专利名称：一种高强度连续梯度复合支架及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物医学材料及其制备领域，具体涉及用于骨软骨缺损修复的高強度连续梯度复合支架及其制备方法。
背景技术：
天然骨软骨为软骨层、钙化层和软骨下骨层的多层次结构，采用骨软骨组织工程的方法修复骨软骨缺损经历了单层支架、双层支架和三层支架三个阶段。单层支架的设计仅考虑到上层的软骨层，忽略了下层的骨层，难以满足天然骨软骨的结构要求，因此，构建双层支架修复骨软骨缺损成为必然。双层支架考虑到仿生模拟上层的软骨结构和下层的骨结构，在治疗骨软骨缺损方面取得了一定的疗效，但忽略了中间层ー I丐化层，双层支架缺少了钙化层这一中间层，很容易使软骨和软骨下骨分层，甚至使软骨从软骨下骨的骨面脱落， 严重影响治疗效果。为了进一步完善支架的设计，研究者随即开始了三层支架的研究，三层支架更精确的模拟了软骨层-钙化层-软骨下骨层的结构，向生物仿生的方向又迈进了一
止/J/ o双层支架和三层支架的构建方法相似，各层支架分别制备，随后采用胶粘、縫合等方式结合在一起。由干支架层间存在物理界面的缺陷，支架不是ー个连续的整体，难以承受关节运动时所产生的较大负荷，易使支架层间产生裂纹、剥落，进而影响支架的整体力学性能和界面的生物功能，最終影响支架与周围宿主组织之间的融合。因此，如何从根本上克服层间存在的界面问题是当今多层支架面临的共同问题。聚こ烯醇(PVA)水凝胶具有与关节软骨相似的力学性能。羟基磷灰石(HAP)是骨组织中的主要无机成分，具有良好的骨传导性和生物活性，能够与骨组织形成骨键合，被广泛应用于骨软骨和骨修复。与羟基磷灰石(HAP)相比，纳米羟基磷灰石(nHAP)具有溶解度较高、表面能较大、吸附性更强、断裂韧性和力学性能增强以及更佳的成骨活性等优点。公开号为CN 101020083A的中国发明专利申请公开了ー种具有仿生功能界面骨软骨复合组织一体化工程支架，从上至下由软骨层、钙化层和软骨下骨层组成，软骨层由11型胶原和壳聚糖组成，II型胶原/壳聚糖以共价键形式连接，钙化层由II型胶原和羟基磷灰石组成，II型胶原/羟基磷灰石以共价键形式连接，软骨下骨层由I型胶原和羟基磷灰石组成，I型胶原/羟基磷灰石以共价键形式连接，在软骨层和软骨下骨层内都设置有ー个以上的空隙，空隙的孔径为100 u nT500 u m,虽然该技术方案中软骨层材料具有较好的生物相容性，软骨下骨层中羟基磷灰石可以具有较好的机械强度，钙化层的材料加强了组织间的连接强度，但是II型胶原、壳聚糖、I型胶原均没有较好的力学性能，单纯地依靠羟基磷灰石以及层中组分的相应设置来増加力学強度，其仿生功能界面骨软骨复合组织一体化工程支架仍然会存在强度不佳的缺点。
发明内容
本发明提供了一种高强度连续梯度复合支架，解决了传统多层支架的界面缺陷问题，能够在保持支架具备力学性能和生物功能的同时，更好地满足骨软骨天然结构的多层次要求。—种高强度连续梯度复合支架，由水凝胶和磁性复合纳米粒子组成，其中，所述的磁性复合纳米粒子在所述高强度连续梯度复合支架的顶部和底部的重量百分含量分别为0%和89Γ70%，所述的磁性复合纳米粒子的重量百分含量从所述高强度连续梯度复合支架的顶部至底部逐渐增多形成连续梯度分布；所述的水凝胶为聚乙烯醇的水凝胶或者聚乙烯醇与天然材料两者的水凝胶；所述的磁性复合纳米粒子为纳米羟基磷灰石/铁的氧化物的磁性复合纳米粒子(m-nHAP)o所述的铁的氧化物为三氧化二铁(即氧化铁)或四氧化三铁。
当磁性复合纳米粒子在高强度连续梯度复合支架的底部的重量百分含量小于8%时，骨中的成骨细胞的粘附和增殖会明显降低，不利于成骨细胞的生长，当磁性复合纳米粒子在高强度连续梯度复合支架的底部的重量百分含量大于70%时，高强度连续梯度复合支架的压缩强度会明显下降，孔径过大，不利于成骨细胞的生长。所述高强度连续梯度复合支架的顶部是指距离其顶面小于等于其高度15%的部分，所述高强度连续梯度复合支架的底部是指距离其底面小于等于其高度15%的部分。作为优选，所述的天然材料为I型胶原(Col I)、II型胶原(Col II)、明胶(Gelatin)等中的一种或两种以上。本发明高强度连续梯度复合支架从另一个角度出发，跳出了多层支架传统的构建思路，使磁性复合纳米粒子在本发明高强度连续梯度复合支架内部形成连续梯度分布的结构。聚乙烯醇力学性能较佳，天然材料具有较好的生物相容性以及促软骨活性，所述的磁性复合纳米粒子由具有较佳成骨活性的纳米羟基磷灰石(nHAP)与具有较好生物相容性和生物安全性的铁的氧化物(三氧化二铁或四氧化三铁)复合形成。本发明高强度连续梯度复合支架以力学性能较好的聚乙烯醇为支架材料，同时引入具有连续梯度分布的磁性复合纳米粒子共同构建骨软骨组织工程支架，使得本发明高强度连续梯度复合支架在保持支架具备力学性能和生物功能的同时，更好的满足了骨软骨天然结构(软骨层-钙化层-软骨下骨层)的多层次要求。作为优选，所述的高强度连续梯度复合支架上有孔径为I μ m 50 μ m的孔，合适的孔径适合细胞生长，所述的高强度连续梯度复合支架的吸水率为50% 90%。本发明高强度连续梯度复合支架中，由上至下，磁性复合纳米粒子从无到有，由少增多，形成连续梯度分布，其余为水凝胶，作为优选，所述的磁性复合纳米粒子在所述高强度连续梯度复合支架的顶部和底部的重量百分含量分别为0%和35°/Γ70%，能够具有较佳的力学性能和孔径，并且非常有利于成骨细胞的生长，在满足了骨软骨天然结构的多层次要求下，使得本发明高强度连续梯度复合支架具有高强度的力学性能。本发明还提供了一种高强度连续梯度复合支架的制备方法，避免了多层支架的传统构建方法导致的界面缺陷问题，采用磁场诱导的方法使纳米羟基磷灰石/铁的氧化物的磁性复合纳米粒子在本发明高强度连续梯度复合支架内部形成连续的梯度分布。一种高强度连续梯度复合支架的制备方法，包括以下步骤I)将聚乙烯醇或者聚乙烯醇与天然材料溶解于水中，得到聚合物溶液；
2)将纳米羟基磷灰石/铁的氧化物(三氧化ニ铁或四氧化三铁)的磁性复合纳米粒子分散在水中，经超声分散得到磁性复合纳米粒子悬浮液；3)将步骤I)中的聚合物溶液和步骤2)中的磁性复合纳米粒子悬浮液混合均匀，得到混合液，将混合液注入模具，在凝胶化以前通过磁场诱导方法将混合液中的纳米羟基磷灰石/铁的氧化物的磁性复合纳米粒子呈连续梯度分布，之后采用循环冷冻解冻的方法使混合液凝胶化，得到高強度连续梯度复合支架。步骤I)中，作为优选，所述的聚合物溶液中聚こ烯醇的重量百分含量为2% 10%，能够有效提高高強度连续梯度复合支架的力学 強度。天然材料的添加量为少量。步骤2)中，纳米羟基磷灰石/铁的氧化物的磁性复合纳米粒子(m-nHAP)可參照现有公开文献“开发钌-羟基磷灰石封装的Y-Fe2O3的纳米晶作为ー种有效的分子氧氧化催化剂”制备([l]Mori K，Kanai S，Hara T, Mizugaki T, Ebitani K, Jitsukawa K，etal. Development of ruthenium-hydroxyapatite-encapsulated superparamagneticgamma-Fe203 nanocrystallites as an efficient oxidation catalyst by molecularoxygen. Chem Mater. 2007; 19:1249-56.),可以通过反应温度的方式，将铁的氧化物控制为三氧化ニ铁或四氧化三鉄，得到纳米羟基磷灰石/三氧化ニ铁的磁性复合纳米粒子(Y-Fe2O3AiHAP)或者纳米羟基磷灰石/四氧化三铁的磁性复合纳米粒子(Fe304/nHAP)。作为优选，所述的磁性复合纳米粒子悬浮液中纳米羟基磷灰石/铁的氧化物的磁性复合纳米粒子的重量百分含量为39T8%，从而非常有利于纳米羟基磷灰石/铁的氧化物的磁性复合纳米粒子呈连续梯度分布。步骤3)中，所述的聚合物溶液与磁性复合纳米粒子悬浮液的质量比为0. r4. 5
Io步骤3)中，所述的磁场诱导方法为在磁场强度600(Tl0000高斯的磁场下诱导0. Ih 240h，可以有效控制梯度水凝胶呈梯度的程度。所述的循环冷冻解冻的方法中，冷冻的温度为_40°C _5°C，冷冻的时间为2h 24h，解冻的温度为4°C 37°C，解冻的时间为2h 24h，循环冷冻解冻的次数为2次 15次，形成凝胶化的同时从而可以提高本发明高強度连续梯度复合支架的力学強度。经循环冷冻解冻即可形成孔，孔径为I U m 50 ii m。与现有技术相比，本发明具有如下优点本发明高強度连续梯度复合支架跳出了多层支架传统的构建思路，使磁性复合纳米粒子在本发明高强度连续梯度复合支架内部形成连续梯度分布的结构。本发明高强度连续梯度复合支架以力学性能较好的聚こ烯醇为支架材料，同时引入具有连续梯度分布的磁性复合纳米粒子共同构建骨软骨组织工程支架，使得本发明高強度连续梯度复合支架在保持支架具备力学性能和生物功能的同时，更好的满足了骨软骨天然结构(软骨层-钙化层-软骨下骨层)的多层次要求。本发明高强度连续梯度复合支架的制备方法，该方法与多层支架的传统构建方法不同，避免了多层支架的传统构建方法导致的界面缺陷问题，采用磁场诱导的方法使纳米羟基磷灰石/铁的氧化物的磁性复合纳米粒子在本发明高強度连续梯度复合支架内部形成连续的梯度分布，其易于实施和控制，有利于エ业化生产，并具有广阔的应用前景。
图I为实施例I制备的聚乙烯醇水凝胶支架和高强度连续梯度复合支架的压缩强度对比图；图2为实施例I制备的高强度连续梯度复合支架中纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子梯度分布曲线图。
具体实施例方式以下通过具体实施例对本发明作进一步阐释。实施例中的聚乙烯醇简写为PVA，I型胶原简写为Col I，II型胶原简写为Col II，明胶简写为Gel，纳米羟基磷灰石/铁的氧化物的磁性复合纳米粒子简写为m-nHAP，m-nHAP为Y -Fe2O3AiHAP或者Fe3O4AiHAP，纳米羟基磷灰石简写为nHAP。
制备例IY -Fe2O3MiAP纳米粒子的制备采用N2吹泡的方法将30ml去离子水中溶解的氧气去除，然后将I. 85mmol FeCl2 · 4H20和3. 7mmol FeCl3 · 6H20加入上述无氧的去离子水中至其完全溶解，形成铁盐水溶液，将铁盐水溶液加入至IOml NH4OH中，90°C水浴并持续磁力搅拌300r/min，lh后生成部分为Y-Fe2O3纳米粒子的原溶液。在部分为Y-Fe2O3纳米粒子的原溶液中，先后加入 33. 7mmol Ca(NO3)2 · 4H20 (调 pH=ll)和 20mmol (NH4)2HPO4 (调PH=II )，90°C水浴并持续磁力搅拌300r/min，2h后，再经室温陈化72h得到纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子溶液。将磁铁放在盛有纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子溶液的烧杯的底部，利用磁场将Y -Fe2O3AiHAP吸于杯底，将含有未与Y -Fe2O3反应的nHAP的上清液倾倒，并用去离子水将Y -Fe2O3AiHAP多次洗涤至中性，得到纯m-nHAP。制备例2Fe3O4AiHAP纳米粒子的制备采用N2吹泡的方法将30ml去离子水中溶解的氧气去除，然后将I. 85mmol FeCl2 · 4H20和3. 7mmol FeCl3 · 6H20加入上述无氧的去离子水中至其完全溶解，形成铁盐水溶液，将铁盐水溶液加入至IOml NH4OH中，在常温25°C下磁力搅拌300r/min，Ih后生成Fe3O4纳米粒子原溶液。在Fe3O4纳米粒子原溶液中，先后加入33. 7mmol Ca(NO3)2 · 4H20 (调 pH=ll)和 20mmoI (NH4)2HPO4 (调 pH=ll)，在常温 25°C下磁力搅拌300r/min，2h后，再经室温陈化24h得到纳米羟基磷灰石/四氧化三铁的磁性复合纳米粒子(Fe3O4AiHAP)溶液。将磁铁放在盛有纳米羟基磷灰石/四氧化三铁的磁性复合纳米粒子溶液的烧杯的底部，利用磁场将Fe3O4AiHAP吸于杯底，将含有未反应的nHAP的上清液倾倒，并用去离子水将Fe3O4AiHAP多次洗涤至中性，得到纯m-nHAP。实施例II)将3. Og PVA (聚合度1750±50，国药集团化学试剂上海有限公司)溶解于29. 7g去离子水中，加热使之溶解，得到32. 7g的聚合物溶液；2)将制备例I制备的12g纯m-nHAP分散在294. 3g的去离子水中，经超声分散得到306. 3g的磁性复合纳米粒子悬浮液；3)将步骤I)中的聚合物溶液和步骤2)中的磁性复合纳米粒子悬浮液混合均匀，得到混合液，将混合液注入模具，在凝胶化以前通过磁场强度为8000高斯的磁场诱导96h将混合液中的m-nHAP呈连续梯度分布，之后采用循环冷冻解冻的方法使混合液凝胶化，循环冷冻解冻的方法中，冷冻温度为-30°C，冷冻时间为15h，解冻温度为25°C，解冻时间为15h，循环冷冻解冻(即循环冻融)的次数为6次，混合液凝胶化后得到高强度连续梯度复合支架，该高强度连续梯度复合支架为圆柱形，直径为8mm，高度为7mm。高强度连续梯度复合支架上有孔径为10μπΓ30μπι的孔，吸水率为86%，压缩强度为15. 0±1. 7MPa。将步骤I)制备的聚合物溶液直接经步骤3)中的循环冷冻解冻的方法使其凝胶化，制得聚乙烯醇水凝胶支架，用作对比。将本实施例制备的聚乙烯醇水凝胶支架和高强度连续梯度复合支架用型号为Instron5567万能材料试验机测试其压缩强度，压缩速度为lmm/min，最大压缩形变为98%，压缩强度结果如图I所示。其他实施例的测试压缩强度的方法同上。将本实施例的高强度连续梯度复合支架用热失重(TGA)的方法测试在不同高度下测试其组成，具体方法采用梅特勒TGA/DSC1仪器，25°C 800°C，加热速率20°C /min。将圆柱形高强度连续梯度复合支架沿其轴向平均分成7份测试样品，每份测试样品大小直 径为8mm、高度为1mm，每份测试样品在梅特勒TGA/DSC1仪器中煅烧，PVA被烧掉，只剩下m-nHAP的质量，不同测试样品中m-nHAP的质量与每份测试样品的总质量之百分比如图2所示。如图2所示，高强度连续梯度复合支架整体上由水凝胶和纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子组成，纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子在高强度连续梯度复合支架的顶部和底部的重量百分含量分别为0%和65%，纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子的重量百分含量从该高强度连续梯度复合支架的顶部至底部逐渐增多形成连续梯度分布，具体详见图2。其他实施例在不同高度下测试其组成的方法同上。成骨细胞在高强度连续梯度复合支架上生长行为的定量评价方法成骨细胞采用hFOBl. 19人SV40转染成骨细胞，购自中国科学院细胞库，从37°C、5%C02的孵箱中取出铺满成骨细胞的培养瓶，吸出旧培养液，PBS缓冲液清洗2次，加入O. 25%胰酶(Gibco)后，在37°C、5%C02的孵箱中作用4min，倒置光学显微镜下观察，见大部分(约80%)细胞开始回缩成球形，立即加入适量的全液[全液由重量百分含量89%DMEM nutrientmix F12培养基(Gibco)、10%胎牛血清(Gibco)以及1%青霉素-链霉素(Gibco)组成]终止消化，吹打使细胞分散均匀，细胞记数板记数(细胞密度I. O X IO5个/ml)后，将2ml细胞悬液(第8代)接种于24孔板中的高强度连续梯度复合支架上(直径8mm，厚度7mm)随后将样品放在37°C、5%C02的孵箱中培养7天后，将样品换到新的24孔细胞培养板中，每孔加2ml全液，再加200 μ I CCK-8液(C008-3，上海七海复泰生物科技有限公司)，在37°C、5%C02的孵箱中孵化6h至溶液染色变深，每孔中取200 μ I反应液于96孔培养板中，450nm波长下用酶标仪(MDSpectra Max 190)测溶液的吸光度(0D)。实施例I制备的聚乙烯醇水凝胶支架的吸光度值为O. 49±0. 04，实施例I制备的高强度连续梯度复合支架的吸光度值为1.62±0.03。其他实施例的高强度连续梯度复合支架的吸光度值评价方法同上。实施例2I)将I. Og PVA (聚合度1750±50，国药集团化学试剂上海有限公司)溶解于9. 9g去离子水中，加热使之溶解，得到Al溶液，再将O. 5g Col I溶解于24. 5g去离子水中得到A2溶液，将Al溶液和A2溶液混合，得到35. 9g的聚合物溶液；
2)将制备例I制备的I. Og纯m-nHAP分散在24. 5g的去离子水中，经超声分散得到25. 5g的磁性复合纳米粒子悬浮液；3)将步骤I)中的聚合物溶液和步骤2)中的磁性复合纳米粒子悬浮液混合均匀，得到混合液，将混合液注入模具，在凝胶化以前通过磁场强度为8000高斯的磁场诱导120h将混合液中的m-nHAP呈连续梯度分布，之后采用循环冷冻解冻的方法使混合液凝胶化，循环冷冻解冻的方法中，冷冻温度为-22. 5°C，冷冻时间为13h，解冻温度为20. 5°C，解冻时间为13h，循环冻融次数为8次，混合液凝胶化后得到高强度连续梯度复合支架，该高强度连续梯度复合支架为圆柱形，直径为8mm，高度为7mm。高强度连续梯度复合支架上有孔径为5μπι 10 μ m的孔，吸水率为68%，压缩强度为17. 0±1. 5MPa。将本实施例的高强度连续梯度复合支架在不同高度下测试其组成，整体上由水凝胶和纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子组成，纳米羟基磷灰石/三氧化二 铁的磁性复合纳米粒子在高强度连续梯度复合支架的顶部和底部的重量百分含量分别为 0%和35%，纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子的重量百分含量从该高强度连续梯度复合支架的顶部至底部逐渐增多形成连续梯度分布。实施例2制备的高强度连续梯度复合支架通过成骨细胞定量评价方法得到的吸光度值为I. 31 ±0. 06。实施例3I)将2. Og PVA (聚合度1750±50，国药集团化学试剂上海有限公司)溶解于19. 8g去离子水中，加热使之溶解，得到Al溶液，再将O. 02g Col II溶解于I. 98g去离子水中得到A2溶液，将Al溶液和A2溶液混合，得到23. 8g的聚合物溶液；2)将制备例2制备的O. 224g纯m-nHAP分散在5. 490g的去离子水中，经超声分散得到5. 714g的磁性复合纳米粒子悬浮液；3)将步骤I)中的聚合物溶液和步骤2)中的磁性复合纳米粒子悬浮液混合均匀，得到混合液，将混合液注入模具，在凝胶化以前通过磁场强度为6000高斯的磁场诱导240h将混合液中的m-nHAP呈连续梯度分布，之后采用循环冷冻解冻的方法使混合液凝胶化，循环冷冻解冻的方法中，冷冻温度为-40°C，冷冻时间为2h，解冻温度为37°C，解冻时间为24h，循环冻融次数为2次，混合液凝胶化后得到高强度连续梯度复合支架，该高强度连续梯度复合支架为圆柱形，直径8mm，高度为7mm。高强度连续梯度复合支架上有孔径为I μ m 5 μ m的孔，吸水率为82%，压缩强度32. O ±3. 8MPa。将本实施例的高强度连续梯度复合支架在不同高度下测试其组成，整体上由水凝胶和纳米羟基磷灰石/四氧化三铁的磁性复合纳米粒子组成，纳米羟基磷灰石/四氧化三铁的磁性复合纳米粒子在高强度连续梯度复合支架的顶部和底部的重量百分含量分别为0%和8%，纳米羟基磷灰石/四氧化三铁的磁性复合纳米粒子的重量百分含量从该高强度连续梯度复合支架的顶部至底部逐渐增多形成连续梯度分布。实施例3制备的高强度连续梯度复合支架通过成骨细胞定量评价方法得到的吸光度值为O. 81±0. 11。实施例4I)将I. 50g PVA (聚合度1750±50，国药集团化学试剂上海有限公司)溶解于14. 80g去离子水中，加热使之溶解，得到Al溶液，再将O. 40g Gel溶解于19. 60g去离子水中得到A2溶液，将Al溶液和A2溶液混合，得到36. 3g的聚合物溶液；2)将制备例I制备的O. 48g纯m_nHAP分散在11. 17g的去离子水中，经超声分散得到11. 65g的磁性复合纳米粒子悬浮液；3)将步骤I)中的聚合物溶液和步骤2)中的磁性复合纳米粒子悬浮液混合均匀，得到混合液，将混合液注入模具，在凝胶化以前通过磁场强度为10000高斯的磁场诱导0. Ih将混合液中的m-nHAP呈连续梯度分布，之后 采用循环冷冻解冻的方法使混合液凝胶化，循环冷冻解冻的方法中，冷冻温度为_5°C，冷冻时间为24h，解冻温度为4°C，解冻时间为2h，循环冻融次数为15次，混合液凝胶化后得到高強度连续梯度复合支架，该高强度连续梯度复合支架为圆柱形，直径为8mm，高度为7mm。高強度连续梯度复合支架上有孔径为3um~ 6um的孔，吸水率为60%，压缩强度26. 0±2. 8MPa。将本实施例的高強度连续梯度复合支架在不同高度下测试其组成，整体上由水凝胶和纳米羟基磷灰石/三氧化ニ铁的磁性复合纳米粒子组成，纳米羟基磷灰石/三氧化ニ铁的磁性复合纳米粒子在高強度连续梯度复合支架的顶部和底部的重量百分含量分别为0%和18%，纳米羟基磷灰石/三氧化ニ铁的磁性复合纳米粒子的重量百分含量从该高強度连续梯度复合支架的顶部至底部逐渐增多形成连续梯度分布。实施例4制备的高強度连续梯度复合支架通过成骨细胞定量评价方法得到的吸光度值为0. 87 ±0. 07。实施例5I)将0.80g PVA(聚合度1750±50，国药集团化学试剂上海有限公司)溶解于7.91g去离子水中，加热使之溶解，得到Al溶液，再将0. Olg Col I和0. Olg Col II溶解于0.98g去离子水中得到A2溶液，将Al溶液和A2溶液混合，得到9. Hg的聚合物溶液；2)将制备例I制备的0.35g纯m-nHAP分散在8. 23g的去离子水中，经超声分散得到8. 58g的磁性复合纳米粒子悬浮液；3)将步骤I)中的聚合物溶液和步骤2)中的磁性复合纳米粒子悬浮液混合均匀，得到混合液，将混合液注入模具，在凝胶化以前通过磁场强度为8000高斯的磁场诱导IOh将混合液中的m-nHAP呈连续梯度分布，之后采用循环冷冻解冻的方法使混合液凝胶化，循环冷冻解冻的方法中，冷冻温度为-10°C，冷冻时间为20h，解冻温度为15°C，解冻时间为20h，循环冻融次数为12次，混合液凝胶化后得到高強度连续梯度复合支架，该高强度连续梯度复合支架为圆柱形，直径为8mm，高度为7mm。高強度连续梯度复合支架上有孔径为4iim 8iim的孔，吸水率为65%，压缩强度为22. 0±3. 4MPa。将本实施例的高強度连续梯度复合支架在不同高度下测试其组成，整体上由水凝胶和纳米羟基磷灰石/三氧化ニ铁的磁性复合纳米粒子组成，纳米羟基磷灰石/三氧化ニ铁的磁性复合纳米粒子在高強度连续梯度复合支架的顶部和底部的重量百分含量分别为0%和28%，纳米羟基磷灰石/三氧化ニ铁的磁性复合纳米粒子的重量百分含量从该高強度连续梯度复合支架的顶部至底部逐渐增多形成连续梯度分布。实施例5制备的高強度连续梯度复合支架通过成骨细胞定量评价方法得到的吸光度值为I. 15±0. 09。实施例6I)将0. 80g PVA(聚合度1750±50，国药集团化学试剂上海有限公司)溶解于7. 91g去离子水中，加热使之溶解，得到Al溶液，再将0. Olg Col I和0. Olg Gel溶解于0.98g去离子水中得到A2溶液，将Al溶液和A2溶液混合，得到9. Hg的聚合物溶液；2)将制备例I制备的0.35g纯m-nHAP分散在8. 23g的去离子水中，经超声分散得到8. 58g的磁性复合纳米粒子悬浮液；
3)将步骤I)中的聚合物溶液和步骤2)中的磁性复合纳米粒子悬浮液混合均匀，得到混合液，将混合液注入模具，在凝胶化以前通过磁场强度为8000高斯的磁场诱导10h，将混合液中的m-nHAP呈连续梯度分布，之后采用循环冷冻解冻的方法使混合液凝胶化，循环冷冻解冻的方法中，冷冻温度为-10°C，冷冻时间为20h，解冻温度为15°C，解冻时间为20h，循环冻融次数为12次，混合液凝胶化后得到高强度连续梯度复合支架，该高强度连续梯度复合支架为圆柱形，直径为8mm，高度为7mm。高强度连续梯度复合支架上有孔径为5 μ m 7 μ m的孔，吸水率为63%，压缩强度为20. O ±2. IMPa0将本实施例的高强度连续梯度复合支架在不同高度下测试其组成，整体上由水凝胶和纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子组成，纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子在高强度连续梯度复合支架的顶部和底部的重量百分含量分别为0%和26%，纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子的重量百分含量从该高强度连续梯度复合支架的顶部至底部逐渐增多形成连续梯度分布。实施例6制备的高强度连续梯度复合支架通过成骨细胞定量评价方法得到的吸光度值为1.08±0. 12。实施例7 I)将0.80g PVA(聚合度1750±50，国药集团化学试剂上海有限公司)溶解于7.91g去离子水中，加热使之溶解，得到Al溶液，再将O. Olg Col II和O. Olg Gel溶解于O. 98g去离子水中得到A2溶液，将Al溶液和A2溶液混合，得到9. 71g的聚合物溶液；2)将制备例I制备的O. 35g纯m-nHAP分散在8. 23g的去离子水中，经超声分散得到8. 58g的磁性复合纳米粒子悬浮液；3)将步骤I)中的聚合物溶液和步骤2)中的磁性复合纳米粒子悬浮液混合均匀，得到混合液，将混合液注入模具，在凝胶化以前通过磁场强度为8000高斯的磁场诱导IOh将混合液中的m-nHAP呈连续梯度分布，之后采用循环冷冻解冻的方法使混合液凝胶化，循环冷冻解冻的方法中，冷冻温度为-10°C，冷冻时间为20h，解冻温度为15°C，解冻时间为20h，循环冻融次数为12次，混合液凝胶化后得到高强度连续梯度复合支架，该高强度连续梯度复合支架为圆柱形，直径为8mm，高度为7mm。高强度连续梯度复合支架上有孔径为3 μ m 6 μ m的孔，吸水率为55%，压缩强度为18. 3 ±3. 5MPa。将本实施例的高强度连续梯度复合支架在不同高度下测试其组成，整体上由水凝胶和纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子组成，纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子在高强度连续梯度复合支架的顶部和底部的重量百分含量分别为0%和25%，纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子的重量百分含量从该高强度连续梯度复合支架的顶部至底部逐渐增多形成连续梯度分布。实施例7制备的高强度连续梯度复合支架通过成骨细胞定量评价方法得到的吸光度值为1.04±0. 10。实施例8I)将0.80g PVA(聚合度1750±50，国药集团化学试剂上海有限公司)溶解于7.91g去离子水中，加热使之溶解，得到Al溶液，再将O. OlgCol I、0. 005g Col II和O. 005g Gel溶解于O. 98g去离子水中得到A2溶液，将Al溶液和A2溶液混合，得到9. 71g的聚合物溶液；2)将制备例I制备的O. 35g纯m-nHAP分散在8. 23g的去离子水中，经超声分散得到8. 58g的磁性复合纳米粒子悬浮液；
3)将步骤I)中的聚合物溶液和步骤2)中的磁性复合纳米粒子悬浮液混合均匀，得到混合液，将混合液注入模具，在凝胶化以前通过磁场强度为8000高斯的磁场诱导20h将混合液中的m-nHAP呈连续梯度分布，之后采用循环冷冻解冻的方法使混合液凝胶化，循环冷冻解冻的方法中，冷冻温度为-8V，冷冻时间为10h，解冻温度为6°C，解冻时间为10h，循环冻融次数为11次，混合液凝胶化后得到高强度连续梯度复合支架，该高强度连续梯度复合支架为圆柱形，直径为8mm，高度为7mm。高强度连续梯度复合支架上有孔径为2 μ m 6 μ m的孔，吸水率为60%，压缩强度为19. 2 ±3. 8MPa。将本实施例的高强度连续梯度复合支架在不同高度下测试其组成，整体上由水凝胶和纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子组成，纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子在高强度连续梯度复合支架的顶部和底部的重量百分含量分别为0%和22%，纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合纳米粒子的重量百分含量从该高强度连续梯度复合支架的顶部至底部逐渐增多形成连续梯度分布。实施例8制备的高强度连续梯度复合支架通过成骨细胞定量评价方法得到的吸光度值为O. 99±O. 08。此外，还对高强度连续梯度复合支架(纳米羟基磷灰石/三氧化二铁的磁性复合 纳米粒子在高强度连续梯度复合支架的顶部和底部的重量百分含量分别为0%和80%)通过成骨细胞定量评价方法得到吸光度值为O. 55±0. 08，结合实施例广8的高强度连续梯度复合支架的吸光度值可知，磁性复合纳米粒子在高强度连续梯度复合支架的顶部和底部的重量百分含量分别为0%和359Γ70%，非常有利于成骨细胞的生长，并且从压缩强度的力学数据可知，具有较佳的力学性能。
权利要求
1.一种高强度连续梯度复合支架,其特征在于，由水凝胶和磁性复合纳米粒子组成，其中，所述的磁性复合纳米粒子在所述高强度连续梯度复合支架的顶部和底部的重量百分含量分别为0%和89Γ70%，所述的磁性复合纳米粒子的重量百分含量从所述高强度连续梯度复合支架的顶部至底部逐渐增多形成连续梯度分布； 所述的水凝胶为聚乙烯醇的水凝胶或者聚乙烯醇与天然材料两者的水凝胶； 所述的磁性复合纳米粒子为纳米羟基磷灰石/铁的氧化物的磁性复合纳米粒子。
2.根据权利要求I所述的高强度连续梯度复合支架，其特征在于，所述的天然材料为I型胶原、II型胶原、明胶中的一种或两种以上。
3.根据权利要求I所述的高强度连续梯度复合支架，其特征在于，所述的高强度连续梯度复合支架上有孔径为I μ m 50 μ m的孔。
4.根据权利要求I所述的高强度连续梯度复合支架，其特征在于，所述的磁性复合纳米粒子在所述高强度连续梯度复合支架的顶部和底部的重量百分含量分别为0%和359^70%。
5.根据权利要求Γ4任一项所述的高强度连续梯度复合支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 1)将聚乙烯醇或者聚乙烯醇与天然材料溶解于水中，得到聚合物溶液； 2)将纳米羟基磷灰石/铁的氧化物的磁性复合纳米粒子分散在水中，经超声分散得到磁性复合纳米粒子悬浮液； 3)将步骤I)中的聚合物溶液和步骤2)中的磁性复合纳米粒子悬浮液混合均匀，得到混合液，将混合液注入模具，在凝胶化以前通过磁场诱导方法将混合液中的纳米羟基磷灰石/铁的氧化物的磁性复合纳米粒子呈连续梯度分布，之后采用循环冷冻解冻的方法使混合液凝胶化，得到高强度连续梯度复合支架。
6.根据权利要求5所述的高强度连续梯度复合支架的制备方法，其特征在于，步骤I)中，所述的聚合物溶液中聚乙烯醇的重量百分含量为2°/Γ Ο%。
7.根据权利要求5所述的高强度连续梯度复合支架的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述的磁性复合纳米粒子悬浮液中纳米羟基磷灰石/铁的氧化物的磁性复合纳米粒子的重量百分含量为3% 8%。
8.根据权利要求5所述的高强度连续梯度复合支架的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述的聚合物溶液与磁性复合纳米粒子悬浮液的质量比为O. Γ4. 5 :1。
9.根据权利要求5所述的高强度连续梯度复合支架的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述的磁场诱导方法为在磁场强度600(Tl0000高斯的磁场下诱导O. Ih 240h。
10.根据权利要求5所述的高强度连续梯度复合支架的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述的循环冷冻解冻的方法中，冷冻的温度为_40°C _5°C，冷冻的时间为2h 24h，解冻的温度为4°C 37°C，解冻的时间为2h 24h，循环冷冻解冻的次数为2次 15次。
全文摘要
本发明公开了一种高强度连续梯度复合支架，涉及生物医学材料领域，由水凝胶和磁性复合纳米粒子组成，磁性复合纳米粒子在高强度连续梯度复合支架的顶部和底部的重量百分含量分别为0%和8%~70%，磁性复合纳米粒子的重量百分含量从高强度连续梯度复合支架的顶部至底部逐渐增多形成连续梯度分布；水凝胶为聚乙烯醇的水凝胶或者聚乙烯醇与天然材料两者的水凝胶。本发明高强度连续梯度复合支架解决了传统多层支架的界面缺陷问题，能够在保持支架具备力学性能和生物功能的同时，更好地满足骨软骨天然结构的多层次要求。本发明还公开了一种高强度连续梯度复合支架的制备方法，其易于实施和控制，具有广阔的应用前景。
文档编号A61L27/26GK102861361SQ20121034642
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月18日 优先权日2012年9月18日
发明者侯瑞霞, 付俊, 程亚军, 张国花 申请人:中国科学院宁波材料技术与工程研究所