重组adamts13在制备脑出血药物中的用途
【专利摘要】本发明属生物制药领域，涉及重组ADAMTS13在制备脑出血药物中的用途，尤其是重组ADAMTS13在制备减少脑缺血后tPA溶栓治疗引起的脑出血药物中的用途。本发明经实验结果显示，在缺血条件下tPA诱导产生的VEGF能被RhoA或Akt的特异性抑制剂所阻断，而重组ADAMTS13显著降低RhoA的激活和Akt的磷酸化，表明重组ADAMTS13通过RhoA和Akt通路实现对tPA诱导的VEGF表达的抑制。本发明所述的重组ADAMTS13通过抑制RhoA和Akt介导的脑血管通透性增加,减轻tPA对血脑屏障的损害从而减少其引起的脑出血，因此，联合使用重组ADAMTS13和tPA是增加溶栓安全性的一种新型对策和手段。
【专利说明】重组ADAMTS13在制备脑出血药物中的用途
【技术领域】
[0001]本发明属生物制药领域，涉及重组ADAMTS13在制备脑出血药物中的用途，尤其是重组ADAMTS13在制备减少脑缺血后tPA溶栓治疗引起的脑出血药物中的用途。
【背景技术】
[0002]研究表明，脑中风是导致人类残疾和死亡的主要原因之一；而组织型纤溶酶原激活剂tPA (Tissue Plasminogen Activator)因其具有强大的溶栓作用，成为当前治疗卒中最有效的药物；但使用tPA溶栓有增加脑出血的风险，因此，如何克服tPA引起的脑出血，对降低脑中风的致残和致死率具有重要的意义。
[0003]所述的tPA为一种丝氨酸蛋白酶，其在维持血液凝固和纤维蛋白溶解过程中起着重要的作用；tPA不仅对正常中枢神经系统生理和神经元可塑性起调节作用，在中枢神经系统病理方面也起着关键的作用。所述tPA促进兴奋性毒素引起的神经元死亡、增加缺血性脑损伤，基因敲除tPA或者药物抑制tPA对缺血大脑均起到显著的保护作用。此外，tPA已被证明可通过促进基质金属蛋白酶-9(MMP_9)和转录因子NF-K B的活化以及促进Akt磷酸化和细胞外基质的降解，加剧缺血内皮的损伤和血脑屏障的破裂。已有大量的实验和临床证据表明，tPA引起 血脑屏障的破裂是其造成脑出血的最直接原因之一；因此，减轻tPA介导的血脑屏障破裂，将会有效地降低tPA溶栓引起的脑出血。
[0004]有研究显示，血管性血友病因子von Willebrand factor (VWF)是内皮细胞和巨核细胞产生的复合糖蛋白；此外，ADAMTS13 (a disintegrin-1 ike and metalloprotease withthrombospondin type I repeats-13)是近年新发现的一种存在于血衆中的金属蛋白酶，所述ADAMTS13最重要的功能是将新分泌的超大VWF裂解成较小的粘附性低的复合受体形式，从而减少血栓的形成；所述VWF是ADAMTS13目前已知的唯一裂解底物，在中枢神经系统，内皮细胞中VWF表达丰富，可是，对VWF在调节血脑屏障通透性中所起的作用却知之甚少。有研究表明，在缺血性中风、脑出血和蛛网膜下出血这些与血脑屏障破裂有关的疾病中，血浆中的VWF表达明显升高；此外，患有心血管疾病的患者在进行溶栓治疗后，血浆中的VWF也明显升高。最近有研究发现，VWF基因缺失对脑缺血小鼠起保护作用，与之相反，ADAMTS13基因敲除导致脑缺血病灶明显增大，而重组ADAMTS13则显著减轻急性脑缺血损伤。
[0005]迄今为止，尚未见有关重组ADAMTS13用于减少脑缺血后tPA溶栓治疗引起的脑出血的报道。
[0006]与本发明有关的参考文献有:
[0007]1.Zivin JA.Acute stroke therapy with tissue plasminogen activator(tPA)since it was approved by the U.S.Food and Drug Administration(FDA).AnnNeurol2009 ；66:6-10.[0008]2.Lansberg MG,Albers GW,Wijman CA.Symptomatic intracerebral hemorrhagefollowing thrombolytic therapy for acute ischemic stroke:a review of the riskfactors.Cerebrovasc Dis 2007 ；24:1-10.[0009]3.Wardlaw JM, Sandercock PA， Berge E.Thrombolytic therapy withrecombinant tissue plasminogen activator for acute ischemic stroke:Where do wego from here?A cumulative meta-analysis.Stroke 2003 ；34:1437-1442.[0010]4.Vivien D，Buisson A.Serine protease inhibitors:Novel therapeutictargets for stroke?J Cereb Blood Flow Metab 2000 ；20:755-764.[0011]5.Lo EHiDalkara TiMoskowitz MA.Mechanisms,challenges and opportunitiesin stroke.Nat Rev Neurosci 2003 ；4:399-415.[0012]6.Nicole 0，Docagne F，AliC，et al.The proteolytic activity oftissue-plasminogen activator enhances nmda receptor-mediated signaling.Nat Med2001 ；7:59-64.[0013]7.Wang YF, Tsirka SE，Strickland S，et al.Tissue plasminogenactivator (tpa)increases neuronal damage after focal cerebral ischemia inwild-type and tpa-deficient mice.Nat Med 1998 ；4:228-231.[0014]8.Yepes M，Sandkvist M，Wong MK, et al.Neuroserpin reduces cerebralinfarct volume and protects neurons from ischemia-1nduced apoptosis.Blood2000 ；96:569-576.[0015]9.Wang X，Lee SR，Arai K，et al.Lipoprotein receptor-mediated inductionof matrix metalloproteinase by tissue plasminogen activator.Nat Med 2003 ；9:1313-1317.[0016]10.Morancho A，Rosell A，Garcia-Bonilla L，Montaner J.Metalloproteinaseand stroke infarct size:Role for ant1-1nflammatory treatment? Ann N Y AcadSci2010 ；1207:123-133.[0017]11.Cheng TiPetraglia AL,Li Z, et al.Activated protein c inhibits tissueplasminogen activator-1nduced brain hemorrhage.Nat Med 2006 ；12:1278-1285.[0018]12.Jian Liu K,Rosenberg GA.Matrix metalloproteinases and free radicalsin cerebral ischemia.Free Radic Biol Med 2005 ；39:71-80.[0019]13.An J，Zhang C，Polavarapu R，et al.Tissue-type plasminogen activatorand the low—density lipoprotein receptor—related protein induce aktphosphorylation in the ischemic brain.Blood 2008 ；112:2787-2794.[0020]14.Dijkhuizen RM, Asahi M，Wu 0，et al.Rapid breakdown of microvascular barriers and subsequent hemorrhagic transformation after delayed recombinanttissue plasminogen activator treatment in a rat embolic stroke model.Stroke2002 ；33:2100-2104.[0021]15.Neumann-Haefelin C，Brinker G，Uhlenkuken U，et al.Prediction ofhemorrhagic transformation after thrombolytic therapy of clot embolism:An mriinvestigation in rat brain.Stroke 2002 ；33:2100-2104.[0022]16.Kastrup A，Groschel K，Ringer TM，et al.Early disruption of theblood—brain barrier after thrombolytic therapy predicts hemorrhage in patientswith acute stroke.Stroke2008 ；39:2385-2387.[0023]17.Sadler JE.Von wi I lebrand factor，adamtsl3，and thromboticthrombocytopenic purpura.Blood 2008;112:11-18.[0024]18.Crawley JT, de Groot R，Xiang Y，et al.Unraveling the scissile bond:How adamtsl3recognizes and cleaves von willebrand factor.Blood 2011 ；118:3212-3221.[0025]19.Soejima K，Nakamura H，Hirashima M，et al.Analysis on the molecularspecies and concentration of circulating adamtsl3 in blood.J biochem 2006 ； 139:147-154.[0026]20.Dong JF, Moake JL, Nolasco L, et al.Adamts-13 rapidly cleaves newlysecreted ultralarge von willebrand factor multimers on the endothelial surfaceunder flowing conditions.Blood 2002;100:4033-4039.[0027]21.Yamamoto K，de Waard ViFearns C,Loskutoff DJ.Tissue distribution andregulationof murine von willebrand factor gene expression in viv0.Blood 1998 ；92:2791-2801.[0028]22.Bath PM，Blann A，Smith N，Butterworth RJ.Von willebrand factor,p-selectin and fibrinogen levels in patients with acute ischaemic andhaemorrhagic stroke，and their relationship with stroke sub-type and functionaloutcome.Platelets 1998 ；9:155-159.[0029]23.Vergouwen MD，Bakhtiari K，van Geloven N，et al.Reduced adamtsl3activity in delayed cerebral ischemia after aneurysmal subarachnoid hemorrhage.J Cereb Blood Flow Metab 2009 ；29:1734-1741.[0030]24.Federici AB, Berkowitz SD, Zimmerman TS, Mannucci PM.Proteolysisof von willebrand facto r after thrombolytic therapy in patients with acutemyocardial infarction.Blood 1992 ；79:38-44.[0031]25.Zhao BQ, Chauhan AK, Canault M，et al.Von willebrand factor-cleavingprotease adamtsl3 reduces ischemic brain injury in experimental stroke.Blood2009 ；114:3329-3334.[0032]26.Fujioka M，Hayakawa K，Mishima K，et al.Adamtsl3 gene deletionaggravates ischemic brain damage:A possible neuroprotective role of adamtsl3by ameliorating postischemic hypoperfusion.Blood 2010 ；115:1650-1653.[0033]27.Zhao BQ, Wang S，Kim HY, et al.Role of matrix metalloproteinases indelayed cortical responses after stroke.Nat med 2006 ；12:441-445.[0034]28.Su EJ, Fredriksson L, Geyer M，et al.Activation of pdgf-cc by tissueplasminogen activator impairs blood—brain barrier integrity during ischemicstroke.Nat Med2008 ；14:731-737.[0035]29.Won SJ, Tang XN, Suh SW, et al.Hyperglycemia promotes tissueplasminogen activator-1nduced hemorrhage by increasing superoxide production.Ann Neurol 2011；70:583-590.[0036]30.Zhao BQ, Ikeda Y，Ihara H，et al.Essential role of endogenous tissueplasminogen activator through matrix metalloproteinase 9 induction andexpression on heparin-produced cerebral hemorrhage after cerebral ischemia inmice.Blood2004 ；103:2610-2616.[0037]31.Yepes M， Sandkvist M， Moore EG， et al.Tissue-type plasminogenactivator induces opening of the blood-brain barrier via the Idlreceptor-related protein.J clin invest2003 ；112:1533-1540.[0038]32.Zhang ZG, Zhang L，Jiang Q，et al.Vegf enhances angiogenesis andpromotes blood-brain barrier leakage in the ischemic brain.J Clin Invest 2000 ；106:829-838.[0039]33.Abumiya T，Yokota C，Kuge Y，Minematsu K.Aggravation of hemorrhagictransformation by early intraarterial infusion of low—dose vascular endothelialgrowth factor after transient focal cerebral ischemia in rats.Brain Res 2005 ；1049:95-103.[0040]34.Kanazawa M，Igarashi H,Kawamura K，et al.1nhibition of vegf signalingpathway attenuates hemorrhage after tpa treatment.J Cereb Blood Flow Metab2011 ；31:1461-1474.[0041]35.Beck H，Acker T, Wiessner C，et al.Expression of angiopoietin-1，angiopoietin—2，and tie receptors after middle cerebral artery occlusion in therat.Am J Pathol2000 ；157:1473-1483.[0042]36.Kilic E，Kilic U，Wang Y，et al.The phosphatidyl inositol-3 kinase/akt pathway mediates vegf' s neuroprotective activity and induces blood brainbarrier permeability after focal cerebral ischemia.FASEB J 2006 ；20:1185-1187.[0043]37.Bryan BA，Dennstedt E，Mitchell DC，et al.Rhoa/rock signaling isessential for multiple aspects of vegf-mediated angiogenesis.FASEB J 2010 ;24:3186-3195.[0044]38.Yagita Y， Kitagawa K， Sasaki T， et al.Rho-kinase activation inendothelial cells contributes to expansion of infarction after focal cerebralischemia.J Neurosci Res2007 ；85:2460-2469.[0045]39.Kleinschnitz C，De Meyer SF, Schwarz T，et al.Deficiency of vonwillebrand factor protects mice from ischemic stroke.Blood 2009 ；113:3600-3603.[0046]40.Bergmeier W, Chauhan AK, Wagner DD.Glycoprotein ibalpha and vonwillebrand factor in primary platelet adhesion and thrombus formation:Lessonsfrom mutant mice.Thrombo Haemost.2008 ;99 (2):264-270.[0047]41.Nieswandt B,Stoll G.The smaller,the better:Vwf in stroke.Blood2010 ；115:1477-1478.[0048]42.Rodanskyl ES SJ, Fryer HJL, Greenfield RS, Rodgers GM.1nhibition of
endothelial cell tube formation by adamtsl3 occurs via interaction with vegf.Annual meeting of the American Society of Hematology.December 6,2010.SanDiego, USA.Abstract4307.[0049]43.Yamashita T，Kamiya T，Deguchi K，et al.Dissociation and protectionof the neurovascular unit after thrombolysis and reperfusion in ischemic ratbrain.J cereb blood flow metab 2009 ；29:715-725.[0050]44.Suzuki Y，Nagai N，Umemura K，et al.Stromelysin-1(mmp-3) is criticalfor intracranial bleeding after t-pa treatment of stroke in mice.J Thrombohaemost 2007 ；5:1732-1739.[0051]45.Hoang MViWhelan MC,Senger DR.Rho activity critically and selectivelyregulates endothelial cell organization during angiogenesis.Proc Natl Acad SciU S A2004 ；101:1874-1879.[0052]46.Miyagi Y，Carpenter RC，Meguro T，et al.Upregulation of rho a and rhokinase messenger rnas in the basilar artery of a rat model of subarachnoidhemorrhage.J Neurosurg 2000 ；93:471-476.[0053]47.Allen C，Srivastava K，Bayraktutan ILSmall gtpase rhoa and itseffector rho kinase mediate oxygen glucose deprivation-evoked in vitro cerebralbarrier dysfunction.Stroke 2010 ；41:2056-2063.[0054]48.Wang S，Lee SR，Guo SZ, et al.Reduction of tissue plasminogenactivator-1nduced matrix metalloproteinase-9 by simvastatin in astrocytes.Stroke 2006 ；37:1910-1912.。
【发明内容】
[0055]本发明的目的是提供重组ADAMTS13在制备脑出血药物中的用途，尤其是重组ADAMTS13在制备减少脑缺血后tPA溶栓治疗引起的脑出血药物中的用途。[0056]本发明经实验证实脑室内注射VWF引起非缺血小鼠血脑屏障通透性的快速增加，且还证实VWF裂解酶ADAMTS13可阻断脑缺血后tPA对脑血管的破坏作用，从而减少tPA溶栓诱发的脑出血。[0057]具体而言，本发明进行了包括以下步骤的实验:[0058](1)脑室内注射和脑血管通透性测定；[0059]( 2 )动物脑缺血模型；[0060](3)行为测定；[0061](4)脑出血的测量；[0062](5) Western 印迹实验；[0063](6)免疫组化；[0064](7)数据分析。[0065]结果显示，[0066](1)重组ADAMTS13阻断非缺血脑内tPA注射引起的血脑屏障通透性的增加[0067]首先证实正常小鼠侧脑室注射tPA可引起血脑屏障通透性的增加；然后使用非缺血小鼠，通过脑室注射VWF，然后静脉注射Evans blue，I小时后灌流取脑，定量检测脑中Evans blue的渗出量，结果显示，类似于注射tPA，VffF显著增加血脑屏障的通透性；然而，tPA和VWF联合注射引起血脑屏障通透性增加的程度与两者单独使用没有明显差异，表明tPA和VWF通过同一条通路影响血脑屏障的通透性；进一步，结果显示，侧脑室给予50ng或IOOng重组ADAMTS13都能显著减少注射tPA的小鼠脑内的Evans blue渗出量，而单独注射重组ADAMTS13对血脑屏障的通透性没有影响；
[0068](2)重组ADAMTS13抑制脑缺血后tPA对血脑屏障的破坏作用
[0069]采用小鼠45分钟局部脑缺血再灌注模型，检测了 ZO-1 (—种主要的紧密连接蛋白)和collagen IV(—种主要的血管基底膜蛋白)表达的变化，结果显示，脑缺血明显减少ZO-1的表达，适当减少collagen IV的表达；与PBS处理组相比，脑缺血两小时后静脉注射tPA导致ZO-1和collagen IV的明显减少；然而，脑缺血后3小时侧脑室给予重组ADAMTS13显著减轻tPA引起的ZO-1和collagene IV的降解；进一步,与对照组比较，tPA显著增加缺血脑半球Evans blue的渗出量；结果表明，注射重组ADAMTS13完全逆转tPA引起的小鼠血脑屏障通透性的改变，单用重组ADAMTS13对脑缺血后血脑屏障的通透性没有影响；
[0070](3)重组ADAMTS13对脑出血和神经功能的影响
[0071]通过分光光度计的定量测量，结果显示，脑缺血后2小时注入tPA导致24小时后的脑出血明显增加；脑缺血后3小时脑室内给予重组ADAMTS13抑制tPA诱导的脑出血；单独给予重组ADAMTS13对脑出血没有明显影响；
[0072]此外，神经功能评分表明，与PBS处理组的小鼠相比，tPA处理组小鼠表现出严重的神经功能缺失和运动功能的下降；而重组ADAMTS13+tPA组小鼠的神经功能评分和运动功能明显好于单独给予tP A的小鼠；
[0073](4)重组ADAMTS13降低tPA引起的血管内皮细胞中VEGF的表达
[0074]采用Western印迹实验，结果显示，与假手术组相比，脑缺血显著增加VEGF的表达(与以前的报道一致34);与给予PBS的脑缺血小鼠相比，给予tPA引起VEGF的表达进一步增加；
[0075]免疫组化染色结果显示，给予tPA引起VEGF在梗死周边区的血管内皮细胞中的表达显著增加；虽然在星形胶质细胞和神经元中也可观察到VEGF的表达，但不受tPA处理的影响；
[0076]Western印迹实验的结果表明，重组ADAMTS13显著抑制tPA引起的VEGF表达的增加，与该结果相一致，梗死周边区血管内皮细胞中tPA诱导的VEGF的免疫活性也显著降低；
[0077]测定脑组织中Ang-1和Ang_2的表达量,结果显示,Ang-1和Ang_2的表达在各处理组之间基本一致，表明Ang-1和Ang-2没有参与调节tPA诱导的脑出血；
[0078](5)重组ADAMTS13抑制tPA诱导的VEGF表达与RhoA和Akt通路有关
[0079]将小鼠分成脑缺血组和tPA处理组，静脉注射RhoA的抑制剂法舒地尔和Akt的抑制剂渥曼青霉素，结果显示，法舒地尔和渥曼青霉素均能抑制tPA诱导的VEGF表达的上调；
[0080]Western印迹实验结果表明，脑缺血明显增加RhoA的活性,并诱导Akt的磷酸化；当给予tPA后，上述作用被进一步扩大；相反，重组ADAMTS13显著抑制tPA诱导的RhoA激活和Akt的磷酸化?’总Akt的表达在各组之间没有检测到差异；
[0081]上述结果表明，重组ADAMTS13通过抑制RhoA的激活和Akt的磷酸化而起到干扰tPA-VEGF通路的作用。
[0082]本发明的实验结果显示，在缺血条件下tPA诱导产生的VEGF能被RhoA或Akt的特异性抑制剂所阻断，而重组ADAMTS13显著降低RhoA的激活和Akt的磷酸化，表明重组ADAMTS13对tPA诱导的VEGF表达的抑制通过RhoA和Akt通路实现。
[0083]本发明所述的重组ADAMTS13通过抑制RhoA和Akt介导的脑血管通透性增加，减轻tPA对血脑屏障的损害从而减少其引起的脑出血，因此，联合使用重组ADAMTS13和tPA是增加溶栓安全性的一种新型对策和手段。
【专利附图】
【附图说明】
[0084]图1显示了在非缺血条件下，重组ADAMTS13抑制tPA引起的血脑屏障通透性的增加，其中，
[0085]A:侧脑室注射PBS, tPA, VffF或tPA加VWF后，静脉注射Evans blue I小时后脑内Evans blue渗出量的测定值；
[0086]B:静脉注射 PBS，tPA，tPA 与 50 或 IOOng 重组 ADAMTS13 联合注射，重组 ADAMTS13单独注射后，静脉注射Evans blue I小时后脑内Evans blue渗出量的测定值；
[0087]数值采用均数+标准差，每组η=7-8，*Ρ〈0.05。
[0088]图2显示了重组ADAMTS13抑制脑缺血后tPA诱导的血脑屏障破裂，其中，
[0089]AX:脑缺血24小时，假手术组及对照组，tPA给药组，tPA+重组ADAMTS13给药组，ZO-1和collagen IV的代表性免疫印迹照片；
[0090]B、D:各处理组的ZO-1和collagen IV的定量测定；值采用均数+标准差，假手术组 n=4，其它各组 n=6，*P<0.05 ；
[0091]E:脑缺血24小时，对照组，tPA给药组，tPA+重组ADAMTS13给药组以及重组ADAMTS13单独给药组的Evans blue渗出的代表性图；
[0092]F:各处理组的Evans blue渗出的定量分析；值采用均数+标准差，每组n=7,*Ρ〈0.05。
[0093]图3显示了重组ADAMTS13对脑出血和脑缺血后神经功能的影响，其中，
[0094]A:代表性的脑背侧面和冠状切片显示脑缺血24小时的脑出血情况，图片分别来自于对照组，tPA给药组，tPA+重组ADAMTS13给药组以及重组ADAMTS13单独给药组的小鼠；箭头所指的是给予tPA的小鼠脑缺血区的大面积出血；
[0095]B:用分光光度计对脑出血定量检测的结果；值采用均数+标准差，每组n=8，*P〈0.05。(C)神经功能评分和(D)脑缺血24小时，对照组，tPA给药组，tPA+重组ADAMTS13给药组以及重组ADAMTS13单独给药组小鼠的运动行为；值采用均数+标准差，每组n=8，*Ρ〈0.05。
[0096]图4显示了重组ADAMTS13降低tPA诱导的血管内皮细胞中的VEGF表达，其中，
[0097]A:脑缺血24小时，假手术组小鼠，对照组，tPA给药组，tPA+重组ADAMTS13给药组以及重组ADAMTS13单独给药组的VEGF表达的代表性免疫印迹图片；
[0098]B:各处理组的VEGF表达的定量测定结果；值采用均数+标准差，假手术组n=4，其它各组 η=6，*Ρ〈0.05 ；
[0099]C:脑缺血24 小时，给予tPA组或tPA+重组ADAMTS13组小鼠梗死周边区VEGF(暗)和内皮细胞(⑶31，亮)免疫组化的共聚焦图片；星号指示血管腔；标尺:15μπι ;
[0100]D、E:脑缺血24小时，假手术组小鼠，对照组，tPA给药组，tPA+重组ADAMTS13给药组Ang-1和Ang-2表达的有代表性免疫印迹图片；
[0101]F、G:各组Ang-1和Ang_2表达的定量测定结果；值采用均数+标准差，各组n=6，*Ρ〈0.05。
[0102]图5显示了重组ADAMTS13抑制tPA诱导的VEGF表达与RhoA和Akt通路有关，其中，
[0103]A、C:脑缺血24小时，给予tPA组，tPA+渥曼青霉素或法舒地尔组的小鼠缺血侧脑中VEGF表达的代表性免疫印迹图片；
[0104]B、D:各组VEGF表达的定量测定结果；值采用均数+标准差，每组组n=5，*P〈0.05 ；
[0105]E、F:脑缺血24小时，假手术组小鼠，对照组，tPA给药组，tPA+重组ADAMTS13给药组磷酸化Akt，总Akt和RhoA代表性的免疫印迹图片；
[0106]G、H:各组磷酸化Akt和RhoA的定量测定结果；值采用均数+标准差，假手术组n=4，其它各组 n=6，*P<0.05。
具体实施例
[0107]实施例1
[0108]1、材料和方法
[0109](I)试剂和抗体
[0110]Evans blue, Drabkin,多聚甲醒，D-葡萄糖，甲酰胺，渥曼青霉素(购买于 Sigma-Aldrich) (St Louis, MO,美国)，人重组 tPA(爱通立)购自 BoehringerIngelheim (Mannheim, Germany),人 VffF 蛋白购买自 Haematologic Tecnologies (EssexJunction, VT,美国)，人重组 ADAMTS13 购买自 R&D systems (neapolis, MN,美国)，法舒地尔购买自 Calbiochem (San Diego, CA,美国)。一抗包括 rabbit ant1-zonulaoccludens (ZO-1) (Invitrogen, CamariIΙο,CA,美国),rabbit ant1-collagenIV (Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz, CA,美国),rabbit ant1-VEGF(血管内皮生长因子)(Abeam, MA,美国)，goat ant1-Angiopoietin(Ang)-1(SantaCruzBiotechnology, Santa Cruz,CA,美国),goat ant1-Ang-2(Santa CruzBiotechnology,Santa Cruz,CA,美国),rabbit ant1-phospho-Akt (serine 473)(Cell Signaling Tecnology, Beverly, MA,美国),rabbit ant1-Akt (Cell SignalingTechnology, Beverly, MA,美国)，rabbit ant1-RhoA(Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, CA,美国)rat anti_CD31(PECAM-1, BD Pargen, San Diego, CA,美国)，rabbitant1- β -actin (Cell Signaling technology, Beverly, MA,美国).二抗包括:Alexa Fluor594donkey ant1-rabbit immunoglobulin G(IgG), Alexa Fluor 488 donkey ant1-ratIgG(Invitrogen, Camarillo, CA,美国)。
[0111]( 2)脑室内注射和脑血管通透性测定
[0112]所有实验经过复旦大学上海医学院动物关爱和使用委员会核准。本发明采用雄性成年C57小鼠(上海斯莱克实验动物有限公司提供，上海，中国)。
[0113]将小鼠置于立体定位仪(NarisigeScientific Instrument Laboratory,东京，日本)，用含1-1.5%异氟烷、30%氧气的混合气体持续麻醉，在如下坐标:前囟后0.2mm,旁开 1.0mm，腹侧深度 3mm，颅内分别注射 3 μ I PBS、tPA (585ng)、VWF(540ng)、tPA 和 VWF、tPA和重组ADAMTS13(50或IOOng)或者重组ADAMTS13 (IOOng)，注射时间为15分钟；然后，静脉注射Evans blue dye (4%，溶于PBS，4ml/kg)，60分钟后小鼠经心脏灌流PBS，脑组织置于甲酰胺溶液中浸泡72小时；采用分光光度计(Thermo BioMate 3S, Thermo Scientific,美国)在620nm波长处测量脑组织中Evans blue的外渗量。
[0114](3)动物脑缺血模型
[0115]脑缺血模型(MCAO)按照现有技术的方法制作25’27，即雄性小鼠用含1-1.5%异氟烷、30%氧气、70%氮气的混合气体麻醉后，经右侧颈内动脉插入经硅胶包裹末端的7.0尼龙栓线阻断大脑中动脉；缺血45分钟后退出栓线实施再灌注；使用加热板(World PrecisionInstruments, Sarasota, FL,美国)维持小鼠体温在37±0.5°C ;通过激光多普勒血流仪(Perimed, Stockholm,瑞典)确认大脑中动脉的栓塞与再灌注情况；为增加脑出血量，脑缺血15分钟后给予小鼠腹腔注射50%D-葡萄糖(6ml/kg)28’29 ;脑缺血后2小时，用微量进样泵(World Precision Instruments, Sarasota, FL,美国)静脉注入 lmg/kg(bolus)tPA(lOmg/kg)或PBS,剩余的9mg/kg经30分钟缓慢注入；重组ADAMTS13 (IOOng溶于3 μ I PBS)或PBS在脑缺血后3小时经右脑侧脑室给予；渥曼青霉素(15μ g/kg溶于100μ I含1% 二甲基亚砜[DMS0]的生理盐水中)或含1% 二甲基亚砜的生理盐水在脑缺血之前经静脉注射；法舒地尔(10mg/kg溶于100 μ I生理盐水)或生理盐水在脑缺血后30分钟由静脉注射；小鼠脑缺血后23小时，由静脉注射2%的Evans blue (2ml/kg);缺血侧脑半球的Evans blue外渗量按前文叙述的方法测量。
[0116](4)行为测定
[0117]脑缺血后24小时，采用双盲法对小鼠神经功能损伤进行评分:
[0118]O分，无神经功能损伤；
[0119]I分，不能完全伸展左侧前爪；
[0120]2分，对推力的抵抗力减弱；
[0121]3分，自发性地向左转圈；
[0122]4分，自主活动缺失或无意识。
[0123]在运动行为测试中，将小鼠放入27.3X27.3 X 40cm的测试箱内(MedAssociates,美国)，通过红外摄像头自动记录小鼠在30分钟内行进的距离,采用S0D-811分析软件(Med Associates Inc., St Alban’s, VT,美国)分析数据。
[0124](5)脑出血的测量
[0125]缺血后24小时，给小鼠注射过量水合氯醛，用PBS进行心脏灌流；收集缺血侧脑组织，加入500 μ I Drabkin溶液、匀浆、4°C 13000rpm离心30分钟；收集上清液，用分光光度计(Thermo BioMate 3S, Thermo Scientific,美国)在540nm波长测量其光密度值；采用小鼠同源的血液制作标准曲线，按标准曲线计算出光密度值对应的出血量25，30。
[0126](6) Western 印迹实验
[0127]将缺血侧脑组织和假手术组相对应的 脑组织经裂解液裂解；将脑组织在含有蛋白酶抑制剂cocktails的RIPA裂解液(Millipore, Billerica, MA,美国)中匀浆、离心后，用BCA蛋白测定法(Thermo BioMate 3S, Thermo Scientific,美国)检测蛋白浓度；等量的蛋白样品分别经8%、10%或12%的Tris-甘氨酸凝胶电泳后，转移到PVDF膜上；使用IXTBST的5%脱脂牛奶室温封闭I小时，一抗4°C孵育过夜，经漂洗后加二抗室温孵育I小时；化学发光剂(MiIlipore, Billerica, MA,美国)处理后，用 Bio-1mage 测定系统(Bio-Rad,美国)进行扫描和定量分析；使用β -actin作为内参。
[0128](7)免疫组化
[0129]脑缺血后24小时，将小鼠用过量的水合氯醛深麻，然后依次用PBS和4%的多聚甲醛溶液灌流、取脑；脑组织经30%蔗糖脱水；脑冠状切片(20 μ m)用含1%的牛血清蛋白和5%正常驴血清的PBS封闭液封闭，用兔抗VEGF和大鼠抗CD31的抗体混合液4°C孵育过夜；将切片漂洗后，用Alexa Fluor 594驴抗兔IgG和Alexa Fluor 488驴抗大鼠Ig的混合物孵育；使用Olympus FVlOOO共聚焦显微镜获得图像，FVlO-ASW软件进行图像处理。
[0130](8)数据分析
[0131]数据用平均值土SD表示，采用单因素方差分析后经Boneferroni多组比较进行统计分析；采用Kruskal - Wallis test分析后经Dunn多组比较进行行为学数据的统计分析；两组比较时，采用未配对双尾Student t检验。P〈0.05视为有统计学差异。
[0132]2、结果
[0133](I)重组ADAMTS13阻断非缺血脑内tPA注射引起的血脑屏障通透性的增加
[0134]首先证实正常小鼠侧脑室注射tPA可引起血脑屏障通透性的增加(如图1A所示)28，31 ;为了检测VWF是否也能够诱导血脑屏障通透性的增加，使用非缺血小鼠，通过脑室注射VWF，然后静脉注射Evans blue, I小时后灌流取脑，定量检测脑中Evans blue的渗出量；结果显示，类似于注射tPA，VWF显著增加血脑屏障的通透性(如图1A所示)；然而，tPA和VWF联合注射引起血脑屏障通透性增加的程度与两者单独使用没有明显差异，表明tPA和VWF通过同一条通路影响血脑屏障的通透性；进一步研究VWF裂解酶ADAMTS13能否抑制tPA所引起的血脑屏障破坏,结果显示,侧脑室给予50ng或IOOng重组ADAMTS13都能显著减少注射tPA的小鼠脑内的Evans blue渗出量(如图1B所示);由于IOOng的重组ADAMTS13更有效，在后续的实验中使用IOOng的重组ADAMTS13 ;单独注射重组ADAMTS13对血脑屏障的通透性没有影响。
[0135](2)重组ADAMTS13抑制脑缺血后tPA对血脑屏障的破坏作用
[0136]采用小鼠45分钟局部脑缺血再灌注模型，检测了 ZO-1 (—种主要的紧密连接蛋白)和collagen IV(—种主要的血管基底膜蛋白)表达的变化，结果显示，脑缺血明显减少Z0-1的表达(如图2A和B所示)，适当减少collagen IV的表达(如图2C和D所示)；与PBS处理组相比，脑缺血两小时后静脉注射tPA导致Z0-1 (如图2A和B所示)和collagenIV(如图2C和D所示)的明显减少；然而，脑缺血后3小时侧脑室给予重组ADAMTS13显著减轻tPA引起的Z0-1和collagene IV的降解；结果还显示,与对照组比较，tPA显著增加缺血脑半球Evans blue的渗出量(如图2E和F所示)，注射重组ADAMTS13完全逆转tPA引起的小鼠血脑屏障通透性的改变(如图2E和F所示)；而单用重组ADAMTS13对脑缺血后血脑屏障的通透性没有影响。
[0137](3)重组ADAMTS13对脑出血和神经功能的影响
[0138]通过分光光度计的定量测量，结果显示，脑缺血后2小时注入tPA导致24小时后的脑出血明显增加(如图3A和B所示)，脑缺血后3小时脑室内给予重组ADAMTS13抑制tPA诱导的脑出血(如图3A和B所示)；单独给予重组ADAMTS13对脑出血没有明显影响。
[0139]此外，神经功能评分表明，与PBS处理组的小鼠相比，tPA处理组小鼠表现出严重的神经功能缺失和运动功能的下降；重组ADAMTS13+tPA组小鼠的神经功能评分和运动功能明显好于单独给予tPA的小鼠。
[0140](4)重组ADAMTS13降低tPA引起的血管内皮细胞中VEGF的表达
[0141]Western印迹实验的结果显示，与假手术组相比，脑缺血显著增加VEGF的表达，该结果与以前的报道一致34 ;与给予PBS的脑缺血小鼠相比，给予tPA引起VEGF的表达进一步增加(如图4A和B所示)；
[0142]免疫组化染色结果显示，给予tPA引起VEGF在梗死周边区的血管内皮细胞中的表达显著增加(如图4C所示);虽然在星形胶质细胞和神经元中也可观察到VEGF的表达，但不受tPA处理的影响(数据未显示)。
[0143]由于上述结果表明重组ADAMTS13抑制tPA诱导的脑出血，本实验还检测了重组ADAMTS13是否能够减少tPA诱导的VEGF表达的升高，Western印迹实验的结果表明，重组ADAMTS13显著抑制tPA引起的VEGF表达的增加(如图4A和B所示)，与上述结果相一致，梗死周边区血管内皮细胞中tPA诱导的VEGF的免疫活性也显著降低(如图4C所示)。
[0144]现有文献报道a ngiopoietin (Ang)-1和Ang_2调节缺血后脑血管的通透性35,因此本实验测定了脑组织中Ang-1和Ang-2的表达量,结果显示,Ang-1和Ang-2的表达在各处理组之间基本一致，表明Ang-1和Ang-2没有参与调节tPA诱导的脑出血。
[0145](5)重组ADAMTS13抑制tPA诱导的VEGF表达与RhoA和Akt通路有关
[0146]VEGF受RhoA和Akt通路调节36’37，且RhoA和Akt都参与调节脑缺血后血脑屏障的功能13’38 ;为检测上述因子是否对tPA诱导的VEGF上调有影响，本实施例将小鼠分成脑缺血组和tPA处理组，静脉注射RhoA的抑制剂法舒地尔和Akt的抑制剂渥曼青霉素，结果显示，法舒地尔和渥曼青霉素均能抑制tPA诱导的VEGF表达的上调；
[0147]本实施例还测定了重组ADAMTS13是否能够抑制tPA诱导的RhoA激活和Akt的磷酸化，Western印迹实验的结果表明，脑缺血明显增加RhoA的活性(如图5E和F所示)，并诱导Akt的磷酸化(如图5G和H所示)；当给予tPA后，上述作用被进一步扩大，相反，重组ADAMTS13显著抑制tPA诱导的RhoA激活(如图5E和F所示)和Akt的磷酸化(图5G和H所示);总Akt的表达在各组之间没有检测到差异；
[0148]上述结果表明，重组ADAMTS13通过抑制RhoA的激活和Akt的磷酸化而起到干扰tPA-VEGF通路的作用。
【权利要求】
1.重组ADAMTS13在制备治疗脑出血药物中的用途。
2.重组ADAMTS13在制备减少脑缺血后tPA溶栓治疗引起的脑出血药物中的用途。
3.按权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述重组ADAMTS13通过RhoA和Akt通路实现对tPA诱导的VEGF表达的抑制。
4.按权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述重组ADAMTS13显著降低RhoA的激活和Akt的磷酸化。
5.按权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述重组ADAMTS13通过抑制RhoA和Akt介导的脑血管通透性增加，减轻tPA对血脑屏障的损害从而减少其引起的脑出血。
【文档编号】A61P9/10GK103566362SQ201210256097
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年7月21日 优先权日:2012年7月21日
【发明者】范文英, 赵冰樵, 王丽香 申请人:复旦大学