利用转基因动物乳腺生物平台大规模生产重组人丁酰胆碱酯酶的方法
【专利摘要】本发明提供了利用转基因动物乳腺生物平台大规模生产重组人丁酰胆碱酯酶的方法。本发明首次利用转基因哺乳动物乳腺生物平台大规模高效生产重组人丁酰胆碱酯酶全酶和单体，即不含丁酰胆碱酯酶全酶最后40个氨基酸残基的截断型酶，及丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白。所生产的重组蛋白可用于预防和治疗神经毒气中毒，有机磷农药中毒，可卡因中毒和琥珀胆碱引起的呼吸暂停，及用于检测和祛除蔬菜瓜果和其他农作物、各种物件层面及土壤的有机磷农药残留。
【专利说明】利用转基因动物乳腺生物平台大规模生产重组人丁酰胆碱酯酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物制药【技术领域】，具体地涉及利用转基因动物乳腺生物平台大规模生产重组人丁酰胆碱酯酶的方法。
【背景技术】
[0002]在过去的四十年中，基因工程技术的发展突飞猛进。大量基因药品陆续问世，年产值达数十亿美元。
[0003]基因工程药物的生产方法可以分为二大类。
[0004]第一类方法是将特定的药物基因导入到工程菌或工程细胞中，经细菌或细胞发酵培养，分离纯化得到。这一方法的特点是技术简单，但生产成本高，药物生物学活性不高。
[0005]第二类方法是转基因动物制药。所谓转基因动物制药是将药物蛋白基因导入到动物体内(如牛或奶山羊)，然后使药物从乳腺或其它器官中生产出来，通过提纯等工序制成基因工程药品。此法的特点是产量高，成本低，药物生物学活性稳定，但是技术较复杂，前期投资较高。近年来，由于基因工程技术的不断完善和动物克隆技术的发明，转基因动物制药已成为研发非常活跃的领域。
[0006]与基因工程细胞反应器相比，转基因动物制药具有高效益、低成本、高产量、高质量、能耗低、无污染等诸多优点。
[0007]西方发达国家已有二十多年转基因动物制药开发历史，技术已趋成熟。最近，美国GTC公司在羊奶中生产的ATryn? ( 一种人体抗凝血蛋白)已获欧洲EMEA和FDA批准，进入欧洲和美国市场。这是第一个通过转基因在羊奶中生产的上市药品，对转基因工业界而言具有里程碑意义。中国虽然在此领域的科学研究已取得进展，但工业化则刚刚起步。
[0008]胆碱酯酶是一类参与神经递质传递的酯酶总称，其主要功能是在神经胆碱能突触水解乙酰胆碱。此类突触存在于人类、其他脊椎动物及昆虫的神经系统。当这些突触不断发射信号时，肌肉、腺体和神经元会受到刺激或抑制。神经递质乙酰胆碱的作用是传递这些刺激信号，而胆碱酯酶通过水解乙酰胆碱阻止其信号传递。胆碱酯酶抑制物质如有机磷化合物或氨基甲酸酯类杀虫剂及药物能阻止乙酰胆碱水解，造成乙酰胆碱堆积，从而引起神经系统过度活跃。人类和其他动物若接触胆碱酯酶抑制物质，取决于其类型和数量，可造成从轻度如抽搐、颤抖等到严重如呼吸麻痹、惊厥等症状。在极端情况下，引起死亡。
[0009]胆碱酯酶可由不同数量的催化和非催化亚基组成。这两种酶都由约600个氨基酸的亚单位组成并糖基化。根据其底物偏好和对选择性抑制剂的敏感性，胆碱酯酶分为两大类。
[0010] 那些优先水解乙酰胆碱酯类如乙酰胆碱的酶，其酶活性对化学抑制剂BW284C51敏感，被称为乙酰胆碱酯酶(AChE)，或乙酰胆碱乙酰水解酶(EC3.1.1.7)。乙酰胆碱酯酶又称真实型，特异型，纯正型，红细胞型，或I型胆碱酯酶，是一种膜结合糖蛋白，并以不同分子形式存在于红细胞、神经末梢、肺、脾和大脑灰质。乙酰胆碱酯酶在体内主要用于水解乙酰胆碱。[0011]那些优先水解其他类酯如丁酰胆碱的酶，其酶活性对化学抑制剂四异丙酯焦磷酰胺(ISO-OMPA)敏感，被称为丁酰胆碱酯酶(BCHE，EC3.1.1.8)。丁酰胆碱酯酶也被称为假性丁酰胆碱酯酶或非特异丁酰胆碱酯酶。丁酰胆碱酯酶根据其电荷，疏水性，与细胞膜或细胞外结构互动，及亚基组成而进一步分类。该酶又称血浆型，血清型，苯甲酰型，虚假型或II型胆碱酯酶，有超过11个同工酶变异体。丁酰胆碱酯酶优先使用丁酰胆碱和苯甲酰胆碱作为其体外反应底物。该酶存在于哺乳动物血浆、肝、胰、肠粘膜、中枢神经系统白质、平滑肌和心脏。丁酰胆碱酯酶的具体功能尚不明晰，它没有已知的特定自然底物，虽然它也水解乙酰胆碱。
[0012]尽管胆碱酯酶抑制物质对人体产生破坏性影响，但它们也有治疗用途，能治疗老年痴呆症和帕金森氏病，青光眼，多发性硬化症，重症肌无力等。
[0013]有机磷化合物在过去50年中应用于战争及作为农药使用使急性和迟发性中毒病例数目持续上升。据估计，每年50-100万农药相关的中毒病例中，死亡人数达19，000人。据统计，2007年中国农药总产量达173万吨，居世界第一位(农药研究与应用2008年第2期)。但是，中国研发的高效、低毒、低残留、环保型农药所占比例较低，杀虫剂在各类农药中所占比重较高，且50%以上是广谱、高毒有机磷杀虫剂。农药大量应用具有较大风险，如由于施用技术不当，环境健康意识不强，过多使用或管理不善而引起的人体急性有机磷农药中毒和农产品农药残留问题，不仅威胁人类健康，还影响到农产品在国际市场的竞争力。
[0014]目前治疗有机磷中毒主要为接触后静脉注射或肌肉注射各种药物组合，包括氨基甲酸酯类(如吡啶斯的明)，抗胆碱类药(如阿托品)，胆碱酯酶活化剂如氯解磷定(2-PAM，Protopam)。虽然这类药物治疗能有效防止有机磷农药中毒死亡，但对防止抽搐、行为障碍或永久性脑损伤无效。此外，毒物接触后的药物治疗往往无效，因为即使小剂量有机磷化学战剂可能导致瞬间死亡。这些药物缺点导致胆碱酯酶被用于有机磷农药中毒的预防和治疗研究。人体接触后症状可通过丁酰胆碱酯酶预处理而缓解，因为该酶能在有机磷化合物袭击其生理靶标前中和它们。使用胆碱酯酶作为预防药物已成功在动物包括非人类灵长类动物身上得到证明。例如，应用胎牛血清源性乙酰胆碱酯酶或马血清衍生丁酰胆碱酯酶预处理称猴，能保护他们抵抗2-5倍LD50高毒性有机磷神经毒剂梭曼的袭击(PharmacolExp Ther259:633-638, 1991 ；Toxicol Appl Pharmacol 117:189-193，1992)。除预防毒剂致死外，这些预处理还能预防梭曼袭击后的行为丧失症状。服用足够外源性人类丁酰胆碱酯酶可以保护小鼠，大鼠和猴子免于多个致死剂量的有机磷化合物毒性袭击(BiochemicalPharmacology42:2465-2474, 1993 ；Toxicol Appl Pharmacol145:43-53，1997 ；ToxicolSci43:121-128, 1998)。纯化的人丁酰胆碱酯酶已被用来治疗人类的有机磷农药中毒，无重大不良免疫或心理反应(Minerva Anestesiol54:337, 1998)。
[0015]体外和体内有机磷滴定都显示，有机磷抑制酶类和累积剂量的神经毒剂之间存在1:1化学计量比。有机磷毒剂抑制胆碱酯酶是由于毒剂与胆碱酯酶活性中心丝氨酸形成了稳定的具化学计量比(1:1)的共价体。紧接着是平行的竞争反应，称为“老化”，其中受到抑制的胆碱酯酶被转化成一个不能被常用的活化剂再生的形式。这些活化剂，如活性中心定向亲核体(如季铵肟)，通常分离活性中心丝氨酸的羟基磷成分。衰老过程涉及共价结合有机磷基团脱烷基化，并使治疗某些有机磷中毒如梭曼、沙林和DFP变得非常困难。[0016]尽管丁酰胆碱酯酶有因阻止有机磷化合物中毒而作为广泛应用药物的潜能，但由于供应受限目前无法广泛使用。由于提供保护所需的1:1化学计量比，需大量丁酰胆碱酯酶进行有效治疗。目前只能从人血浆中提取。远远不能满足各种需求。
[0017]除了具有水解有机磷毒素的功效之外，有证据表明，丁酰胆碱酯酶还是可卡因主要解毒酶(Mol Pharmacol55:83-91, 1999)。
[0018]鉴于丁酰胆碱酯酶的重要药用潜力，研究主要集中利用基因工程方法研发和生产。不同于血浆生产酶类，重组丁酰胆碱酯酶传播传染性病原体包括病毒，如丙型肝炎和艾滋病毒的风险要低很多。据报道，重组丁酰胆碱酯酶已在下列系统中表达:大肠杆菌，显微注射爪蟾卵母细胞(美国专利号5215909)，体外昆虫细胞系及昆虫幼虫体内(BiotechnolAppl Biochem31:225-229, 2000)，家蚕(Biochem Pharmacol60:121-126，2000)，以及哺乳动物 COS 细胞(Biotechnol Appl Biochem31:225-229，2000)和 CHO 细胞(J BiolChem268:14329-41, 1993 ；Biochemistry36:786-795, 1997 ;BiochemJ327:747-757，1997 ；JNeurochemistry74:869-877, 2000)。然而，许多基因工程生产的丁酰胆碱酯酶只具备很少或没有体内酶活性，这些表达系统不足以产生足够数量可实际应用的丁酰胆碱酯酶。
[0019]此外，虽然有利用转基因山羊奶生产出丁酰胆碱酯酶的研究，但由于转基因山羊是经配子微注射方法而获得，因此不仅周期长而且转基因效率很低，只有5%左右。另外，由于转基因动物所产重组人丁酰胆碱酯酶为四聚体，二聚体和单体的混合物(PNAS104:13603-13608, 2007)，不利于质量控制和后续加工，因此产业化难度很大。
[0020]综上所述，现有技术中的各种表达或分离纯化系统或者不能生产或分离纯化足够数量具活性的重组人丁酰胆碱酯酶，或者所生产的具活性的重组人丁酰胆碱酯酶产品不均一化，因此本领域迫切需要 开发新的高效、简便、适合大规模生产和应用的制备丁酰胆碱酯酶的方法。
【发明内容】
[0021]本发明的目的就是提供一种高效、简便、适合大规模生产和应用的制备丁酰胆碱酯酶的方法。
[0022]在本发明的第一方面，提供了一种表达盒，所述表达盒从5’至3’，依次包括可操作性连接(operably linked)的以下元件:
[0023]⑴绝缘体片段；
[0024](ii)酪蛋白启动子或乳清酸性蛋白质(WAP)启动子序列；
[0025](iii)至少一个信号肽编码序列(如酪蛋白信号序列)，所述信号肽编码序列提供表达丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白分泌的信号肽；
[0026](iv)重组蛋白编码序列，所述编码序列编码丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体(截断型，不形成四聚体)，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白；和
[0027](V)终止密码子；
[0028]并且，当所述表达盒整合入哺乳动物细胞后，经核移植使转基因哺乳动物乳腺表达并分泌丁酰胆碱酯酶全酶、或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白。[0029]在另一优选例中，所述表达盒还包括(Vi)任选地位于各元件之间的连接序列。
[0030]在另一优选例中，所述表达盒还包括供哺乳动物细胞选择的新霉素，或嘌呤霉素抗性基因。
[0031]在另一优选例中，所述的标记基因可位于元件⑴之前、元件⑴与(ii)之间、或元件(V)之后。
[0032]在另一优选例中，所述的丁酰胆碱酯酶单体是缺失了野生型BCHE的C末端40个氨基酸残基的丁酰胆碱酯酶，即delC40-BCHE。
[0033]在另一优选例中，所述的丁酰胆碱酯酶或其融合蛋白选自下组:
[0034](i)氨基酸序列如SEQ ID N0.:1所示的重组人丁酰胆碱酯酶；
[0035](ii)氨基酸序列如SEQ ID N0.:2所示的重组人丁酰胆碱酯酶单体；
[0036](iii)氨基酸序列如SEQ ID N0.:3所示的重组人丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白。
[0037]在另一优选例中，所述的重组蛋白编码序列选自下组:
[0038](i)核苷酸序列如SEQ ID N0.: 4所示的重组人丁酰胆碱酯酶编码DNA序列；
[0039](ii)核苷酸序列如SEQ ID N0.: 5所示的人丁酰胆碱酯酶单体编码DNA序列；
[0040](iii)核苷酸序列如SEQ ID N0.:6所示的重组人丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白编码DNA序列。
[0041]本发明的第二方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第一方面所述的表达盒。
[0042]在另一优选例中，所述的载体是表达载体。
[0043]本发明的第三方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞中含有本发明第二方面所述的载体或染色体中整合有本发明第一方面所述的表达盒。
[0044]在另一优选例中，所述的宿主细胞是哺乳动物细胞。
[0045]在另一优选例中，所述宿主细胞经瞬时或稳定转染而表达重组的丁酰胆碱酯酶或其融合蛋白。
[0046]在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组:乳腺上皮(MAC-T)细胞，胚胎成纤维细胞，胚胎干细胞，胚胎新生细胞，卵母细胞，或精子。
[0047]本发明的第四方面，提供了一种制备丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白的方法，包括步骤:
[0048](i)提供一转基因的非人哺乳动物动物，所述转基因非人哺乳动物的染色体中含有本发明第一方面所述的表达盒，从而在泌乳期分泌含丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白的乳汁；和
[0049](ii)从所述乳汁中分离所述的丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白。
[0050]本发明的第五方面，提供了一种乳汁原料，所述乳汁由非人哺乳动物分泌，并且所述乳汁中含有重组的丁酰胆碱酯酶单体或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白，其中所述乳汁中丁酰胆碱酯酶基本上以单体形式存在。
[0051] 在另一优选例中，在所述乳汁中，二聚体、三聚体或四聚体形式的丁酰胆碱酯酶的总含量< 10%，较佳地< 5%，更佳地< 1%，按单体、二聚体、三聚体和四聚体形式的4种丁酰胆碱酯酶的总量计。
[0052]在另一优选例中，所述的乳汁是由转基因的非人哺乳动物所分泌，所述转基因非人哺乳动物的染色体中含有本发明第一方面所述的表达盒，从而在泌乳期分泌含丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白的乳汁。
[0053]在另一优选例中，所述乳汁中，重组的丁酰胆碱酯酶单体或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白的含量> 500mg/L乳汁。
[0054]本发明第六方面提供了一种分离或纯化的重组蛋白，所述重组蛋白选自丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白，并且所述的重组蛋白是用本发明第四方面所述方法制备的。
[0055]本发明第七方面，提供了一种制造药物组合物的方法，该方法包括步骤:
[0056]将(i)本发明第六方面所述的分离或纯化的丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白，与(ii)药学上可接受的载体或赋形剂混合，从而形成药物组合物。
[0057]在另一优选例中，所述方法还包括将上述组分(i)、组分(ii)和组分(iii)肟类药物进行混合，从而形成药物组合物。
[0058]在另一优选例中，所述的重组蛋白的用途，用于⑴制备预防和/或治疗有机磷中毒的药物；(ii)制备治疗手术后琥珀酰胆碱诱导的睡眠呼吸暂停的药物；(iii)制备治疗可卡因中毒的药物；
[0059]在另一优选例中，所述的药物还含有肟类药物。
[0060]本发明第八方面，提供了一种制备转基因非人哺乳动物的方法，包括步骤；
[0061](i)提供一含有本发明第一方面所述的表达盒的载体或来自所述载体的含本发明第一方面所述表达盒的核酸片段；
[0062](ii)将上一步骤所述的载体或所述的核酸片段转入非人哺乳动物的细胞，获得经转染的细胞；
[0063](iii)从上一步骤的经转染的细胞中，选出染色体中整合有本发明第一方面所述的表达盒的细胞，从而获得整合的细胞；
[0064](iv)将来自所述整合的细胞的细胞核转入去核卵母细胞，从而形成融合细胞；
[0065](V)将上一步骤的融合细胞或衍生自所述融合蛋白的胚胎转入雌性哺乳动物代孕体，从而导致该代孕母体分娩出转基因的非人哺乳动物；
[0066]其中，所述的细胞、卵母细胞和雌性哺乳动物属于同一物种。
[0067]在另一优选例中，所述的物种包括:羊、牛、兔和啮齿动物。
[0068]本发明第九方面，提供了一种将本发明第八方面所述的哺乳动物细胞经核移植与去核卵母细胞结合而形成胚胎的方法。
[0069]本发明第十方面，提供了一种使转基因哺乳动物在泌乳期分泌丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白的方法，该方法包括:
[0070](i)将一个或几个根据本发明第九方面所述的方法所形成并成长的胚胎转移到雌性哺乳动物代孕体，导致 该代孕母体分娩出转基因哺乳动物；
[0071](ii)筛选雌性转基因哺乳动物；
[0072](iii)诱导或维持雌性转基因哺乳动物哺乳期；[0073](iv)从哺乳期哺乳动物提取奶液。
[0074]本发明第十一方面提供了一种预防有机磷中毒的方法，该方法包括给受试者施用根据本发明第十方面所述方法产生的药物组合物必需的有效预防剂量。
[0075]本发明第十二方面提供了一种治疗有机磷中毒的方法，该方法包括给受试者施用根据本发明第十方面所述方法产生的药物组合物必需的有效治疗剂量。
[0076]本发明第十三方面提供了一种治疗手术后琥珀酰胆碱诱导的睡眠呼吸暂停的方法，该方法包括给受试者施用根据本发明第十方面所述方法产生的药物组合物必需的有效治疗剂量。
[0077]本发明第十四方面提供了一种治疗可卡因中毒的方法，该方法包括给受试者施用根据本发明第十方面所述方法产生的药物组合物必需的有效治疗剂量。
[0078]本发明第十五方面提供了一种治疗有机磷中毒的方法，该方法包括给受试者施用根据本发明第十三方面所述方法产生的药物组合物必需的有效治疗剂量。
[0079]本发明第十六方面提供了一种治疗手术后琥珀酰胆碱诱导的睡眠呼吸暂停的方法，该方法包括给受试者施用根据本发明第十三方面所述方法产生的药物组合物必需的有效治疗剂量。
[0080]本发 明第十七方面还提供了一种治疗可卡因中毒的方法，该方法包括给受试者施用根据本发明第十三方面所述方法产生的药物组合物必需的有效治疗剂量。
[0081]本发明第十八方面，还提供了产生本发明表达盒的方法，包括将编码丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白序列与酪蛋白启动子或乳清酸性蛋白质(WAP)启动子序列连接以表达丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白，和至少一个提供表达丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白分泌的信号序列。本发明还包括含该表达盒DNA序列的非人类哺乳动物胚胎或哺乳动物细胞，包括乳腺上皮细胞，胚胎干细胞，胚胎新生细胞，卵母细胞，或精子。
[0082]本发明第十九方面，提供了使转基因哺乳动物在泌乳期分泌丁酰胆碱酯酶全酶，或单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白的方法，该方法包括:
[0083](I)将一个或几个根据上述方法所形成并成长的胚胎转移到雌性哺乳动物代孕体，导致该代孕母体分娩出转基因哺乳动物；
[0084](2)筛选雌性转基因哺乳动物；
[0085](3)诱导或维持雌性转基因哺乳动物哺乳期；
[0086](4)从哺乳期哺乳动物提取奶液。本发明还针对一种从上述方法所产生的奶液中分离和纯化丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白的方法。
[0087]本发明第二十方面，还提供了一种生产药物成分的方法，包括将转基因哺乳动物所产重组丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白或丁酰胆碱酯酶-白蛋白融合蛋白与药物学可接受的载体或赋形剂相结合。因此，本发明进一步针对预防和治疗有机磷中毒，手术后琥珀胆碱引起的呼吸暂停及可卡因中毒的方法，该方法包括让人体服用足够疗效的上述通过本发明方法产生的药物成分。
[0088]本发明第二十一方面，还提供了一种制造药物组合物的方法，包括将转基因哺乳动物所产重组丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白，与肟类药物结合。因此，本发明进一步针对预防和治疗有机磷中毒，手术后琥珀胆碱引起的呼吸暂停及可卡因中毒的方法，该方法包括让人体服用足够疗效的上述通过本发明方法产生的药物结合体。
[0089]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【专利附图】
【附图说明】
[0090]图1显示了本发明一个实例中重组人丁酰胆碱酯酶表达构建体质粒示意图。【具体实施方式】
[0091]本发明人经过广泛而深入的研究，首次利用转基因哺乳动物乳腺生物平台大规模高效生产重组人丁酰胆碱酯酶全酶和单体。本发明方法不仅转化效率高、生产周期短，而且所生产的全酶和单体产品均一，易于进行质量控制和后续加工，因此特别适合大规模产业化应用。在此基础上完成了本发明。
[0092]定义
[0093]“丁酰胆碱酯酶”是指一种能水解丁酰胆碱和乙酰胆碱的多肽，其酶活性对化学抑制剂四异丙酯焦磷酰胺(也称IS0-0MPA)敏感。丁酰胆碱酯酶根据其电荷，疏水性，与细胞膜或细胞外结构互动，及亚基组成而进一步分类。由本发明生产的首选丁酰胆碱酯酶是哺乳动物丁酰胆碱酯酶。首 选哺乳动物丁酰胆碱酯酶包括人体丁酰胆碱酯酶。尤其，只要该丁酰胆碱酯酶的氨基酸序列与人体丁酰胆碱酯酶基本相同。该丁酰胆碱酯酶可由与人体丁酰胆碱酯酶cDNA序列基本相同的核酸序列编码。“丁酰胆碱酯酶”还包括药物学上可接受的丁酰胆碱酯酶多肽盐。
[0094]“丁酰胆碱酯酶单体”是指不含四聚体功能域(如缺少了 C-末端40个氨基酸残基)的人丁酰胆碱酯酶。
[0095]“丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白”是指一种能水解乙酰胆碱和丁酰胆碱的丁酰胆碱酯酶单体与白蛋白融合的多肽。由本发明生产的首选融合蛋白是哺乳动物丁酰胆碱酯酶-白蛋白融合蛋白。首选哺乳动物融合蛋白包括人体丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白。尤其，只要该融合蛋白的氨基酸序列与人体丁酰胆碱酯酶单体和白蛋白基本相同。此外，融合蛋白的两个构成元件之间可任选地通过连接肽连接，例如通过一种含至少7个氨基酸(包括6个甘氨酸和I个丝氨酸)的寡肽相连接。该融合蛋白可由与人体丁酰胆碱酯酶单体和人体血清白蛋白cDNA序列基本相同的核酸序列编码。较佳地，两个构成元件的编码序列之间直接连接或可通过连接肽的编码序列相连。“融合蛋白”还包括药物学上可接受的融合蛋白的盐形式。
[0096]“基本相同”是指一种多肽或核酸序列与参考氨基酸或核酸序列相比表现出至少75%，更好85%或90%以上，最好95%以上的同源性。多肽序列一般至少包含20个氨基酸，更好30-40个以上氨基酸，最好50个以上氨基酸。核酸序列一般至少包含60个核苷酸，更好90个以上核苷酸，最好120个以上核苷酸。在本发明中，“基本相同”的多肽通常可保留或具有≥50%,较佳地≥60%,更佳地≥70%,最佳地≥80%或≥90%或≥100%如100~500%的参考多肽的生物活性。
[0097]“重组丁酰胆碱酯酶”是指应用本发明构建的表达质粒经过瞬时转染，稳定转染，转基因宿主细胞或动物表达而生产的丁酰胆碱酯酶。“重组丁酰胆碱酯酶”还包括药物学上可接受的丁酰胆碱酯酶多肽盐。
[0098]“重组丁酰胆碱酯酶单体”是指应用本发明构建的表达质粒经过瞬时转染，稳定转染，转基因宿主细胞或动物表达而生产的丁酰胆碱酯酶单体。“重组丁酰胆碱酯酶单体”还包括药物学上可接受的丁酰胆碱酯酶单体多肽盐。
[0099]“重组丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白”是指应用本发明构建的表达质粒经过瞬时转染，稳定转染，转基因宿主细胞或动物表达而生产的丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白。“重组丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白”还包括药物学上可接受的丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白多肽盐。
[0100]“重组DNA序列”指的是一种DNA序列以在自然界中不被发现存在的方式排列，该序列可能会存在于孤立的体外DNA，体内额外染色体DNA，或作为体内基因组DNA的部分。
[0101]“表达盒”或“构建体”是指一种包括目标核酸序列或基因序列，能表达合适蛋白，与宿主细胞内提供适当转录和翻译的目标核酸序列成分操作连接。所述成分可能包括启动子，分泌信号序列，加尾信号，内含子序列，绝缘子序列及本发明所述的其他成分。“表达盒”或“构建体”还可包括“载体序列”。“载体序列”是指用本发明重组DNA技术构建的核酸序列以利于表达构建体的克隆和表达。代表性的表达载体类型包括(但不限于)质粒，粘粒，噬菌体载体,病毒载体,及酵母人工染色体。
[0102]“双顺反子结构”是指任何能表达两个独立翻译蛋白产品的构建体。这两种产品可能会从一个单一的基因双顺反子结构或从两个独立的mRNA翻译而来，每个独立的mRNA由同样的双顺反子结构编码。“聚顺反子结构”是指任何能提供两个以上独立翻译蛋白产品表达的构建体。
[0103]“操作性连接”是指一个目标核酸序列和一个或多个调控序列(例如，启动子)物体上联系起来，以便能够在宿主细胞内表达目标核酸序列编码的多肽。
[0104]“信号序列”是指一段核酸序列，当被引入到编码多肽的核酸序列，能指导表达该多肽的细胞分泌该多肽(如丁酰胆碱酯酶和/或糖基转移酶)。信号序列最好位于核酸编码序列5’端，这样信号序列的多肽位于翻译多肽的N-末端。“信号肽”是指信号序列翻译的多肽序列。
[0105]“乳腺特异性启动子”是指能启动多肽主要在乳腺细胞表达并在乳汁分泌的与编码该多肽核酸序列操作性连接的启动子。优选的乳腺特异性启动子包括(但并不限于):β-酪蛋白启动子和乳清酸蛋白(WAP)启动子。
[0106]“宿主细胞”是指已经过一个或多个本发明表达构建体转染的细胞，包括哺乳动物体外培养细胞和体内细胞。优选的体外培养哺乳动物宿主细胞包括(但并不限于)=MAC-T细胞和BHK细胞。
[0107]“转染”是指在宿主细胞中引入一个或多个本发明表达构建体的实施过程，包括(但并不限于):显微注射，电穿孔，脂质体介导转染，磷酸钙介导转染或病毒介导转染等。本发明表达构建体若已转染至宿主细胞，则称其为“已转染的”。“瞬时转染细胞”是指这样的宿主细胞，在该宿主细胞中引入了表达构建体但没有永久整合到宿主细胞或其后代的基因组，因而随时间推移该表达构建体可被宿主细胞或其后代丢失。“稳定的转染细胞”是指引入宿主细胞的表达构建体已整合到宿主细胞及其后代的基因组。
[0108]“转基因”是指任何一个已整合至转染宿主细胞基因组的本发明表达构建体的结构。含有这类转基因的宿主细胞称为“转基因细胞”。这种由部分或全部转基因宿主细胞组成的动物是“转基因动物”。首选转基因动物为转基因哺乳动物(如啮齿动物或反刍动物、或家畜)。由部分转基因宿主细胞组成的动物称为“嵌合体”或“嵌合体动物”。
[0109]“肟类”是指含有羰基的醛、酮类化合物与羟胺作用而生成的化合物，在体内能重新激活磷酸化的胆碱酯酶。
[0110]1.丁酰胆碱酯酶
[0111]如本文所用，术语“本发明蛋白”、“本发明的丁酰胆碱酯酶”、或“本发明重组的丁酰胆碱酯酶”指出用本发明转基因动物乳腺生物平台大规模生产出的重组人丁酰胆碱酯酶。丁酰胆碱酯酶包括丁酰胆碱酯酶及同工酶，或衍生物，或变异体，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体与其他蛋白(如白蛋白)的融合蛋白。
[0112]可用于本发明的丁酰胆碱酯酶没有特别限制，可以是来源于任何生物体的丁酰胆碱酯酶，优选来自于哺乳动物(如灵长类动物)，更佳地来源于人。此外，应理解，该术语包括野生型或突变型(包括截断型)的丁酰胆碱酯酶，只要该突变型丁酰胆碱酯酶保留或保持了野生型丁酰胆碱酯酶的解毒活性。
[0113]人丁酰胆碱酯酶cDNA序列已被克隆(美国专利号5215909)。此外，美国专利号5248604揭示了人类乙酰胆碱酯酶的非糖基化的变异体。野生型人类丁酰胆碱酯酶的氨基酸序列，以及几个丁酰胆碱酯酶变异体单一氨基酸的变化，在美国专利号6001625也有披露。
[0114]在本发明中，特别优选的是截断型丁酰胆碱酯酶，尤其是去除了 C末端的多个Iys残基所获得的BCHE，例如截断的、不含C末端最后40个氨基酸残基的丁酰胆碱酯酶(简称为“delC40-BCHE”)。因为3个赖氨酸残基处于被删除的40个残基中，生产出的规格一致的丁酰胆碱酯酶单体可增加下游化学过程如单体聚乙二醇化处理的有效性。
[0115]实验表明，截断的delC40-BCHE显示与原酶具同样催化性能。
[0116]另一种优选方式是截断型丁酰胆碱酯酶与其他蛋白(如白蛋白)形成的融合蛋白。
[0117]本发明蛋白由于成分均一，因此特别适合进行后加工或修饰，以便获得改善的性能，其中包括(但并不限于):聚乙二醇修饰等。
[0118]聚乙二醇修饰通常能改善重组蛋白药代动力学和毒性性能。多肽或蛋白吸附亲水性PEG分子后，能提高水溶性并形成一个屏障，以防止酶降解、肾脏清除、与细胞表面蛋白发生相互作用和形成中和抗体，从而延长多肽或蛋白的半衰期。
[0119]本发明生产的重组丁酰胆碱酯酶，可用于治疗和/或预防有机磷农药中毒，神经毒气中毒，可卡因中毒和琥珀胆碱引起的呼吸暂停，及用于水解蔬菜瓜果和其他农作物、各种物件层面及土壤的有机磷农药残留。
[0120]2.丁酰胆碱酯酶选择
[0121]丁酰胆碱酯酶正常情况下形成球状四聚体，分子量约为340kDa。该形式最稳定，首选用于治疗目的。野生型，变异体，和人工丁酰胆碱酯酶可通过根据本发明的转基因哺乳动物而产生。由此产生的丁酰胆碱酯酶具有中和和/或水解有机磷农药，毒气，琥珀酰胆碱，或可卡因的能力。
[0122]根据本发明产生的丁酰胆碱酯酶所包含的氨基酸序列与发现的哺乳动物丁酰胆碱酯酶序列最好基本相同，更好与人丁酰胆碱酯酶序列基本相同。本发明所生产的丁酰胆碱酯酶可为四聚体，三聚体，二聚体，或单体。本发明所产生的丁酰胆碱酯酶最好具有与自然人丁酰胆碱酯酶基本类似的糖基化属性。根据本发明生产的丁酰胆碱酯酶最好与人血清白蛋白融合以增加其血浆半衰期。
[0123]I)四聚体丁酰胆碱酯酶
[0124]根据本发明产生的丁酰胆碱酯酶最好是四聚体形式。该形式更稳定，并具有较长的血浆半衰期，从而增加其疗效。丁酰胆碱酯酶在CHO细胞的重组表达被发现不是以更稳定的四聚体形式存在，而是包括约55% 二聚体，10%-30%四聚体和15-40%单体(Biochem J327:747-757，1997)。有研究表明，富含脯氨酸的胶原尾部蛋白的N-末端氨基酸序列可将乙酰胆碱酯酶组装成四聚体(J Biol Chem272:3016-3021, 1997 JBiolChem272:22840-22847,1997)。因此，为了提高根据本发明所产生的丁酰胆碱酯酶的四聚体含量，编码丁酰胆碱酯酶的DNA序列可包含富含脯氨酸附属区域(PRAD)，该区域帮助组装重组丁酰胆碱酯酶亚单位(例如，单体，二聚体和三聚体)从而形成四聚体。该区域最好包括至少6个残基，后跟至少10个脯氨酸残基。一个在本发明中PRAD的实例包括下列氨基酸序列Glu-Ser-Thr- (Gly) 3- (Pro) 10。该PRAD可能被包括在一个编码PRAD和丁酰胆碱酯酶的双顺反子表达构建体，或在不同的表达构建体。此外，PRAD编码可定向附于丁酰胆碱酯酶编码。本发明还包括在重组丁酰胆碱酯酶混合物中添加合成的(例如，聚脯氨酸)或天然存在的PRAD，以诱导丁酰胆碱酯酶重排为四聚体。
[0125]2).非四聚体丁酰胆碱酯酶
[0126]虽然四聚体丁酰胆碱酯酶是有机磷中毒预防和治疗的最有效形式，本发明也包括已表明底物活性的其他形式的丁酰胆碱酯酶(例如，单体，二聚体和三聚体)。然而，非四聚体形式丁酰胆碱酯酶在体内不太稳定的观察不能排除它们在体内应用的有效性。非四聚体较高剂量或更频繁在体内给药可以导致满意的治疗结果。
[0127]丁酰胆碱酯酶非四聚体可用于许多并不需要在体内给药的场合，如清理用于存储有机磷化合物的场地，以及军事设备有机磷的去污。作为体外应用，这些非四聚体可制成海绵，喷雾剂，清洁溶液或其他材料用于清洁设备和人员。非四聚体也可应用于已暴露于有机磷化合物的人类患者的皮肤和外衣。非四聚体也可以作为障碍物和密封剂用于化学战中军事服装和防毒面具的接缝和关闭处。
[0128]此外，生产规格一致的丁酰胆碱酯酶单体可增加下游化学过程如单体聚乙二醇化的有效性。聚乙二醇修饰通常能改善重组蛋白药代动力学和毒性性能，从而延长重组蛋白的半衰期。
[0129]3).产生编码突变体丁酰胆碱酯酶的核酸序列
[0130]野生型人丁酰胆碱酯酶氨基酸序列载于编号为6001625的美国专利，该专利还公开了在117位由组氨酸取代甘氨酸残基(定义为G117H)的突变体丁酰胆碱酯酶。该突变体丁酰胆碱酯酶已被证明对由有机磷化合物引起的失活特别耐受(Biochemistry36:786-795，1997)。许多在本领域已知的方法，如PCR，位点定向体外诱变技术，包括连接子插入，嵌套删除，连接子扫描，和寡核苷酸介导的诱变等，可用于在编码丁酰胆碱酯酶核酸序列引入突变。这类突变型丁酰胆碱酯酶，其催化性能，温度分布，稳定性，循环时间和与可卡因或其他底物及/或特定的有机磷化合物的亲和性可发生改变；其四聚体，二聚体或单体形成可增加或减少；或其它所需功能发生改变。在本发明中，可应用这些编码突变型丁酰胆碱酯酶的核酸序列。
[0131]一种优选的方法，如核酸序列或DNA的“混洗”(shuffling)，可产生重组编码突变型丁酰胆碱酯酶核酸序列的资料库，用于产生和识别突变型丁酰胆碱酯酶核酸序列。将所获资料库在一个合适的宿主细胞系表达以筛选和生产具有所需特性的突变型丁酰胆碱酯酶。
[0132]另一种优选的方法，如利用计算机模型进行分子动力学模拟(PNAS102:16656-16661,2005)，可用于模拟能更有效水解有机磷化合物的丁酰胆碱酯酶蛋白结构稳定优化环境，从而发现比野生型丁酰胆碱酯酶更有效催化有机磷化合物的突变型丁酰胆碱酯酶。
[0133]4).自然存在的丁酰胆碱酯酶变异体
[0134]丁酰胆碱酯酶编码基因在人类有四个主要的等位基因形式和其他25个与遗传缺陷有关的形式(见表1)。四个主要的等位基因形式为Eu，Ea, Ef和Es。Eu为野生具全功能的等位基因，含表型EuEu或UU。Ea等位基因被称为非典型丁酰胆碱酯酶，含纯合子表型(EaEa=AA)的人血清对大多数酶底物只有微弱反应，并显示对地布卡因抑制酶活性抵抗力增加。Ef等位基因也产生较弱酶活性，但呈现对氟化物抑制抵抗力增加。Es与缺乏酶活性(沉默)有关。
[0135]某些人群携带非典型丁酰胆碱酯酶编码基因，他们能正常水解乙酰胆碱，但不能水解一种常用麻醉剂，如琥珀酰胆碱。这个问题常见于一种非典型变异体Es，其中3-6%的白人人口为杂合子，约0.05%为纯合子。另一个变型体，El，导致纯合子血清丁酰胆碱酯酶催化活性完全缺失。携带非典型或沉默丁酰胆碱酯酶编码基因人群手术后可能发生呼吸暂停。因此，该类人群服用重组丁酰胆碱酯酶可减轻或防止长时间手术后呼吸暂停。
[0136]5).丁酰胆碱酯酶单体-人血清白蛋白融合蛋白
[0137]根据本发明生产的丁酰胆碱酯酶要实现血浆稳定性和较长半衰期的另一种方法是提供重组丁酰胆碱酯酶单体与人血清白蛋白(HSA)融合。该融合蛋白具有高血浆稳定性和全身均匀分布，具弱免疫原性或无免疫原性。例如，HSA可以通过一个含6个甘氨酸和I个丝氨酸的连接肽融合于丁酰胆碱酯酶N-末端或C-末端。
[0138]表1.人丁酰胆碱酯酶表型结构基础
[0139]
【权利要求】
1.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒从5’至3’，依次包括可操作性连接的以下元件: (i)绝缘体片段； (?)酪蛋白启动子或乳清酸性蛋白质(WAP)启动子序列； (iii)至少一个信号肽编码序列(如酪蛋白信号序列)，所述信号肽编码序列提供表达丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白分泌的信号肽； (iv)重组蛋白编码序列，所述编码序列编码丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体(截断型，不形成四聚体)，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白；和 (V)终止密码子； 并且，当所述表达盒整合入哺乳动物细胞后，经核移植使转基因哺乳动物乳腺表达并分泌丁酰胆碱酯酶全酶、或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白。
2.如权利要求1所述表达盒，其特征在于，所述的丁酰胆碱酯酶单体是缺失了野生型BCHE的C末端40个氨基酸残基的丁酰胆碱酯酶，即delC40-BCHE。
3.如权利要求1所述方法的表达盒，其特征在于，所述的丁酰胆碱酯酶或其融合蛋白选自下组: (i)氨基酸序列如SEQ ID N0.:1所示的重组人丁酰胆碱酯酶； (?)氨基酸序列如SEQ ID N0.: 2所示的重组人丁酰胆碱酯酶单体； (iii)氨基酸序列如SEQ ID N0.:3所示的重组人丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白。
4.如权利要求1所述方法的表达盒，其特征在于，所述的重组蛋白编码序列选自下组: (i)核苷酸序列如SEQ ID N0.: 4所示的重组人丁酰胆碱酯酶编码DNA序列； (?)核苷酸序列如SEQ ID N0.: 5所示的重组人丁酰胆碱酯酶单体编码DNA序列； (iii)核苷酸序列如SEQ ID N0.:6所示的重组人丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白编码DNA序列。
5.—种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求1所述表达盒。
6.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞中含有权利要求5所述的载体或染色体中整合有权利要求1所述表达盒。
7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞选自下组:乳腺上皮(MAC-T)细胞，胚胎成纤维细胞，胚胎干细胞，胚胎新生细胞，卵母细胞，或精子。
8.一种制备丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白的方法，其特征在于，包括步骤: (i)提供一转基因的非人哺乳动物动物，所述转基因非人哺乳动物的染色体中含有权利要求I所述表达盒，从而在泌乳期分泌含丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白的乳汁；和 (ii)从所述乳汁中分离所述的丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白。
9.一种乳汁原料，其特征在于，所述乳汁由非人哺乳动物分泌，并且所述乳汁中含有重组的丁酰胆碱酯酶单体或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白，其中所述乳汁中丁酰胆碱酯酶基本上以单体形式存在。
10.一种分离或纯化的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白选自丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白，并且所述的重组蛋白是用权利要求8所述方法制备的。
11.一种制造药物组合物的方法，其特征在于，该方法包括步骤: 将(i)权利要求10所述的分离或纯化的丁酰胆碱酯酶全酶，或丁酰胆碱酯酶单体，或丁酰胆碱酯酶单体-白蛋白融合蛋白，与(ii)药学上可接受的载体或赋形剂混合，从而形成药物组合物。
12.权利要求10所述的重组蛋白的用途，其特征在于，用于(i)制备预防和/或治疗有机磷中毒的药物；(ii)制备治疗手术后琥珀酰胆碱诱导的睡眠呼吸暂停的药物；(iii)制备治疗可卡因中毒的药物。
13.一种制备转基因非人哺乳动物的方法，其特征在于，包括步骤； (i)提供一含有权利要求1所述表达盒的载体或来自所述载体的含权利要求1所述表达盒的核酸片段； (ii)将上一步骤所述的载体或所述的核酸片段转入非人哺乳动物的细胞，获得经转染的细胞； (iii)从上一步骤的经转染的细胞中，选出染色体中整合有权利要求1所述表达盒的细胞，从而获得整合的细胞； (iv)将来自所述整合的细胞的细胞核转入去核卵母细胞，从而形成融合细胞； (v)将上一步骤的融合细胞或衍生自所述融合蛋白的胚胎转入雌性哺乳动物代孕体，从而导致该代孕母体分娩出转基因的非人哺乳动物； 其中，所述的细胞、卵母细胞和雌性哺乳动物属于同一物种。
【文档编号】A61P39/02GK103898101SQ201210583474
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月27日 优先权日:2012年12月27日
【发明者】黄跃进 申请人:南京杰蒙生物技术有限公司