一种家禽饲养用免疫增强剂的制作方法

专利名称：一种家禽饲养用免疫增强剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于增强家禽免疫力的中药复方制剂。
背景技术：
免疫增强剂是一类通过提高和促进动物体非特异性或特异性免疫功能来增强机体免疫应答、调节免疫功能，以达到防治疾病目的的物质。近年来，一些家禽由病毒感染所引发的免疫抑制日趋严重，呈扩散蔓延趋势，因多 以亚临床感染的形式出现而易被忽视。在我国鸡群中免疫抑制性病毒的二重或多重感染存在一定的普遍性，降低鸡群的免疫力，使一些过去容易控制的疾病变得难以控制。这些免疫抑制性病毒主要包括鸡马立克氏病病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡传染性贫血病毒、禽网状内皮组织增生症病毒和禽白血病病毒等。在我国鸡群中，免疫抑制性病毒的二重及多重感染具有普遍性。单一的免疫抑制性病毒感染往往不表现明显的临床症状，使机体的免疫状态受到抑制但不很严重，但当有两种或两种以上病毒同时感染同一个体时，则会使机体处于严重的免疫抑制状态。崔治中等对从全国各地随机收集到的疑似IBDV感染的60多个法氏囊样品进行检查发现，有相当高比例的样品中分别存在着对鸡马立克氏病病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡传染性贫血病毒、禽网状内皮组织增生症病毒不同组合的二重感染和多重感染，其中5个样品中同时存在着以上4种病毒的感染。免疫抑制性病毒的二重或多重感染，因为共感染病毒间的相互协同作用而使机体处于严重的免疫抑制状态，对新城疫(ND)等的疫苗接种不能产生足够的保护性免疫应答，所以尽管在我国鸡群中对ND采取高强度免疫，仍不能有效控制ND的流行，使一些病原难以从我国鸡群中清除。另外，病毒的二重或多重感染可能引起病毒间基因发生重组，从而为产生新的病毒创造了条件。第三，处于免疫抑制状态的鸡群，感染细菌性疾病的几率明显增加，并对细菌具有多重耐药性。排除鸡群免疫抑制，提高鸡群疫苗免疫成功率，增加鸡群抗病力已是目前养鸡生产中急需解决的问题。随着生物科学技术的迅猛发展和中药免疫药理学研究的不断深入，具有我国传统特色的中医药在畜禽疫病防治中显示了无可比拟的优势，中药不仅可以促进疫苗的免疫效果(如王关林报道莪术多糖对雏鸡抗氧化能力和免疫功能的影响等)，还在预防和治疗病毒性和细菌性疾病及排除免疫抑制方面均有明显的作用(如刘家国报道中药制剂抑制大肠杆菌生长和繁殖及陈德坤报道中药提高对新城疫病毒的保护率等)。尤其是有关调节畜禽机体抵抗力的中药，已显示出了强大的生命力。补益类中药一般都有增强机体免疫功能的作用，而对正常细胞毒副作用不明显，是良好的生物反应调节剂。但这些研究尚属初步，总的来说仍处于探索阶段，存在一些缺陷。如许多研究都是只停留在对一般性指标粗浅的观察上，过分重视对单味药物的药效研究，忽视机体免疫是复杂的作用过程和运用中医理论进行中药复方调节免疫的探索。如果能利用中药复方作用多样性的特点，开发出激发免疫效果的有效方剂，那么不仅在中医药调节免疫方面将产生突破性进展，而且对于深入阐明中医辩证施治及整体观理论乃至促进中医药理论的发展都具有重要意义。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种家禽饲养用免疫增强剂，能够对家禽尤其是鸡的免疫力产生优良的促进作用，对机体黏膜免疫功能的影响尤为明显。为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。一种家禽饲养用免疫增强剂，其按重量份数比包含黄芪30-45、女贞子30-40、党参20-30、红花8-12、白术10-15，肉桂10-12、熟地15-20、何首乌10-15、麦冬10-12、当归15-20、茯苓 15-20，刺五加 10-15。作为本发明的一种优选技术方案，上述家禽饲养用免疫增强剂按重量份数比包含黄芪38、女贞子35、党参25、红花10、白术12，肉桂11、熟地 18、何首乌13、麦冬11、当归17、茯苓18，刺五加12。作为本发明的一种优选技术方案，上述家禽饲养用免疫增强剂按重量份数比包含黄芪32、女贞子40、党参21、红花8、白术15，肉桂10、熟地20、何首乌15、麦冬12、当归15、茯苓20，刺五加10。作为本发明的一种优选技术方案，上述家禽饲养用免疫增强剂按重量份数比包含黄芪44、女贞子31、党参29、红花12、白术11，肉桂12、熟地15、何首乌11、麦冬10、当归20、茯苓15，刺五加15。作为本发明的一种优选技术方案，上述家禽饲养用免疫增强剂按重量份数比包含黄芪35、女贞子37、党参25、红花12、白术12，肉桂10、熟地15、何首乌13、麦冬11、当归18、茯苓18，刺五加12。作为本发明的一种优选技术方案，上述家禽饲养用免疫增强剂按重量份数比包含黄芪38、女贞子35、党参29、红花10、白术10，肉桂10、熟地15、何首乌13、麦冬11、当归18、茯苓15，刺五加10。采用上述技术方案所产生的有益效果在于①本发明按照〃扶正固本，补气健脾，活血化淤〃的中兽医理论，筛选出了提高禽类免疫力的免疫增强剂；试验显示(具体的试验方法详见下文)本发明的产品对鸡T淋巴细胞亚群分类、淋巴细胞增殖、淋巴因子、浆细胞及其分泌SIgA含量、血细胞吞噬能力等均具有一定的促进作用，对家禽尤其是鸡的免疫力具有优良的促进作用，对机体黏膜免疫功能的影响尤为明显。②本发明的免疫增强剂能够提高吞噬细胞能力0.26 (0D)、溶菌酶分泌水平13ii g/ml、肠道和气管SIgA分泌水平0. 2以上(0D)、脾淋巴细胞诱生因子分泌水平3 (OD)(上述数值均为与空白对照相比的增高值)；雏鸡饲喂本发明的本发明免疫增强剂5d后，环磷酸铵所引起的免疫抑制被排除，细胞免疫、体液免疫和粘膜免疫功能恢复正常。③对本发明药品的验证试验一、材料与方法I.材料I. I.本发明免疫增强剂的制备配方I (本发明配方)本课题组筛选黄芪38、女贞子35、党参25、红花10、白术12，肉桂11、熟地18、何首乌13、麦冬11、当归17、茯苓18，刺五加12，共12种市销中药组方，80目粉碎，在20-30°C、相对湿度70%左右的环境中存放。配方2 (对比配方)本课题组筛选野菊花10、黄芪25、山豆根20、桔梗15、车前子10、板蓝根10、牛黄5、甘草5，共8种市销中药组方，80目粉碎，在20-30 V、相对湿度70%左右的环境中存放。I. 2传染性法氏囊病毒(IBDV)制备将采用自然发生传染性法氏囊病病鸡法氏囊和脾脏按照李银聚介绍的方法处理，制成IBD野毒。将其接种鸡胚，测定IBD野毒的EID5Q。I. 3疫苗增效剂(中成药)由河北省神康兽药有限公司生产。I. 4环磷酸胺邯郸市医院惠赠。I. 5^3+、CT4+和⑶/单克隆抗体购于石家庄开创生化试剂销售公司I. 610%犊牛血清购于石家庄生创生化试剂销售公司 I. 7黄芪多糖购于重庆泰通动物药业有限公司。I. 8葡萄糖试剂盒购于上海复星长征医学科学有限公司I. 9胆碱酯酶试剂盒购于中生北控生物科技股份有限公司
I. 10饲料购于石家庄市正大集团2试验设计2. I本发明免疫增强剂配方的筛选从石家庄市某鸡场购I日龄雏鸡80只，雌雄各半。随机将80只I日龄肉鸡分成I、II、III、IV共4组，每组20只。试验期间，每组隔离饲养，鸡只自由采食相同日粮，自由饮水，给予24h光照。20日龄时，按0. 1%剂量分别给III、IV组肉鸡日粮中添加本发明的免疫增强剂或对比配方的中药(见表1)，连用5天。然后给采用点眼、滴鼻、肌注方法给II、III、IV组肉鸡用500 EID50 IBDV进行攻毒。攻毒前I天和攻毒后5天每组随机选择5只鸡，各采血5ml，按血浆糖皮质激素试剂盒说明书的要求进行处理，然后进行检测；结果参见表I。2. 2本发明免疫增强剂剂量的筛选研究从石家庄市某鸡场购I日龄雏鸡120只，雌雄各半。在7日龄进行2羽份新支120冻干苗点眼；分别在10日龄、17日龄进行2羽份传染性法氏囊疫苗滴嘴。按常规方法喂养和管理。随机将120只I日龄肉鸡分成I、II、III、IV、VI、V共6组，每组20只。I组作为正常对照组；II组作为免疫抑制对照组，只进行肌肉注射环磷酸胺；III、IV、V、VI组肉鸡自7日龄至12日龄，向日粮中添加本发明的免疫增强剂或者疫苗增效剂(中成药，由河北省神康兽药有限公司生产)，同时于10日龄时腹部肌肉注射环磷酸胺80mg/kg体重，连用5天；试验期为21d。于21日龄，每组随机抽取5只雏鸡，空腹称量体重后，无菌取其法氏囊，生理盐水冲洗，无菌滤纸吸干表面水分后称重，并计算法氏囊免疫指数(法氏囊免疫指数=法氏囊/体重比)；结果参见表2。2. 3本发明免疫增强剂对机体免疫机能影响2. 3. I本发明免疫增强剂对T淋巴细胞亚群分类影响从河北某鸡场购I日龄AA肉鸡60只，雌雄各半，随机将其分为I、11二组，每组30只。按AA肉鸡饲养管理标准进行管理和常规免疫外，于20日龄时II组按0. lg/kg体重/天向鸡饲料中添加本发明的免疫增强齐U，连用5天。I组作为对照组，除不添加中药外，其它条件与均I组相同。25日龄时，每组随机选择5只鸡，从鸡的心脏采血各5ml，制成抗凝血，将抗凝血按常规方法分离出淋巴细胞后，按说明加入ra3+、CD:和⑶/单克隆抗体，应用流式细胞仪检测外周血液ra3+、CD:和⑶/比例；结果参见表3。
2. 3. 2.本发明免疫增强剂对脾淋巴细胞诱生因子的影响从石家庄市某鸡场购I日龄雏鸡200只，雌雄各半。随机将200只I日龄肉鸡分成I、II、III、IV四组，每组50只。试验期间，每组隔离饲养，鸡只自由采食相同日粮，自由饮水，给予24h光照。各组严格隔离饲养。3日龄时，按使用说明给III组肉鸡日粮中添加黄芪多糖；按0. 1%剂量分别给IV组肉鸡日粮中添加本发明的免疫增强剂，连用5天。6日龄时，给II、III、IV组鸡经口人工感染IBDV。8日龄、15日龄时，每组随机选择5只鸡，无菌采取脾脏，制成单细胞悬液(IXlO6个/ml)。加入100 u L RPMI-1640培养液(含10%犊牛血清、20 u g/mLConA和青、链霉素各100U/mL)，将细胞置于40°C、5% CO2饱和湿度培养箱培养42h。最后收集细胞培养液于3000r/min离心20min，吸取上清液，参照试剂盒说明书测定上清液中的IL-2含量；结果参见表4。2. 3. 3本发明免疫增强剂对肠道和气管SigA分泌量的影响从石家庄市某鸡场购I日龄雏鸡90只，雌雄各半。在7日龄进行2羽份新支120冻干苗点眼；分别在10日龄、17日龄进行2羽份传染性法氏囊疫苗滴嘴。按常规方法喂养和管理。随机将90只I日龄肉鸡分成I、II二组，每组30只。I组作为正常对照组；II组作为用药对照组，自8日龄至13日龄按黄芪多糖使用说明给鸡饮水；111组自8日龄至13日龄，按0. 1%的剂量向其日粮中添 加本发明免疫增强剂。其他条件均相同。分别于14、21日龄，每组随机抽取5只雏鸡，屠宰后，收集鸡气管液、肠液，然后利用间接ELISAL法检测其IgA抗体；结果参见表5。2.4.本发明免疫增强剂对肉鸡巨噬细胞吞噬功能和血清溶菌酶影响2.4. I中药对细胞无毒浓度的测定无菌操作取9-10日龄健康鸡胚，置灭菌培养皿中除去头、爪、内脏,并剪成块,用Hanks’液充分冲洗后移入广口瓶中，加入约4倍量的
0.25%的胰酶，调节pH值到7-7. 8，振荡混匀后置37°C水浴中感作40min，每Imin轻摇一次。消化液过滤后加入营养液，用7. 5%NaHC03调pH到7. 2-7. 4。分装于细胞培养瓶中，置37°C温箱中培养24h-48h细胞长成单层。将维持液中的中药浓度分别调制成Iml相当于
0.017g、0. 025g、0. 033g、0. 066g生药，然后接种于生长良好的细胞单层上，每个稀释度接种二瓶细胞，以不加药液的正常细胞作对照。连续观察6d，以出现细胞退变的最小稀释倍数作为该药对细胞的无毒浓度，即为试验中药药液浓度；结果参见表6。2. 4. 2中性红吞噬试验参照崔东安测定小鼠吞噬细胞功能的方法，利用96孔酶标板，设I、II、III、IV、V、VI6个组，每组8个孔。III、IV、V、VI为试验组，分别加入细胞培养用PAP至中药浓度为100 u g/ml、200 u g/ml、400 u g/ml ; I、II 二组为对照组，I组加入等体积的RPMI1640液，作为空白对照；II组加入细胞培养用PAP至黄芪多糖浓度为200 ii g/ml。在37°C 5% CO2感作48h后，弃上清液，用PBS清洗二次，加入0. 075%中性红溶液100 u L，培养2h，弃上清液，用PBS清洗三次，加入120 u L酸性异丙醇，摇匀溶解后，于595nm处检测吸光度值；结果参见表7。2. 4. 3血清溶菌酶水平测定将120只I日龄健康艾维茵肉鸡随机分为试验组和对照组，自7日龄至14日龄，III、IV、V、VI三组肉鸡分别按0. 06%,0. 08%,0. 1%、0. 14%的剂量
向试验组肉仔鸡日粮中添加本发明的免疫增强剂，自15日龄后常规饲养。I组作为正常对照组，除不喂本发明免疫增强剂物外，其它均和对照组相同。II组作为药物处理对照组，该组肉鸡按黄芪多糖使用说明使用(按0. 01%向日粮中添加);试验期为28d。17日龄时，对每组肉鸡进行心脏采血，常温下保持30min，经离心分离出血清后，按溶菌酶测定试剂盒的说明书测定其含量；结果参见表8。
2.5.本发明免疫增强剂对环磷酸胺致免疫低下肉鸡的免疫影响2. 5. I免疫器官指数的测定从石家庄市某鸡场购I日龄雏鸡80只，雌雄各半。在7日龄进行2羽份新支120冻干苗点眼；分别在10日龄、17日龄进行2羽份传染性法氏囊疫苗滴嘴。按常规方法喂养和管理。随机将80只I日龄肉鸡分成I、II、III、IV共4组，每组20只。I组作为正常对照组；II组作为免疫抑制对照组，只进行肌肉注射环磷酸胺JII组肉鸡自7日龄至12日龄，按0. 1%的剂量向其日粮中添加本发明免疫增强剂；IV组肉鸡自7日龄至12日龄，按0. 1%的剂量向日 粮中添加本发明免疫增强剂，同时于10日龄时肌肉注射环磷酸胺；试验期为21d。分别于14、21日龄，每组随机抽取5只雏鸡，无菌取其法氏囊、胸腺和脾脏，生理盐水冲洗，用无菌滤纸吸干表面水分后称重，并计算法氏囊、胸腺及脾脏免疫器官管指数；结果参见表9。2. 5. 2脾脏淋巴细胞转化率的测定将上述称量完毕的脾脏除去外膜，用生理盐水冲洗数次，加平衡盐水，剪刀剪碎，200目铜网过滤，分离单个脾细胞。分离的脾脏淋巴细胞样品用含10%小牛血清的DMEM培养基重悬，调整细胞数为IXlO6Ail ;取脾细胞悬液50iil，加入IOiil标记抗体，混匀，4°C孵育40min ;加入PBS，8000rpm，5min洗涤细胞3次；细胞沉淀中加入200 ill I %多聚甲醛4°C过夜。应用流式细胞仪检测各组脾细胞中⑶/、⑶/构成比情况；结果参见表10。2. 5. 3ND抗体水平的测定在上述测定免疫器官指数的试验过程中，屠宰鸡之前，对每只鸡进行心脏采血5ml，待析出血清后，利用微量血凝抑制法测定其ND抗体水平；结果参见表11。2. 5. 4气管和肠道IgA抗体的检测在上述测定免疫器官指数的试验过程中，屠宰鸡时收集鸡气管液、肠液，然后利用间接ELISAL法检测其SIgA抗体；结果参见表12。3.本发明免疫增强剂对肉鸡血液指标和饲料转化率影响将7日龄AA肉鸡60只随机分成I、II两组，每组30只。II组按0. 5%的剂量向饲料中添加本发明的免疫增强剂，连用14天，I组为空白对照组。其它条件两组均相同。将7日龄AA肉鸡60只随机分成I、II两组，每组30只。I组按0. 1%的剂量向饲料中添加本发明的免疫增强剂，连用14天，II组为空白对照组。给药后第15天，每组随机选择5只肉鸡，空腹称重；心脏采血10mL，静置20min,于3000r / min离心IOmin制备血清。屠宰后,立即剖杀,取十二指肠食糜3_5g。整个过程中记录肉鸡米食量。3. I血清胆碱酯酶(CHE)检测按照血清胆碱酯酶试剂盒说明书，将上述处理血清利用比色法检测肉鸡血清胆碱酯酶含量；结果参见表13。3. 2血糖检测将上述处理血清采用试剂盒并结合全自动生化分析仪测定葡萄糖浓度；结果参见表13。3. 3.淀粉酶检测按I :51的食糜水质量比，称取0. 5g食糜，加入4°C双蒸水后，迅速转入玻璃匀浆器中，匀浆管置于400ml烧杯内，其中放有冰水，温度保持在4°C以下，匀浆30s。在4°C条件下再用冰冻离心机离心,于12000r/min离心15min。取部分上清液,采用碘一淀粉比色法测定；结果参见表13。3. 4饲料转化率测定饲料转化率为肉鸡平均体重与整个试验过程中肉鸡平均采食量的比值；结果参见表13。4.本发明免疫增强剂生物安全性试验
4. I小白鼠急性中毒试验河北医科大学提供的小白鼠40只，雌、雄各半，体重在18-22g之间，平均体重19. 5g。要求饲养室的室温为(23±1)°C，相对湿度为(55±5)%，12h光照。按霍恩氏法共分五个剂量级，每级为一个试验组，共5组；另设对照组一个。给药途径和方法采取一次性灌胃法，即将本发明免疫增强剂添加剂按改良寇氏法进行剂量分级称取，向各分级剂量加入生理盐水配成混悬液，用注射器吸混悬液，将混悬液缓缓灌入小白鼠胃内。灌药后，每隔30min检查一次小白鼠活动情况；灌药2h后，每2h检查一次；灌药12h后,每日上、下午各检查一次。检查要点为小白鼠的精神状态、饮欲、食欲、排便有无异常，是否有中毒或死亡现象；试验结束后及时剖检小白鼠，对其脏器组织进行H. E染色、光镜观察；于第7天统计LD5tl ;结果参见表14。4. 2小白鼠亚慢性中毒试验随机筛选同批次小白鼠10只分为二组，一组为试验组，另一组为对照组。将本发明免疫增强剂添加剂按小白鼠饲料量的10% (肉鸡用量的10倍)添加于鼠饲料中，混合均匀后制成饼状自然风干；对照组的小白鼠饲料中不添加本发明免疫增强剂添加剂。其它条件均相同，连续饲喂60天，进行详尽观察，判断有无慢性中毒现象，同时剖检试验鼠，并对脏器组织进行a E染色、光镜观察。试验开始和结束时均称重，并求其平均值。二、试验结果I.不同配方免疫增强剂防治肉鸡腹水综合征的研究表I本发明免疫增强剂对肉鸡血浆糖皮质激素浓度影响
权利要求
1.一种家禽饲养用免疫增强剂，其特征在于按重量份数比包含黄芪30-45、女贞子30-40、党参20-30、红花8-12、白术10-15，肉桂10-12、熟地15-20、何首乌10-15、麦冬10-12、当归 15-20、茯苓 15-20，刺五加 10-15。
2.根据权利要求I所述的家禽饲养用免疫增强剂，其特征在于按重量份数比包含黄芪38、女贞子35、党参25、红花10、白术12，肉桂11、熟地18、何首乌13、麦冬11、当归17、茯苓18，刺五加12。
3.根据权利要求I所述的家禽饲养用免疫增强剂，其特征在于按重量份数比包含黄芪32、女贞子40、党参21、红花8、白术15，肉桂10、熟地20、何首乌15、麦冬12、当归15、茯苓20，刺五加10。
4.根据权利要求I所述的家禽饲养用免疫增强剂，其特征在于按重量份数比包含黄芪44、女贞子31、党参29、红花12、白术11，肉桂12、熟地15、何首乌11、麦冬10、当归20、获茶15,刺五加15。
5.根据权利要求I所述的家禽饲养用免疫增强剂，其特征在于按重量份数比包含黄芪35、女贞子37、党参25、红花12、白术12，肉桂10、熟地15、何首乌13、麦冬11、当归18、茯苓18，刺五加12。
6.根据权利要求I所述的家禽饲养用免疫增强剂，其特征在于按重量份数比包含黄芪38、女贞子35、党参29、红花10、白术10，肉桂10、熟地15、何首乌13、麦冬11、当归18、获茶15,刺五加10。
全文摘要
本发明公开了一种家禽饲养用免疫增强剂，其按重量份数比包含黄芪30-45、女贞子30-40、党参20-30、红花8-12、白术10-15，肉桂10-12、熟地15-20、何首乌10-15、麦冬10-12、当归15-20、茯苓15-20，刺五加10-15。本发明能够对家禽尤其是鸡的免疫力产生优良的促进作用，对机体黏膜免疫功能的影响尤为明显。
文档编号A61P37/04GK102716327SQ20121023072
公开日2012年10月10日 申请日期2012年7月5日 优先权日2012年7月5日
发明者张永英, 张登荣, 强慧芹, 王斌, 石玉祥, 裴艳涛, 赵兵令, 赵洪明, 钟翠红 申请人:河北工程大学