专利名称：一种抗耐药性的顺铂矿化液及其制备方法和应用的制作方法
一种抗耐药性的顺铂矿化液及其制备方法和应用技术领域
本发明属于配位化学和药学领域，具体涉及一种抗耐药性的顺钼矿化液及其制备方法和应用。
背景技术：
肿瘤治疗一直是现代医学中难以克服的课题，顺钼药物对于肿瘤的治疗是一种重要手段，而这种方法现在遇到的难题是随着药物化疗过程的进行，肿瘤会体现出获得性的抵抗,这种抵抗使肿瘤组织对于化疗药物不再敏感,产生耐药性,最终导致化疗失败。
耐药性产生的原因可能是如下三种(I)细胞对于钼类药物的摄取量不足；⑵细胞中代谢的富含-NH2以及-SH的小分子和蛋白能够络合钼类药物，使其无法和DNA结合发挥作用；(3)钼类药物和DNA形成加合物之后，修复蛋白能够识别破坏位点，完成对DNA的修复(D. J. Stewart, Oncology/Hematology 2007,63,12-31)。
其中谈论比较多的是细胞内钼的积累，产生耐药的细胞在细胞膜上往往表达出相对较少的 Ctrl 蛋白(S.1shida, J. Lee, D. J. Thiele,1. Herskowitz, Proceedings of the National Academy of Sciences 2002,99,14298-14302.),这种蛋白是钼类药物进入细胞的主要运输体，该蛋白的表达减少致使耐药肿瘤细胞对于钼类药物的摄取减少，从而导致细胞内较少的DNA会被钼类药物破坏。
为了增加细胞对于钼类药物的摄取量，有报道将纳米技术引入这种化疗过程(R. Sinha, G.J.Kim, S.Nie, D. M. Shin, Molecular Cancer Therapeutics2006,5, 1909-1917.)，有机嵌段高分子，碳纳米管，金纳米晶体等都用来作为钼类药物的载体，用于药物从细胞外到细胞内的传递。但是这些纳米材料存在生物安全性的问题，它们往往在生理条件下不可降解，材料本身可能就具有破坏正常细胞的能力，进而引起较大的副作用。所以，关于钼类药物的修饰与改造一直在研究中，不过目前对于耐药肿瘤有效的治疗方法依然不是很多。发明内容
本发明提供了一种抗耐药性的顺钼矿化液及其制备方法和应用，使用该方法制得的顺钼矿化液可以提高肿瘤细胞对钼的摄取，逆转肿瘤细胞对于药物的抗药性，而且具有较小的副作用。
一种抗耐药性的顺钼矿化液的制备方法，包括以下步骤
(I)将顺钼加入到改进型的DMEM培养基中，在含CO2的环境中进行取代反应，反应完成后得到取代的中间体溶液；
(2)向步骤(I)得到的取代的中间体溶液中加入含钙无机盐，在含CO2的环境中进行矿化反应，反应完成后得到纳米固化的中间体体系；
(3)向步骤⑵得到的纳米`固化的中间体体系中加入胎牛血清蛋白，得到所述的顺钼矿化液；
所述的改进型的DMEM培养基为将DMEM培养基中的CaCl2、KCl和NaCl分别替换为 Ca (NO3) 2、KNO3 和 NaNO3 后得到；
其中步骤(I)和步骤(2)中，所述的含CO2的环境中CO2的含量为3 7%，具体可以通过培养箱进行调节。
本发明中，所述的改进型的DMEM培养基中的氯离子被硝酸根离子代替，而所述顺钼的氯配体容易在低氯环境下离去，因此以该改进型的DMEM培养基作为组分，顺钼的氯配体会发生解离，然后被碳酸根和磷酸根取代，从而完成顺钼的修饰；再通过加入含钙无机盐，将钙离子引入反应体系，在生理条件(一般为37°〇，5%0)2，？!1为7. 2)下钙离子与修饰有碳酸根或磷酸根的钼体系发生作用，发生矿化反应形成纳米粒子；最后通过加入胎牛血清蛋白终止反应，使纳米粒子不再增大，得到的顺钼矿化液可以直接使用。
所述的DMEM培养基的具体组分为本领域技术人员所熟知，具体可以为DMEM(H)培养基或DMEM (L)培养基。
作为优选，所述的改进型的DMEM培养基中，Ca(NO3)2的浓度为420 430mg/l ； KNO3 的浓度为 540 550mg/l ；NaNO3 的浓度为 9300 9310mg/l。
作为优选，步骤⑴中，所述的取代反应为20 24h。
作为优选，步骤(2)中，所述的含钙无机盐为Ca(NO3)2，采用硝酸钙时，溶解度较大，而且硝酸根负离子对生物矿化反应的影响较小。
作为优选，步骤⑵中，所述的含钙无机盐加入后的浓度为4mol/L 10mol/L，所述含钙无机盐的离子浓度会影响所述矿化反应的速度，进而影响所述纳米固化的中间体体系中的纳米粒子的粒径尺寸和产量，浓度过大产生的纳米粒子尺寸太大，浓度过小产生的纳米粒子产量太低，这都会影响最后得到的顺钼溶液的对耐药肿瘤的抑制效果。
作为优选，步骤⑵中，所述的矿化反应的时间为4 8小时，反应时间会影响纳米粒子粒径的尺寸和产量，时间过长产生的纳米粒子尺寸过大，时间太短产生的纳米粒子产量过低，这都会使得到的顺钼溶液的对耐药肿瘤的抑制效果下降。
本发明还提供了一种抗耐药性的顺钼矿化液，该顺钼矿化液由上述的制备方法制备得到。采用MTT方法分别检测该顺钼矿化液和未经过生物矿化的顺钼对于人的肺癌细胞株A549及其耐药细胞株A549/DDP的杀伤和抑制作用，结果显示，同未经过生物矿化的顺钼相比，该顺钼矿化液的药效明显增强。
通过构建耐药肿瘤的动物模型，采用皮下肿瘤移植的技术在裸鼠的腋下种上 A549/DDP细胞形成的耐药肿瘤组织，并采用尾静脉注射的方式化疗，分别使用未经过生物矿化的顺钼和所述的顺钼矿化液并对结果进行比较，结果显示，对于未经过生物矿化的顺钼无法治疗的耐药肿瘤，所述的顺钼矿化液依然显示除了良好的治疗效果。
本发明还提供了所述的抗耐药性的顺钼矿化液在抑制癌细胞中的应用，使用该顺钼矿化液可以使原来顺钼药物难以控制的肿瘤得以控制。
同现有技术相比，本发明的有益效果体现在
(I)本发明提 供的生物矿化的原位修饰有效的改变了顺钼药物进入细胞的方式， 修饰之后的顺钼药物是以依赖于溶酶体的细胞内吞的方式进入细胞，修饰之前的顺钼药物主要依赖细胞膜上的铜转运蛋白Ctrl的运输作用内化进入细胞。这种方式的改变可以有效提高因Ctrl表达下降而产生抵抗的耐药肿瘤细胞中的钼含量，从而可以有效提高药效；
(2)本发明提供的生物矿化的原位修饰明显增强了顺钼药物对于A549细胞的杀伤力，并且同时对于顺钼作用效果不佳A549/DDP细胞也有明显的疗效；
(3)本发明提供的生物矿化的原位修饰明显增强了顺钼药物对于小鼠体内耐药肿瘤的抑制效果，使原来顺钼药物难以控制的肿瘤得以控制。
图1为纳米固化的顺钼水解中间体的透射电子显微镜照片(TEM)，图中标尺为 IOOnm(白色)以及500nm(黑色)；
图2为纳米固化的顺钼水解中间体的粒径分布；
图3为纳米固化的顺钼水解中间体的能谱分析；
图4为流式细胞仪分析纳米固化顺钼中间体的吞噬效率，a，c，e为用FITC-BSA标记的纳米固化顺钼中间体作用的细胞的荧光照片和流式结果，b，d，f为只用FITC-BSA处理的细胞的荧光照片和流式结果。图中标尺为1(^!11(白色)；
图5为顺钼以及生物矿化修饰顺钼的细胞毒性实验；
图6为不含顺钼的独立的矿化修饰液对于细胞的兼容性实验，a为不含顺钼的矿化修饰液的能谱分析，b为不含顺钼的矿化修饰液的细胞毒性实验。
图7为顺钼以及生物矿化顺钼的耐药瘤小鼠动物实验，a)A549/DDP耐药瘤在不同药物治疗作用下的生长曲线，b)不同药物治疗16天后小鼠外形以及肿瘤的形貌以及大小的照片(图中标尺为1cm)，c)不同药物治疗16天后耐药肿瘤的质量，d)不同药物治疗的耐药肿瘤小鼠的体重变化。
具体实施方式
所用的顺钼药物，无机盐，有机小分子以及蛋白质都是化学纯以上进口试剂，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，应理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
实施例1
本发明采用原位生物矿化的技术，在改进型的DMEM培养基(又称为低氯培养基) 中，利用细胞培养的条件，反应生成顺钼的纳米固化水解中间体，并且进行了形貌，粒径和元素的分析，分别参见图1，图2，图3。
具体步骤如下
1、顺钼的水解平衡与取代
10 组顺钼(0，2. 188，3. 125，4，375，6. 250，8. 750，12. 500，17. 500，25. 000，35. 000 μ Μ)加入到2ml低氯培养基中平衡24小时后，条件为37°C，95%空气氛围，5% CO2, PH为7. 2，低氯培养基中的碳酸根和磷酸根会自发取代分子中的氯配体，完成药物的修饰， 约有10%的顺钼分子进入到纳米固化中间体中，该低氯培养基的配方如下
权利要求
1.一种抗耐药性的顺钼矿化液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)将顺钼加入到改进型的DMEM培养基中，在含CO2的环境中进行取代反应，反应完成后得到取代的中间体溶液；(2)向步骤(I)得到的取代的中间体溶液中加入含钙无机盐，在含CO2的环境中进行矿化反应，反应完成后得到纳米固化的中间体体系；(3)向步骤(2)得到的纳米固化的中间体体系中加入胎牛血清蛋白，得到所述的顺钼矿化液；所述的改进型的DMEM培养基为将DMEM培养基中的CaCl2、KCl和NaCl分别替换为 Ca (NO3) 2、KNO3 和 NaNO3 后得到。
2.根据权利要求1所述的抗耐药性的顺钼矿化液的制备方法，其特征在于，所述的改进型的DMEM培养基中，Ca(NO3)2的浓度为420 430mg/l ；ΚΝ03的浓度为540 550mg/l ； NaNO3 的浓度为 9300 9310mg/l。
3.根据权利要求1所述的抗耐药性的顺钼矿化液的制备方法，其特征在于，步骤(I) 中，所述的取代反应为20 30小时。
4.根据权利要求1所述的抗耐药性的顺钼矿化液的制备方法，其特征在于，步骤(2) 中，所述的含钙无机盐为Ca (NO3) 2。
5.根据权利要求1或4所述的抗耐药性的顺钼矿化液的制备方法，其特征在于，步骤 (2)中，所述的含钙无机盐加入后的浓度为4mol/L 10mol/L。
6.根据权利要求1所述的抗耐药性的顺钼矿化液的制备方法，其特征在于，步骤(2) 中，所述的矿化反应的时间为4 8小时。
7.一种抗耐药性的顺钼矿化液，其特征在于，所述的顺钼矿化液由权利要求1 6任一项所述的制备方法制备得到。
8.根据权利要求7所述的抗耐药性的顺钼矿化液在抑制癌细胞中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种抗耐药性的顺铂矿化液的制备方法，包括以下步骤(1)将顺铂加入到改进型的DMEM培养基中，在类似生理条件下反应得到取代的中间体溶液；(2)向得到的取代的中间体溶液中加入含钙无机盐，在类似生理条件下反应得到纳米固化的中间体体系；(3)向得到的纳米固化的中间体体系中加入胎牛血清蛋白，得到所述的顺铂矿化液。本发明还公开了该制备方法制得的顺铂矿化液及其应用，该顺铂矿化液对肿瘤细胞具有更强的杀伤力，并且对于顺铂难以治疗的具有明显耐药性的肿瘤具有明显的治疗效果。
文档编号A61K33/24GK103043635SQ20121057165
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月25日 优先权日2012年12月25日
发明者陈伟, 肖云, 刘雪瑶, 陈燕红, 章娇娇, 徐旭荣, 唐睿康 申请人:浙江大学