向微气泡更使得肿瘤的早期诊断、及时治疗成为可期之事。
将靶向配基化学共价发偶联到壳膜上，增强了靶向微泡的抗血流剪切能力，这样在显像同时可以利用超声特有的空化效应，实现靶区肿瘤的清晰定位，将包裹药物靶向定位释放。壳膜材料由高分子聚合纳米材料和磷脂组成，虽然磷脂材料的超声造影效果明显优于高分子聚合纳米材料，但结构稳定性比高分子聚合纳米材料相对要差，由于本发明的水溶性量子点为毒性物质，出于安全性考虑，故在膜材料中加入了相对稳定的高分子聚合纳米材料。但是这需要一定的比例控制，应当以高分子聚合纳米材料为主(又不能完全是高分子聚合纳米材料，这样超声显影效果较差，脂质量多了，又会影响整体壳膜结构的稳定性)，本发明申请中高分子聚合纳米材料与脂质的摩尔比控制在8. 75-9. 25 I。
图IMalvern激光分析仪检测多功能超声造影剂的粒径图；
图2多模态微气泡的透射电镜图像(80KVX9800)和扫描电镜图像(I. 0Kv-D7. 9mmxlO. Ok)对照图；图3多模态微气泡体内MRI显像对照图。左图注射本发明多模态非靶向微气泡Imin后SD大鼠肾脏造影，右图注射普通微泡Imin对照，中图是仅注射量子点溶液的Imin对照，图中箭头所指的位置为SD大鼠的肾脏位置；图4多模态微气泡体外MRI显像对照图，图中MB表示普通的微泡，MBqds表示本发明所保护的包封有量子点的非靶向微泡造影剤MBqds-T表示本发明所保护的包封有量子点的革巴向微泡造影剂；图5多模态微气泡增强裸鼠荷瘤声像对照图，图5a为注射造影剤前肿瘤超声成像图，图5b为注射非靶向微气泡造影剤Imin后超声成像图；图5c为注射靶向微气泡造影剤Imin后超声成像图；图6多模态微气泡荧光成像对照图，左图小动物活体白光模式下荧光成像，右图为小动物活体黄光(波长485nm)模式下突光成像；图7是多模态微气泡超声成像对照图，左图为壳膜材料完全为高分子聚合纳米材料PLGA时的超声显像图，右图为高分子聚合纳米材料与脂质的摩尔比9 I时组成壳膜材料时的超声显像图。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明作进ー步详细说明，但本发明的内容不限于所举的实施例本发明下述实例所用高分子聚合纳米材料PLGA均为乳酸羟基こ酸=50 50，分子量为12，000的高分子聚合物，高分子聚合纳米材料与脂质的摩尔比9 1，水溶性量子点为巯基丙酸修饰的碲化镉，粒径半径为5. Inm0实施例I本发明多模态微气泡的制备电分天平称取50mg PLGA (50 50，MW 12，000) ,0. 15mg PE 溶于 2ml ニ氯甲烷溶剂中，全溶后加入100 ill水溶性量子点，声振35-45S得初乳液(W/0);将初乳液与6ml 4%聚こ烯醇溶液混合，并在9600r/min的分散均质设备中作用5min，得到微球(W/0/W)，加入5ml 2%异丙醇溶液，室温磁力搅拌机匀速搅拌2-5h，使微球表面固化，ニ氯甲烷尽量自然挥发。将上述液体分装入5ml离心管中，高速离心(3500rpm, 5min)弃上清液。重新加入适量双蒸水，用旋涡混合仪充分混匀、洗涤、离心，弃上清液。共洗涤、离心5次。收集下层液体约2ml。将盛有PLGA微球的离心管加入适量双蒸水，旋涡混合仪充分混匀，置_20°C冰箱中冷冻30min。置_50°C真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥48h，充入全氟丙烷气体得白色粉末状包裹量子点的PLGAqds微气泡。称重后将其置4°C冰箱中保存、备用。光镜下观察可见该纳米粒呈球形，大小均匀，形态规则，分散较好；Malvern激光分析仪测得纳米粒粒径为(662 ± 20. 5) nm，分布窄(图I);透射电镜可见CdTe纳米颗粒分布在纳米粒核内(图2左)。扫描电镜显示双乳化-冷冻干燥法制得了有微孔纳米粒(图2右)。冻干粉样品放置4°C冰箱贮存，几周后复溶，光镜下观察形态、大小及其分布均没有明显的改变，荧光强度无改变，光稳定性很好。实施例2A10_PLGAQDs靶向微气泡的偶联实验
取实施例I中制得的白色粉末状PLGAais微气泡溶解于浓度为10iig/iiL的无核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶水溶液(Dnase RNase-free water)中，并加入400 ii L EDC/NHS (4 I摩尔比)，采用恒温孵育摇床孵育45分钟。被NHS活化的微气泡悬浮液经过三次缓冲液的离心漂洗(离心转速为3000r/min)后，再溶解到浓度为I U g/U L DnaseRNase-free water 中，并加入 50 U L 3’ -NH2 修饰的 A10PSMA aptamer,低温孵育 2_4h,再用无核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶水溶液离心漂洗三次，得到AlO适配子与微气泡共价偶联产物，并且以悬浮液形式保存。流式细胞仪和荧光显微镜检测0. 5mg/mL 3’-NH2修饰的A10PSMA 和 PLGAais-COOH 微气泡偶联产物 AlO-PLGAaist5所述三次以及多次离心漂洗是指加缓冲液溶解进行离心处理后去上层清液，再加缓冲液溶解进行离心……，以此项操作的次数，来论定离心漂洗的次数。选用的靶向配基为抗体、小分子复合物或适配子均可以采用MES-TRIS缓冲液等同替换本实施例中的DnaseRNase-free water,但由于适配子属于核酸,选用Dnase RNase-free water作为缓冲液会更为合适。实施例3本发明所述多模态微气泡的体内MRI显影实验SD大鼠经3%戊巴比妥钠(lml/kg)腹腔注射麻醉后，使用临床GE 3.0T超导型磁共振仪扫描，使用内部磁场较均匀的头部正交圈扫描，SE序列，T1W1，參数TR/TE =824ms/10ms，视野FOV = 80mm*80mm。采用体重为220g两只大鼠对照方法，造影时按5ml/kg剂量经大鼠尾静脉注射实施例I制备的多模态微气泡PLGAais和空白微气泡PLGA，观察肝及肾脏造影后的显像时间和显像效果(如图3所示)，可以明显看出本发明所保护多模态非靶向微气泡具有制备MRI对比剂的用途，可预见性地本发明所保护多模态靶向微气泡也应当具有制备MRI对比剂的用途。实施例4本发明所述多模态微气泡的体外靶向MRI显影实验将卵巢癌细胞SK0V3种植六孔板，编号后滴入已经制备的靶向微气泡RGD-PLGAais (2孔)，非靶向微气泡PLGAais (2孔)，空白微气泡PLGA(没有包埋量子点)的盐水溶液为对照背景(2孔)，室温孵育30min，适量生理盐水冲洗三次，将三组(各2孔)细胞消化转移至3只EP管中制成细胞悬液，使用临床GE 3. OT超导型磁共振仪扫描，使用内部磁场较均匀的头部正交圈扫描，SE序列，T1W1，參数TR/TE = 112ms/20ms，视野FOV =160mm*160mm,见图4,多模态显像祀向微气泡与细胞特异性识别结合,与非祀向和空白背景微气泡细胞孵育体系比较信号强很多，既说明抗体与微气泡的成功联接也表明该多模态微气泡还可用作MRI阳性对比剂，其中空白背景微气泡细胞孵育体系的信号效果几乎不可见。由于靶向的效果，使得微气泡在特定位置相对集中，使得多模态靶向成像微气泡与非靶向相比较信号强很多，但从本质上依然证明了本发明所保护多模态非靶向与靶向微气泡均具有制备MRI对比剂的用途。在食品检测、法医鉴定(如死因鉴定)、医务教学以及相关组织的体外鉴定方面，多模态显像靶向微气泡均具有制备MRI对比剂的用途。实施例5多模态微气泡体内祀向超声增强显影和突光显影实验取对数期生长的SK0V3细胞用1640培养液稀释成浓度为5X107/ml细胞悬液，与雌性BALB/c裸鼠背臀部皮下注射细胞悬液300iil，8只，建立荷瘤模型，待肿瘤长至I. 0-2. Ocm进行显像实验。尾静脉随机注射靶向微气泡RGD-PLGAqds和非靶向微气 泡PLGAQDs150-200iil，用Philips iU22彩色多普勒超声诊断仪(L12-5探头，探头频率7-13MHz)超声增强显像。结果注射造影剤即刻，肿瘤未见有明显增强，于注射后0.5min，注射靶向微气泡RGD-PLGAqds裸鼠肿瘤周边组织开始出现增強，并于注射后Imin左右达到高峰，持续约15min(图5)。同时用小动物在体荧光成像仪进行荧光成像，注射靶向微气泡RGD-PLGAws后Imin左右到15min，裸鼠肿瘤周边组织可持续观察到荧光，而对照组荧光在相同时间不易观察(图6)。上述实施例表明本发明所述多模态成像微气泡能增强肿瘤超声显像并且同时实现荧光成像、MRI成像。因此，本发明所述超声造影剤有广阔的应用前景。本发明的实施例表明，本发明所述多模态微气泡主要为网状内皮系统特异性对比齐U，体内稳定性高，循环半衰期长，能实现肝、脾等脏器的持久被动靶向強化，能同时增强超声、MRI显像；连接靶向配基后具有一定的主动靶向性，对肿瘤等疾病的诊断，病变动态监测以及疗效评估有潜在的应用价值。本发明的壳膜材料选高分子聚合物与脂质混合，而不是単独由高分子聚合物组成，如图7所示，単独由高分子聚合物组成的壳膜其超声显影效果明显不及本发明所公开的高分子聚合纳米材料与脂质的摩尔比9I时的超声显影效果。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，如采用其他特异性配体，其他比例(例如乳酸羟基こ酸=75 25)的高分子聚合物、水溶性量子点粒径半径还可以为3. 4、5. 8、7. 6、8. 9nm这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。另外水溶性量子点选用巯基丙酸修饰的碲化镉的原因是归究于实验条件限制，本发明尚无法得出其他水溶性量子点构造上等同替换后，并无法实现本发明多模态成像微气泡同等效果的结论，另外限定巯基丙酸修饰的碲化镉粒径半径为3. 2-9. Onm,是经过多次实验发现，高于IOnm或低于2nm的基丙酸修饰的碲化镉其MRI显像效果，与空白対照的显像效果基本一致，故特别限定粒径为3. 2-9. Onm的巯基丙酸修饰的碲化镉作为本发明的优化选择。
权利要求
1.一种多模态成像微气泡,为壳核结构，其特征在于，所述壳核结构的壳膜材料由高分子聚合纳米材料和磷脂组成，核材料为水溶性量子点和惰性气体，所述水溶性量子点为巯基丙酸修饰的碲化镉，粒径半径为3. 2-9. Onm。
2.根据权利要求I所述的多模态成像微气泡，其特征在于，所述壳膜上设有通过化学共价偶联法-酰胺键连接的特异性靶向配体。
3.根据权利要求I所述的多模态成像微气泡，其特征在于，所述高分子聚合材料为端基为羧基的由乳酸、羟基こ酸聚合后的均聚物或共聚物。
4.根据权利要求2所述的多模态成像微气泡，其特征在于，所述特异性靶向配体包括具有游离氨基的抗体、小分子复合物或适配子。
5.制备权利要求I所述多模态成像微气泡的方法，其特征在于，包括以下步骤 步骤一、将磷脂与含有端羧基的高分子聚合材料按I : 8. 75-9. 25的摩尔比溶解于ニ氯甲烷溶剂中，然后加入水溶性量子点，声振35-45S得到初乳液；将所述初乳液与浓度为3% -5%的聚こ烯醇溶液混合,并在转速为2000-10000r/min的均质机中分散均质作用5min，得到微球复溶悬液，再加入浓度为2% _4%的异丙醇溶液，在室温下搅拌2_5h，经离心漂洗，收集下层微球，并将收集到的微球经冷冻干燥后充入惰性气体即得到呈冻干粉状多模态成像微气泡。
6.根据权利要求5所述的多模态成像微气泡的制备方法，其特征在于，所述惰性气体为八氟丙烷。
7.根据权利要求5所述的多模态成像微气泡的制备方法，其特征在干，所述磷脂为甘油磷脂。
8.如权利要求5所述的制备多模态成像微气泡的方法，其特征在于，还包括步骤ニ、取步骤ー制得多模态成像微气泡冻干粉于无核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶水溶液或PH = 6. 0的MES-TRIS缓冲液中溶解，并加入偶联活化剂EDC/NHS，采用冰浴或摇床恒温孵育30 45min，然后将所述PH = 6. 0的MES-TRIS缓冲液离心漂洗三次，并限定离心转速为3000r/min，用以去除微气泡中未反应的EDC/NHS，将离心漂洗后所得的微气泡溶解到无核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶水溶液或PH = 8. 0的MES-TRIS缓冲液中，并加入靶向配基混匀低温孵育2-4h ;再用所述无核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶水溶液或PH = 8. 0的MES-TRIS缓冲液离心漂洗三次，收集的微气泡即为多模态靶向成像微气泡。
9.权利要求I或2所述的多模态成像微气泡具有用于制备MRI对比剂的用途。
全文摘要
本发明涉及化学工程、材料及纳米医药的交叉领域，具体是一种多模态成像探针构建及其制备方法。本发明所述多模态成像探针为含壳核结构微气泡，壳膜材料由可生物降解、生物相容性良好的高分子材料及磷脂材料组成，中心包埋不同荧光特征的水溶性量子点溶液，充入全氟碳烷气体，应用双乳化-冷冻干燥充气方法制备粒径可控、分散性好且稳定易保存的多模态探针。本发明微气泡为网状内皮系统特异性对比剂，不仅能荧光成像，且能实现增强超声显像和MRI显像，微气泡多模式成像，具有广阔的应用前景。
文档编号A61K49/18GK102772808SQ20121022378
公开日2012年11月14日 申请日期2012年7月2日 优先权日2012年7月2日
发明者冉海涛, 王志刚, 郝兰 申请人:重庆医科大学