专利名称：缺血模型多模态分子成像监测方法
技术领域：
本发明涉及到多模态分子成像技术领域，具体涉及一种缺血模型多模态分子成像监测方法。背景技术：
近年来，基于缺血型的小动物分子成像技术受到了广泛关注，针对这一动物模型应用干细胞介导的缺血损伤修复和血管新生的研究已屡见不鲜。然而，对动物模型的干预效果监测手段目前主要有离体的免疫组化、免疫荧光等手段，对于干细胞在小动物体内的存活情况则需要通过移植来源于带有绿色荧光蛋白(GFP)的转基因动物的干细胞到损伤动物模型，干细胞的存活情况需要处死动物后获取组织在显微镜下观察绿色荧光蛋白来进行鉴定(Katstural Jetal, Circulation Research, 2005)，在体观察干细胞也有文献报道采用生物发光成像(Bioluminescence imaging, BLI)技术对表达荧光素酶(Iuciferase) 的干细胞进行观测(Cao, F. et al. In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery. Circulation 113，1005-1014, 2006)；生物发光成像技术只能获取二维的平面像，不能直观地显示小动物体内光源所处的三维空间位置信息，在可视化效果上有很大的局限性；在定量分析方面，生物发光成像只能进行相对的定量分析，不具有绝对定量的意义，可以参见R. Weissleder and Μ. J. Pittetj "Imaging in the era of molecular oncology, “ Nature 452，580-589 (2008).另外，对小动物缺血模型还需要观察干细胞干预后的血管新生情况，传统的方法是取缺血区域的组织对血管内皮的标志分子CD31进行抗体染色，通过对照组和干预组比较血管新生的情况。这种方法需要在不同的阶段处死动物模型，给实验的连续观测带来了很大的不便。
发明内容
本发明针对上述现有技术方法中对小动物缺血模型的干细胞干预过程中干细胞的存活和定位示踪、以及血管新生的离体观测方法的缺陷，提供一种缺血模型多模态分子成像监测方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为缺血模型多模态分子成像监测方法， 其特征在于所述的监测步骤为
(1)稳定表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的干细胞的分离和培养；
(2)构建缺血动物模型；
(3)移植步骤(1)中的培养的干细胞到步骤(2)所构建的动物模型的缺血损伤区域；
(4)在第1天、第7天、第14天、第21天、第观天、第35天、第42天用生物发光断层成像系统进行成像，观测时间点直到看不到发光的干细胞为止；从而可以定位干细胞在小动物体内存在的三维空间位置和示踪干细胞的存活情况，通过干细胞定量方法观测干细胞在体内不同时间点的存活数量；
(5)通过稳定表达绿色荧光蛋白的干细胞进行抗绿色荧光蛋白的抗体染色，处死动物模型并在注射干细胞的区域取肌肉组织制作冰冻切片，用荧光显微镜观察标记绿色荧光蛋白的干细胞来做干细胞在缺血组织中的存在性验证；
(6)在第1天、第7天、第14天、第21天、第28天、第35天、第42天用micro-CT成像系统对动物缺血模型的微血管网络成像，观测微血管网络密度是否发生了变化；
(7)由小动物缺血模型和干细胞移植后的不同时间点的干预组和对照组的血管铸型、 血管铸型的电镜扫描结果来验证micro-CT对微血管网络密度变化的成像结果以及验证血管是否有发芽情况。在步骤(1)中的干细胞是由稳定表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的转基因动物分离出来的，通过稳定表达荧光素酶在底物荧光素和氧以及三磷酸腺苷的作用下在动物体内产生生物发光，并采用光学分子成像设备探测到生物发光穿透生物组织，通过光信号的强度确定荧光素酶标记的干细胞的分布密度或干细胞的数量。在步骤(2)中成功建立小动物缺血模型，结扎动脉的中间部位，保证有微弱的侧枝循环，要保证缺血的效果既不能使缺血区域坏死，又要保证多只动物缺血模型的一致性。在步骤(3)将脂肪来源的间充质干细胞多点肌肉注射到缺血损伤区域，注射的多点个数为3-5个，注射点距离血管结扎部位l_3mm。在步骤(4)中利用生物发光断层成像系统对动物缺血模型中移植的干细胞进行示踪、观测存活情况，首先，在成像前10分钟对缺血动物模型注射荧光素底物每千克体重注射荧光素底物150mg，浓度为150ug/ml，然后，将小动物放置到生物发光断层成像系统的支架上，用装有异氟烷的动物麻醉机通过气体麻醉，并密闭暗箱，调节系统的成像参数， 曝光时间设置为5分钟、根据生物发光信号的强度设置科学级CCD相机的光圈范围为1至 8，采集图像的binning值设置为4或者8，间隔90度拍摄小动物体表的4个位置的生物发光信号，并在动物体表间隔90度放置Imm尼龙球作为标志物，并同样用CCD相机采集四个位置的照片，用于生物发光断层成像系统与micro-CT系统的双模态配准融合，对于缺血模型还要通过与生物发光断层成像系统垂直安装的micro-CT系统获得缺血模型的解剖结构信息；对这些解剖结构信息赋予光学参数后，进行生物发光信号的体内光源重建；设置 micro-CT系统的X-ray球管电压为50kVp、电流为0. 95mA、积分时间为0. 5秒、采用外触发模式、间隔0. 6度或者0. 75度采集一幅图像，对动物采集360帧或者480帧图像，采集完图像后将动物和附着在动物体表的标记点取下，通过micro-CT采集180帧钢珠几何仿体、暗电流以及空扫数据，用于动物的micro-CT的校准和三维重建；从而得到动物模型的三维解剖结构信息，micro-CT重建后的解剖结构信息与前面采集的四个位置的生物发光信号相结合即可以重建得到稳定表达荧光素酶的干细胞发光的三维空间位置和光源能量的定量信肩、ο对步骤(5)中的干细胞在缺血组织中的存在情况进行验证，通过处死缺血模型取缺血区域的肌肉组织，制作冰冻切片并用抗绿色荧光蛋白抗体染色，通过荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察来证明干细胞在缺血组织中是否存在。在步骤(6)中观测干细胞干预后微血管的网络的密度变化情况，观测新生情况，通过生物发光断层系统成像进而示踪干细胞在缺血部位的存在，与步骤(4)相同时间点对缺血部分的血管新生情况的观测则需要通过在体的micro-CT对微血管网络进行造影成像， 在步骤(6)中，首先在micro-CT扫描前，通过动物的静脉注射AuroVist-15nm造影剂，注射完造影剂后立即将动物固定到支架上并用异氟烷气体麻醉机保持动物在成像期间稳定呼吸、身体平稳，这里同样设置X-ray球管电压50kVp、电流0. 95mA、积分时间为0. 5秒、外触发模式、间隔0. 6度或者0. 75度采集一幅图像，对小动物采集360帧或者480帧图像；最终进行micro-CT数据重建，并利用3DMed软件结合阈值分割的方法将血管从造影增强的数据中分割出来，通过步骤(6)中不同时间点的成像结果可以观测微血管网络的密度变化情况； 另外，在对干细胞定量的分析中，采用动物缺血模型术后12小时成像并重建光源总能量的方法确立干细胞与光源重建总能量的定量关系。在步骤(7)中对微血管网络密度变化情况以及血管的新生情况，采用扫描电镜的方法对血管的超微结构进行观测，确定是否有血管发芽现象发生，进而明确微血管网络密度变化情况的根由是由血管新生造成的。与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下通过干细胞示踪以及观测血管新生的方法以及验证手段，可以证实本发明采用的生物发光断层成像方法以及micro-CT 血管造影的方法在活体情况下，通过干细胞的存活、三维定位定量观测以及微血管网络的密度变化情况来分析血管新生的情况，这一套方法避免了在不同时间点处死小动物模型的缺点，可以对动物连续长程地观测。四
图1为缺血模型多模态分子成像监测方法流程图2稳定表达荧光素酶(luciferase)和绿色荧光蛋白(GFP)的脂肪来源间充质干细胞显微镜图3小鼠下肢股动脉结扎造模图； 图4生物发光断层成像与micro-CT融合定位的过程图； 图5生物发光断层成像对下肢缺血模型移植干细胞的定量分析图； 图6通过抗GFP抗体染色的冰冻切片的荧光显微图像来验证干细胞在缺血区域的存在情况；
图7 micro-CT微血管网络造影成像及微血管密度对比结果； 图8血管铸型对缺血模型小鼠下肢微血管密度对比结果； 图9扫描电镜对血管铸型的微观扫描结果； 五具体实施例方式
本发明提出了对小动物缺血模型研究的系统观测方法，具体步骤如下
(1)稳定表达荧光素酶(luciferase)和绿色荧光蛋白(GFP)的干细胞的分离和培养， 干细胞是由稳定表达荧光素酶(luciferase)和绿色荧光蛋白(GFP)的转基因动物分离出来的；因为稳定表达荧光素酶，所以在底物荧光素(luciferin)和氧以及三磷酸腺苷(ATP) 的作用下产生生物发光，这种生物发光穿透生物组织后可以被光学分子成像设备探测到， 信号的强度(或者本发明中所提到的重建光源得到的总能量)直接反应了通过荧光素酶标记的干细胞的分布密度或干细胞的数量；
(2)构建缺血型动物模型，要保证缺血的效果既不能使缺血区域坏死，又要保证多只小动物缺血模型的一致性。例如构建小鼠的下肢缺血模型，需要结扎小鼠的股动脉中间部位， 这样可以保证小鼠在缺血期间不会造成下肢坏死，同时又可以得到明显的缺血效果；若干只缺血模型保持很好的一致性，为不同模态的成像对比提供可参考的数据。(3)移植步骤(1)中培养的干细胞到步骤(2)所构建的小动物模型的缺血损伤区域，例如在构建的下肢缺血模型中，则可以在下肢股动脉结扎的附近肌肉区域实施多点(3 至5个注射点)注射，注射点距离血管结扎部位l-3cm。(4)在第1天、第7天、第14天、第21天、第28天、第35天、第42
天等用生物发光断层成像系统进行成像，观测时间点直到看不到发光的干细胞为止； 从而可以定位干细胞在小动物体内存在的三维空间位置和示踪干细胞的存活情况，通过干细胞定量方法观测干细胞在体内不同时间点的存活数量，利用生物发光断层成像系统对小动物缺血模型中移植的干细胞进行示踪、观测存活情况。首先，在成像前10分钟对缺血动物模型注射荧光素底物(每千克体重注射荧光素底物150mg，浓度为150ug/ml)，然后，将小动物放置到生物发光断层成像系统的支架上，用装有异氟烷的小动物麻醉机通过气体麻醉，并密闭暗箱。调节系统的成像参数，曝光时间设置为5分钟、根据生物发光信号的强度设置科学级CXD相机的光圈范围为1至8，采集图像的binning值设置为4或者8，间隔 90度拍摄小动物体表的4个位置的生物发光信号，并在小动物体表间隔90度放置Imm尼龙球作为标志物，并同样用CCD相机采集四个位置的照片，用于生物发光断层成像系统与 micro-CT系统的双模态配准融合。对于缺血模型还要通过与生物发光断层成像系统垂直安装的micro-CT系统获得缺血模型的解剖结构信息，对这些解剖结构信息赋予光学参数后， 进行生物发光信号的体内光源重建。设置micro-CT系统的X-ray球管电压为50kVp、电流为0. 95mA、积分时间为0. 5秒、采用外触发模式、间隔0. 75度采集一幅图像，对小动物采集 480帧图像，采集完图像后将小动物和附着在小动物体表的标记点取下，通过micro-CT采集180帧钢珠几何仿体(间隔2度采集一帧投影图像)、暗电流以及空扫数据(分别采集50帧投影图像)，用于小动物的micro-CT的校准和三维重建；从而得到小动物模型的三维解剖结构信息，micro-CT重建后的解剖结构信息与前面采集的四个位置的生物发光信号相结合即可以重建得到稳定表达荧光素酶的干细胞发光的三维空间位置和光源能量的定量信息。(5)通过稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的干细胞进行抗GFP的抗体染色，通过处死缺血模型取缺血区域的肌肉组织，制作冰冻切片并用GFP抗体染色，因为干细胞也是由GFP 稳定表达的转基因鼠分离获得的，因此通过GFP抗体染色后可以在荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下看到绿色的干细胞存在于缺血组织部位，证明干细胞在缺血组织中的存在。(6)在第1天、第7天、第14天、第21天、第28天、第；35天、第42天
等用micro-CT成像系统对小动物缺血模型的微血管网络成像，观测微血管网络密度是否发生变化，首先，在micro-CT扫描前，通过小动物的静脉注射
AuroVist-15nm造影剂，若采用小鼠缺血动物模型，则可以采用尾静脉注射造影剂的方法，注射完造影剂后立即将小动物固定到支架上并用异氟烷气体麻醉机保持小动物在成像期间稳定呼吸、身体平稳，这里同样设置X-ray球管电压 50kVp、电流0. 95mA、积分时间为0. 5秒、外触发模式、间隔0. 75度采集一幅图像，对小动物采集480帧图像；最终进行micro-CT数据重建，并利用实验室开发的3DMed软件结合阈值分割的方法将造影增强对比度的数据把血管分割出来。通过步骤(6)中不同时间点的成像结果可以观测微血管网络的密度变化情况。另外，在对干细胞的定量分析中，采用小动物缺血模型术后12小时成像并重建光源总能量的方法确立干细胞与光源重建总能量的定量关系。步骤(6)与步骤(4)在相同时间点的缺血部位血管新生情况则需要利用micro-CT系统对微血管网络进行在体成像。(7)由小动物缺血模型和干细胞移植后的不同时间点的干预组和对照组的血管铸型以及血管铸型的电镜扫描结果来验证micro-CT对微血管网络密度变化的
成像结果，即采用血管铸型的方法对微血管网络的密度变化情况与micro-CT的成像结果进行对比验证，为进一步证实微血管网络密度变化情况以及血管的新生情况则采用扫描电镜的方法对血管的超微结构进行观测，确定是否有血管发芽现象。结合附图对本发明进行详细说明
图1所示缺血模型多模态分子成像监测方法流程图说明了该方法的主要步骤，首先步骤101开始对缺血型动物模型进行多模态分子成像的监测方法；步骤102为干细胞的分离和培养，这些干细胞取自于带有稳定表达绿色荧光蛋白和荧光素酶的转基因动物；步骤 103为缺血动物模型构建，本实施例中以构建小鼠下肢缺血模型为例；步骤104将干细胞移植到缺血组织，为下一步的多模态成像和离体鉴定做好准备工作；步骤105利用生物断层成像示踪干细胞，进行定量和三维可视化分析；步骤106为离体鉴定干细胞在缺血组织中的存在情况，对生物发光断层成像的结果进行验证；步骤107利用micro-CT系统对微血管网络造影成像，观测干细胞干预后不同时间点微血管网络密度是否发生了变化；步骤108 利用血管铸型及扫描电镜分别对micro-CT成像监测到的微血管网络密度情况以及进一步是否有血管发芽现象进行验证。步骤109结束缺血模型多模态分子成像监测方法。图2是根据本发明中的多模态分子成像方法中的稳定表达荧光素酶 (Iuciferase)和绿色荧光蛋白(GFP)的脂肪来源间充质干细胞显微成像的结果。从细胞的形态上可以鉴定细胞的可靠性。图3所示的小鼠下肢股动脉结扎造模图，是通过显微镜下操作建立缺血型动物模型，需要结扎小鼠的股动脉中间部位，这样可以保证小鼠在缺血期间不会造成下肢坏死同时可以得到明显的缺血效果；每只小鼠缺血模型的股动脉结扎部位相同以保证大批小动物缺血模型的一致性。小鼠下肢缺血模型构建成功后，还要在构建的动物模型的缺血区域注射干细胞； 对于构建的小鼠下肢缺血模型，采用在缺血区域距离结扎点3毫米的位置在三个点肌肉注射的方式实施干细胞移植。图4所示的是生物发光断层成像与micro-CT融合定位的过程图。其流程步骤包括
步骤301 生物发光断层成像干细胞重建
利用生物发光断层成像系统对缺血模型中移植的干细胞在不同的时间点进行示踪、观测干细胞的存活情况和三维定位、定量信息。首先，将缺血动物模型在成像前10分钟注射荧光素底物D-Luciferin (每千克体重注射荧光素底物150mg，浓度为150ug/ml)。其次，将小动物放置到生物发光断层成像系统的小动物支架上，用小动物麻醉机通过异氟烷气体麻醉(异氟烷2%，氧气300ml/min)，并密闭暗箱。再次，调节系统的成像参数，曝光时间设置为5分钟、根据生物发光信号的强度设置科学级CXD相机的光圈范围为1. 0至8. 0，采集图像的binning值设置为4或者8。间隔 90度拍摄小动物体表的4个位置的生物发光信号，并在小动物体表间隔90度放置直径为Imm的尼龙球作为标志物，并同样用CCD相机采集四个位置的照片，用于生物发光断层成像系统与micro-CT系统的双模态配准。步骤302 :micro-CT对小鼠下肢缺血模型重建，得到其解剖结构信息
获得动物模型的解剖结构信息对于生物发光断层成像的发光光源重建过程中的不同组织赋予准确的光学参数，有利于精确的重建光源。另外，解剖结构信息对于三维可视化提供了精确的空间位置信息。具体实施步骤如下
设置与生物发光断层成像系统垂直安装的micro-CT系统的X-ray球管电压50kVp、电流0. 95mA、积分时间为0. 5秒、外触发模式、间隔0. 75度采集一幅图像，对小动物采集480 帧图像；然后，通过micro-CT系统采集钢珠几何仿体(间隔2度采集180帧)、暗电流以及空扫数据(各采集50帧)，用于小动物的micro-CT位置校准和重建。最后，重建小鼠的下肢缺血模型得到其三维解剖结构信息。步骤303 生物发光断层成像与解剖结构信息相融合
micro-CT重建后的解剖结构信息与利用前面采集的四个位置的生物发光信号相结合重建得到的干细胞的生物发光光源空间位置和总能量，这种融合是基于前面数据采集过程中的四个直径约Imm的小球标记点的配准实现的。这样就得到稳定表达荧光素酶的干细胞发光的三维空间位置和光源能量的定量信息。图5所示的生物发光断层成像对下肢缺血模型移植干细胞的定量分析图，显示在定量分析过程中，首先是同时对多只不同小鼠下肢缺血模型注射不同数量的干细胞，12小时之后对注射不同数量干细胞的小鼠缺血模型进行生物发光断层成像，并重建得到干细胞在底物作用下所发光源的总能量，如图5 (a)所示。通过分析多只小鼠模型重建的干细胞总能量与细胞数量的线性拟合关系可以看出系统重建的总能量与细胞的数量有很好的线性关系(R2=O. 9927)，如图5 (b)所示。该定量方法对小鼠下肢缺血模型长程的观测可以看到干细胞在小鼠下肢中的存活和凋亡情况，如图5 (c)所示。图6所示的荧光显微图像是通过GFP抗体染色的冰冻切片的观测来验证干细胞在缺血区域的存在。本实施例中的干细胞是由稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶 (Iuciferase)的转基因鼠分离脂肪组织得到的脂肪来源的干细胞，在制作小鼠下肢缺血模型并移植干细胞的第1天、第7天、第14天、第21天、第观天、第35天、第42天等分别处死小动物缺血模型取缺血区域的肌肉组织，制作冰冻切片并用抗GFP抗体染色，以在荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观测GFP染色的绿色干细胞，就可以证明干细胞在缺血组织中的存在，如图6所示。图7所示micro-CT微血管网络造影成像及微血管密度对比结果，观测微血管网络密度的变化情况的目的就是观测干细胞干预后血管的新生情况。前面已说明通过生物发光断层成像可以示踪到干细胞在缺血部位的存在，但是还需要观察与示踪干细胞相同时间点缺血部位的血管新生情况，本发明采用活体情况下的micro-CT系统对微血管网络进行成像。首先，在micro-CT扫描前，通过小动物尾静脉注射AuroViSt-15nm造影剂，注射完造影剂后立即将小动物固定到支架上并用异氟烷气体麻醉机(异氟烷洲，氧气300ml/ min)保持小动物在成像期间稳定呼吸以避免在micro-CT数据重建中产生运动伪影，设置 micro-CT的参数为X_ray球管电压50kVp、电流0. 95mA、积分时间为0. 5秒、外触发模式、间隔0. 75度采集一幅图像，对小动物采集480帧图像。其次，对micro-CT数据重建，并利用3DMed软件用阈值分割的方法将造影增强对比度的血管分割出来。从图7可以看到图7 (a)是构建小鼠缺血模型当天并注射了干细胞的成像结果，图7 (b)是构建小鼠缺血模型后14天的成像结果，可以观测微血管网络密度明显变得稠密。图8所示的是血管铸型对缺血模型小鼠下肢微血管密度的对比结果。采用血管铸型的方法对微血管网络的密度变化情况与micro-CT的成像结果进行对比验证。从图8(a) 是在构建小鼠下肢缺血模型并注射细胞的第一天微血管网络的铸型结果，图8 (b)中是移植干细胞后第14天的血管铸型结果。在做血管铸型之前，先将小鼠下肢缺血模型麻醉(戊巴比妥钠，2%，45mg/kg体重)， 然后将小鼠的心尖开一个小口，用玻璃管插入到心房中并用细线将心尖与玻璃管尖端绑牢，将抽取IOml温肝素盐水(1000单位/500ml的0. 9%盐水)的注射器通过橡胶管连接到玻璃管上，并持续用力注射温肝素盐水，将心室外的静脉窦剪开使排出来的血液能顺利流出。再次，将抽取铸型剂的注射器和玻璃管通过橡胶管连接并持续以一定的压力注射，在 2小时后持续补助2-3次；低温储存静置M小时。最后，用浓烧碱溶液或者盐酸溶液腐蚀除血管之外的组织，并用清水冲洗去掉腐蚀组织，留下完整的血管；拍照获得血管铸型的图像。比较图8 (a)构建模型并移植干细胞的第1天与图8 (b)构建模型并移植干细胞的第 14天，可以明显的看出第14天的微血管网络比第1天的明显增多，与micro-CT的成像结果一致。图9所示的是扫描电镜对血管铸型的微观扫描结果。为进一步证实微血管网络密度变化后的血管新生情况，采用扫描电镜的方法对血管的超微结构进行观测，观测血管发芽现象，以及发芽数量的多少。首先，将前面获取的血管铸型在空气中风干；然后，将血管铸型固定到扫描电镜的固定螺母座上；再次，将铸型表面均勻喷涂一层金用于扫描电镜成像。 最后，将样品放入扫描电镜样品腔中，开展电镜扫描。电镜扫描结果从图9可以观察到干预组在第14天的成像结果比对照组第1天的成像结果有明显的血管新生发芽现象，图9 (a) 和(d)分别是对照组和干预组在放大10倍情况下的总体血管网情况，图9 (b)和(e)分别是放大50倍情况下观测到的血管新生发芽情况，从发芽数量上可以明显看出干预组的血管新生发芽更多一些。在图9 (c)和(f)中可以更清晰的看出血管发芽的细节信息。这些发芽的尺寸在十几个微米左右。通过图8和图9也可以证实微血管网络在干预后14天明显变得更加稠密。利用光学探针标记的干细胞通过生物发光断层成像(Bioluminescence Tomography, BLT)实现定位和定量分析的方法，能够示踪干细胞的存活以及细胞数量的信息，并可以得到清晰的三维可视化效果；在观测血管新生方面采用新型的Aur0ViSt-15nm 造影剂造影增强的方法，利用micro-CT对小动物微血管网络进行成像，可以发现微血管网络的密度变化情况，有效的避免了对动物模型的处死检验；从而可以实现连续长程地观测小动物缺血模型的干细胞存活和在体内的三维定位、定量信息，以及干细胞干预后动物模型的血管新生情况。
权利要求
1.缺血模型多模态分子成像监测方法，其特征在于所述的监测步骤为(1)稳定表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的干细胞的分离和培养；(2)构建缺血动物模型；(3)移植步骤(1)中培养的干细胞到步骤(2)所构建的动物模型的缺血损伤区域；(4)在第1天、第7天、第14天、第21天、第观天、第35天、第42天用生物发光断层成像系统进行成像，观测时间点直到看不到发光的干细胞为止；从而可以定位干细胞在小动物体内存在的三维空间位置和示踪干细胞的存活情况，通过干细胞定量方法观测干细胞在体内不同时间点的存活数量；(5)通过稳定表达绿色荧光蛋白的干细胞进行抗绿色荧光蛋白的抗体染色，处死动物模型并在注射干细胞的区域取肌肉组织制作冰冻切片，用荧光显微镜做干细胞在缺血组织中的存在性验证；(6)在第1天、第7天、第14天、第21天、第28天、第35天、第42天用micro-CT成像系统对动物缺血模型的微血管网络成像，观测微血管网络密度是否发生了变化；(7)由小动物缺血模型和干细胞移植后的不同时间点的干预组和对照组的血管铸型以及血管铸型的电镜扫描结果来验证micro-CT对微血管网络密度变化的成像结果。
2.根据权利要求1所述的缺血模型多模态分子成像监测方法，其特征在于在步骤(1) 中的干细胞是由稳定表达荧光素酶和绿色荧光蛋白的转基因动物分离出来的，通过稳定表达荧光素酶在底物荧光素和氧以及三磷酸腺苷的作用下在动物体内产生生物发光，并采用光学分子成像设备探测到生物发光穿透生物组织，通过光信号的强度确定荧光素酶标记的干细胞的分布密度或干细胞的数量。
3.根据权利要求1所述的缺血模型多模态分子成像监测方法，其特征在于在步骤(2) 中成功建立小动物缺血模型，结扎小动物目标区域动脉的中间部位，并且有微弱的侧枝循环以保证缺血的效果既不能使缺血区域坏死，又要保持多只动物缺血模型的一致性。
4.根据权利要求1所述的缺血模型多模态分子成像监测方法，其特征在于所述的移植干细胞到所构建的动物模型缺血损伤区域，将脂肪来源的间充质干细胞多点肌肉注射到缺血损伤区域，注射的多点个数为3-5个，注射点距离血管结扎部位l_3mm。
5.根据权利要求1所述的缺血模型多模态分子成像监测方法，其特征在于在步骤(4) 中利用生物发光断层成像系统对动物缺血模型中移植的干细胞进行示踪、观测存活情况， 首先，在成像前10分钟对缺血动物模型注射荧光素底物每千克体重注射荧光素底物150 mg至450mg，浓度为150 ug/ml至450ug/ml，然后，将小动物放置到生物发光断层成像系统的支架上，用装有异氟烷的动物麻醉机通过气体麻醉，并密闭暗箱，调节系统的成像参数，曝光时间设置为3至10分钟、根据生物发光信号的强度设置科学级CCD相机的光圈范围为1至8，采集图像的binning值设置为4或者8，间隔90度拍摄小动物体表的4个位置的生物发光信号，并在动物体表间隔90度放置直径为Imm的尼龙球作为标志物，并同样用 CCD相机采集四个位置的照片，用于生物发光断层成像系统与micro-CT系统的双模态配准融合，对于缺血模型还要通过与生物发光断层成像系统垂直安装的micro-CT系统获得缺血模型的解剖结构信息；对这些解剖结构信息赋予光学参数后，进行生物发光信号的体内光源重建；设置micro-CT系统的X-ray球管电压为50kVp、电流为0. 95mA、积分时间为0. 5 秒、采用外触发模式、间隔0.6度或0. 75度采集一幅图像，对动物采集360帧或480帧图像，物和附着在动物体表的标记点取下，通过micro-CT采集180帧钢珠几何仿体、暗电流以及空扫数据，用于动物的micro-CT的校准和三维重建；从而得到动物模型的三维解剖结构信息，micro-CT重建后的解剖结构信息与前面采集的四个位置的生物发光信号相结合即可以重建得到稳定表达荧光素酶的干细胞发光的三维空间位置和光源能量的定量信息。
6.根据权利要求1所述的缺血模型多模态分子成像监测方法，其特征在于对步骤(5) 中的干细胞在缺血组织中的存在情况进行验证，通过处死缺血模型取缺血区域的肌肉组织，制作冰冻切片并用抗绿色荧光蛋白抗体染色，通过荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察染色后的冰冻切片来证明干细胞在缺血组织中的存在。
7.根据权利要求1所述的缺血模型多模态分子成像监测方法，其特征在于在步骤(6) 中观测干细胞干预后微血管网络密度是否发生了变化，通过生物发光断层成像系统示踪干细胞在缺血部位的存在，与步骤(4)相同时间点对缺血部分的血管新生情况的观测则需要利用micro-CT系统对微血管网络进行造影成像，在步骤(6)中，首先在micro-CT扫描前， 通过动物的静脉注射Aur0ViSt-15nm造影剂，注射完造影剂后立即将动物固定到支架上并用异氟烷气体麻醉机保持动物在成像期间稳定呼吸、身体平稳，这里同样设置X-ray球管电压50kVp、电流0. 95mA、积分时间为0. 5秒、外触发模式、间隔0. 6度或0. 75度采集一幅图像，对小动物采集360帧或480图像；最终进行micro-CT数据重建，并利用3DMed软件结合阈值分割的方法将血管从造影增强对比度的数据中分割出来，通过步骤(6)中不同时间点的成像结果可以观测微血管网络的密度变化情况；在对干细胞定量的分析中，采用动物缺血模型术后12小时成像并重建光源总能量的方法确立干细胞与光源重建总能量的线性定量关系。
8.根据权利要求1所述的缺血模型多模态分子成像监测方法，其特征在于在步骤(7) 中微血管网络密度变化情况以及血管的新生情况采用扫描电镜的方法对血管的超微结构进行观测，确定是否有血管发芽现象，进而明确微血管网络密度变化情况的根由是由血管新生造成的。
全文摘要
本发明涉及多模态分子成像技术领域，具体涉及一种缺血模型多模态分子成像监测方法。通过干细胞示踪、血管新生的观测方法以及验证手段，可以证实本发明在活体情况下采用的生物发光断层成像方法以及micro-CT血管造影的方法，通过干细胞的存活、三维定位定量观测以及微血管网络的密度变化情况来分析血管新生的情况，这一套方法避免了在不同时间点处死小动物模型的缺点，可以对动物连续长程地观测。
文档编号A61B5/00GK102389297SQ201110258049
公开日2012年3月28日 申请日期2011年9月2日 优先权日2011年9月2日
发明者刘俊廷, 曹丰, 梁继民, 田捷, 范伟伟 申请人:中国人民解放军第四军医大学, 西安电子科技大学