表达禽类病原体的抗原的重组禽疱疹病毒3型(mdv血清型2型)载体及其用途

表达禽类病原体的抗原的重组禽疱疹病毒3型(mdv血清型2型)载体及其用途
【专利摘要】本发明提供了包含并表达禽类病原体的抗原的重组禽疱疹病毒3型(MDV-2)载体、包含突变型gC基因的重组禽疱疹病毒3型(MDV-2)载体、包含重组禽疱疹病毒3型(MDV-2)载体的组合物、包含重组禽疱疹病毒3型(MDV-2)载体和一种或多种野生型病毒或重组载体的多价疫苗。本发明还提供了接种抗多种禽类病原体的疫苗的方法和产生重组禽疱疹病毒3型(MDV-2)载体的方法。
【专利说明】表达禽类病原体的抗原的重组禽疱疹病毒3型（MDV血清型 2型）载体及其用途
[0001] 相关申请的夺叉参考
[0002] 本申请要求2011年11月30日提交的美国临时申请61/564, 877和2012年8月 30日提交的美国临时申请61/694, 957的优先权 发明领域
[0003] 本发明涉及用于插入和表达外来基因以用作保护免受多种病原体体感染的安全 免疫媒介物的重组病毒载体。其还涉及包含一种或多种重组病毒载体以用于保护免受多种 病原体感染的多价组合物或疫苗。本发明涉及制备和使用重组病毒载体的方法。
[0004] 发明背景
[0005] 家禽接种被广泛用于保护家禽群体免受破坏性疾病，包括新城疫疾病（ND)、传染 性法氏囊病（IBD)、马立克氏病（MD)、传染性支气管炎（IB)、传染性喉气管炎（ILT)和禽流 感（AI)。ND由属于副粘病毒科的禽副粘病毒1型（APMV-1)(也称为ND病毒（NDV))引发。 MD由也称为MD病毒血清型1 (MDV1)的鸡疱疹病毒2型（疱疹病毒科）引发。IB由属于冠 状病毒科的IB病毒（IBV)引发，ILT由也称为ILT病毒（ILTV)的鸡疱疹病毒1 (疱疹病毒 科）引发，AI由属于正粘病毒科的AI病毒（AIV)引发。
[0006] 许多重组禽病毒载体已被提出用于接种鸡以抗这些禽类病原体。使用的病毒载体 包含禽痘病毒，特别地鸡痘病毒（ΕΡ-Α-0, 517, 292)、马立克氏病毒例如血清型2和3(HVT) (W0-A-87/04463)或可选择地ITLV、NDV和禽腺病毒。当这些重组禽病毒载体中的一些用 于接种时，它们显示可见水平的保护作用。
[0007] 已开发和许可了表达来自不同病原体（美国专利No. 5, 980, 906, 5, 853, 733， 6, 183, 753, 5, 187, 087)(包括IBDV、NDV、ILTV和AIV)的抗原的几种火鸡重组疱疹病 毒（HVT，也称为吐绶鸡疱疹病毒1或MDV血清型3)载体。特别吸引人的是表达IBDV VP2保护基因的HVT载体，其已显示明确的优于经典IBD疫苗（Bublot等人J. Comp. Path. 2007,第137卷，S81-S84)的有利方面。其它目标HVT载体是表达NDV (Morgan等 人 1992, Avian dis. 36, 858-70)或 ILTV (Johnson 等人，2010Avian Dis54, 1251-1259)保 护性基因的载体。一起使用若干基于HVT的重组疫苗的实际问题之一是它们的干扰。当 将两种表达不同抗原的HVT重组体混合时针对至少一种疾病诱导更低的保护作用（Rudolf Heine2011 ；Issues of the Poultry Recombinant Viral Vector Vaccines which May Cause an Effect on the Economic Benefits of those Vaccines ;2011 年 8 月 14 日-18 日在Cancta，MexiC〇的第XVII届世界家畜兽医协会（WVPA)会议提供的论文；Slacrnn G, Hein R.和 Lynch P.,2009, The compatibility of HVT recombinants with other Marek's disease vaccines，第 58 届西方家禽疾病会议（Western Poultry Disease Conference)，Sacramento, CA，USA，3 月 23-25 日，p84)。
[0008] HVT和SB-1、鸡疱疹病毒3 (MDV血清型2或MDV-2)疫苗株的组合已显示对MD保 护作用的协同效果（Witter和Lee，1984, Avian Pathologyl3, 75-92)。为了说明干扰问题， 有益地将SB-1病毒评价为可与HVT载体相容并且改善MD保护作用的表达保护性抗原的疫 苗载体。
[0009] 克隆SB-ι基因组，在细菌人工染色体（BAC)中进行表征（Petherbridge， 等人，J. Virol. Methodsl58，ll-17,2009;Singh 等人，Research in Veterinary Science89, 140-145, 2010)。最近获得了 MDV2SB-1序列，并分析所述序列（Spatz和 Schat, Virus Gene42, 331-338, 2011)。SB-1 病毒的糖蛋白 E 缺失由 Petherbridge,等人 (J. Virol. Methodsl58, 11-17,2009)进行了描述。然而，未报导使用SB-1作为表达外来保 护性基因的病毒载体的研究。
[0010] 已显示队13蛋白激酶和糖蛋白C(UJ4)基因单个地是MDV在鸡中水平传播所必 需的（Jarosinski,等人，J. of Virology81, 10575-10587, 2007 ;Jarosinski,等人，J. of Virology84, 7911-7916, 2010)〇
[0011] 鉴于动物病原体例如NDV和IBDV对兽医公共健康和经济的潜在影响，因此需要有 预防感染和保护动物的高效方法。存在对用于制备可缓解在两种基于HVT的载体疫苗之间 观察到的干扰问题的组合的有效载体疫苗和适当的方法的解决方案的需要。
[0012] 发明概述
[0013] 本发明第一次显示了除了马立克氏病病毒以外还抗禽类病原体的重组禽疱疹病 毒-3型（MDV-2)病毒载体。
[0014] 本发明显示当将多价疫苗用于保护动物免受多种禽类病原体侵害时产生的令人 惊讶的结果。
[0015] 本发明涉及包含编码并表达禽类病原体的至少一个抗原的一个或多个异源多核 苷酸的重组禽疱疹病毒-3型（MDV-2)载体。本发明还涉及包含突变的糖蛋白C(gC)基因 的重组禽疱疹病毒-3型（MDV-2)载体。
[0016] 本发明提供了包含一种或多种重组禽疱疹病毒-3型（MDV-2)载体的组合物或疫 苗，所述载体包含编码并表达禽类病原体的至少一个抗原的一个或多个异源多核苷酸。本 发明还提供了包含一种或多种包含突变糖蛋白C(gC)基因的禽疱疹病毒3型（MDV-2)载体 的疫苗组合物。
[0017] 本发明提供了多价组合物或疫苗，所述组合物或疫苗包含：i)包含编码并表达 禽类病原体的至少一个抗原的异源多核苷酸，或包含突变糖蛋白C(gC)基因的重组禽疱 疹病毒-3型（MDV-2)载体；和ii)下述中至少一种：包含编码并表达禽类病原体的至少 一个抗原的异源多核苷酸的重组HVT载体（或MDV-3或吐绶鸡疱疹病毒-1)、或野生型 HVT(MDV-3)、或包含编码并表达禽类病原体的至少一个抗原的异源多核苷酸的重组MDV血 清型1型载体（即，MDV-1，禽疱疹病毒-2型）或任何野生型MDV-1。
[0018] 本发明涉及接种动物或诱导动物中免疫原性或保护性反应的方法，其包括本发明 的组合物或载体的至少一次施用。
[0019] 本发明还提供了用于将一个或多个分离的多核苷酸引入SB-ι基因组的非必需区 域的特定插入基因座。
[0020] 附图概述
[0021] 通过实例给出的并且无意将本发明限定于描述的特定实施方案的下列详细描述， 可结合附图（通过引用并入本文）来理解，其中：
[0022] 图1是显示被赋予每一个DNA和蛋白质序列的SEQ ID NO的表。
[0023] 图2描述SB-1基因组组织的示意图。
[0024] 图3描述表达NDV-F蛋白的重组vSBl-004病毒的免疫荧光染色。
[0025] 图4描述引物结合位点的图示。
[0026] 图5显示鉴定vSBl-004的PCR结果。
[0027] 图6显示表达NDV-F蛋白的重组vSBl-006病毒的免疫荧光染色。
[0028] 图7描述vSBl-006上的引物结合位点的图示。
[0029] 图 8 显示 vSBl-006 的 PCR 结果。
[0030] 图9描述表达NDV-F蛋白的重组SB1-007病毒的免疫荧光染色。
[0031] 图10描述pSB144cds SVOptF供体质粒上的引物位置的示意图。
[0032] 图 11 显示 vSBl-007 的 PCR 结果。
[0033] 图12描述表达NDV-F蛋白的重组SB1-008病毒的免疫荧光染色。
[0034] 图13描述引物结合位点的图示。
[0035] 图 14 显示 vSBl-008 的 PCR 结果。
[0036] 图15描述来自vSBl-009感染细胞的免疫沉淀样品的Western印迹分析。
[0037] 图16描述vHVTl 14的免疫沉淀和Western印迹。
[0038] 图17描述抗CA02和ZJ1NDV攻击的重组体的临床分析（脱落攻击病毒的鸡的百 分比）。
[0039] 图18描述了抗NDV攻击的重组体的临床分析（口咽脱落）。
[0040] 图19显示序列比对和序列同一性百分比。
[0041 ] 图20显不DNA和蛋白质序列。
[0042] 发明详沭
[0043] 应指出在本公开内容中，特别地在权利要求中，术语例如"包含"、"包括"、"含有" 等可具有美国专利法中的含义；例如，可意指"包括"、"包含的"、"含有"等；术语例如"基本 上由……组成"和"基本上由……组成"具有它们在美国专利法中的含义，例如，它们允许包 括未明确引述的元素，但不包括在现有技术中发现的或影响本发明的基本或新型特征的元 素。
[0044] 除非另外指出，否则根据常规惯用法使用技术术语。分子生物学中的一 般术语的定义可见于 Benjamin Lewin, Genes V.由 Oxford University Press 出 版，1994(ISBN0-19-854287-9) ;Kendrew 等人（编辑·），The Encyclopedia of Molecular Biology,由 Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN0-632-02182-9);和 Robert A. Meyers (编辑),Molecular Biology and Biotechnology ：a Comprehensive Desk Reference,由 VCH Publishers, Inc.出版，1995 (ISBN1-56081-569-8)。
[0045] 除非上下文明确地另有所指，否则单数术语"一个/ 一种（a) "、"一个/ 一种（an) " 和"所指物（the)"包括复数形式。类似地，除非明确地另有所指，否则单词"或"意欲包括 "和"。单词"或"意指特定列表的任一个成员，并且还包括该列表的成员的任意组合。
[0046] 术语"动物"在本文中用于包括所有哺乳动物、鸟类和鱼。本文中使用的动物可选 自马科动物（例如，马）、犬科动物（例如，狗、狼、狐狸、草原狼、豺）、猫科动物（例如，狮子、 老虎、家猫、野猫、其它大型猫，和其它猫科动物包括猎豹和山猫）、牛族动物（例如，牛）、猪 类（例如，猪）、羊类（例如，绵羊、山羊、羊驼、野牛）、禽类（例如，鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌_、雉 鸡、鹦鹉、雀、鹰、乌鸦、驼鸟、鸸鹋和鹤鸵）、灵长类动物（例如，狐猴、跗猴、猴子、长臂猿、人 猿）、人和鱼。术语"动物"还包括处于所有发育阶段包括胚胎期和胎儿期中的个体动物。
[0047] 术语"多肽"和"蛋白质"在本文中可互换使用，表示连续氨基酸残基的多聚体。
[0048] 术语"核酸"、"核苷酸"和"多核苷酸"可互换使用，并且意指RNA、DNA、cDNA或cRNA 及其衍生物，例如包含修饰主链的那些核酸。应当理解，本发明提供了包含与本文中描述的 序列互补的序列的多核苷酸。本发明中涉及的"多核苷酸"包括正向链（5'至3'）和反向 互补链（3'至5'）。根据本发明的多核苷酸可以以不同的方式（例如通过化学合成，通过 基因克隆等）来制备，并且可采取不同的形式（例如，线性的或分支的、单链或双链的，或其 杂合体、引物、探针等）。
[0049] 术语"基因组DNA"或"基因组"可互换使用，意指宿主生物的可遗传的遗传信息。 基因组DNA包括细胞核的DNA(也称为染色体DNA)还包括质体（例如，叶绿体）以及其它细 胞器（例如，线粒体）的DNA。本发明中涉及的基因组DNA或基因组还指病毒的RNA。RNA 可以是正链或负链RNA。本发明中涉及的术语"基因组DNA"包括包含与本文中描述的序列 互补的序列的基因组DNA。术语"基因组DNA"还指信使RNA(mRNA)、互补DNA(cDNA)和互补 RNA(cRNA)。
[0050] 术语"基因"被广泛用于指与生物功能相关的多核苷酸的任意区段。因此，基因或 多核苷酸包括内含子和外显子（如在基因组序列中）或仅编码序列（如在cDNA中），例如开 放阅读框架（0RF)，其始于起始密码子（甲硫氨酸密码子）并终于终止信号（终止密码子）。 基因和多核苷酸还可包括调节它们的表达例如转录起始、翻译和转录终止的区域。因此，还 包括的是启动子和核糖体结合区域（一般地，这些调控元件位于编码序列或基因的起始密 码子上游约60至250个核苷酸处；Doree S Μ等人；Pandher K等人；Chung J Y等人）、转 录终止子（一般地，终止子位于编码序列或基因的终止密码子下游约50个核苷酸内；Ward C K等人）。基因或多核苷酸还指表达mRNA或功能性RNA或编码特定蛋白质的核酸片段， 其包括调控序列。
[0051] 如本文中所用，术语"异源DNA"是指来源于不同生物，例如不同细胞类型或与受体 不同的物种的DNA。该术语还指宿主DNA的相同基因组上的DNA或其片段，其中异源DNA被 插入基因组内与其原始位置不同的区域中。
[0052] 如本文中所用，术语"抗原"或"免疫原"意指诱导宿主动物的特异性免疫反应的 物质。抗原可包括完整生物体、杀死的、减毒的或活的；生物体的亚单位或部分；包含具有 免疫原性性质的插入物的重组载体；能够在呈递至宿主动物后诱导免疫反应的DNA碎片或 片段；多肽、表位、半抗原或其任意组合。或者，免疫原或抗原可包括毒素或抗毒素。
[0053] 如本文中所用，术语"免疫原性蛋白或肽"包括在一旦给宿主施用后，其能够引发 针对该蛋白质的体液和/或细胞类型的免疫反应的意义上具有免疫活性的多肽。优选，蛋 白质片段是这样的片段，该片段具有与整个蛋白质大体上相同的免疫活性。因此，根据本 发明的蛋白质片段包括至少一个表位或抗原决定簇或基本上由其组成或由其组成。如本 文中所用，"免疫原性"蛋白质或多肽包括蛋白质的全长序列、其类似物或其免疫原性片 段。"免疫原性片段"意指包括一个或多个表位，从而引发上述免疫反应的蛋白质片段。这 样的片段可使用本领域内已知的许多表位作图技术来鉴定。参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,第 66 卷（Glenn E. Morris, Ed. , 1996)〇 例如，线性表位可通过例如在固体载体上同时合成大量肽（所述肽对应于该蛋白质分子的 部分），并且使肽与抗体反应（同时肽仍然连接于载体上）来测定。这样的技术在本领域 中是已知的并且描述于例如美国专利No. 4, 708, 871中。类似地，构象表位可通过测定氨基 酸的空间构象（例如通过例如X射线晶体学和二维核磁共振）来容易地鉴定。参见，例如， Epitope Mapping Protocols (同上）。
[0054] 术语"免疫原性蛋白或肽"还涉及序列的缺失、添加和置换，只要多肽能够产生本 文中定义的免疫反应即可。术语"保守改变"意指用另一个生物学上相似的残基进行氨基 酸残基的替换或核酸序列中核苷酸的替换使得编码的氨基酸残基不改变或为另一个生物 学上相似的残基。在这一点上，特别优选的置换通常是性质保守的，即在氨基酸的家族内发 生的那些置换。例如，氨基酸通常被分成4个家族：（1)酸性一天冬氨酸和谷氨酸；（2)碱 性一赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性一丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯 丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和（4)不带电荷的极性一甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨 酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被分类为芳香族氨基酸。保守 改变的实例包括一个疏水残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸对另一个疏水残 基的置换或一个极性残基对另一个极性残基的置换，例如精氨酸对赖氨酸的置换、谷氨酸 对天冬氨酸或谷氨酰胺对天冬酰胺的置换等；或对生物活性不会具有主要影响的结构上相 关的氨基酸对氨基酸的相似保守替换。因此，具有与参照序列大体上相同的氨基酸序列但 具有大体上不影响蛋白质的免疫原性的少数氨基酸置换的蛋白质在参考多肽的定义之内。 所有由这些修饰产生的多肽包括在本文中。术语〃保守改变〃还包括使用取代的氨基酸替 代未取代的亲代氨基酸，只要针对被取代的多肽产生的抗体也与未被取代的多肽发生免疫 反应。
[0055] 术语〃表位〃是指特定B细胞和/或T细胞对其反应的抗原或半抗原上的部位。 该术语还可与〃抗原决定簇〃或〃抗原决定部位〃互换使用。识别相同表位的抗体可在显 示一种抗体阻断另一种抗体对靶抗原的结合的能力的简单免疫测定中被鉴定。
[0056] 对组合物或疫苗的〃免疫反应〃是宿主中针对目标组合物或疫苗的细胞和/或抗 体介导的免疫反应的发展。通常地，"免疫反应〃包括但不限于下列效应中的一个或多个： 特异性针对目标组合物或疫苗中包含的抗原的抗体、B细胞、辅助T细胞和/或细胞毒性T 细胞的产生。优选地，宿主将显示治疗性或保护性免疫反应，从而对新感染的抗性得到增强 和/或疾病的临床严重性减轻。这样的保护作用可通过通常由被感染宿主显示的症状的减 轻或不存在、被感染宿主的更快恢复时间和/或更低病毒滴度来显示。
[0057] 术语"重组的"和"遗传修饰的"可互换使用，意指多核苷酸或蛋白质在其天然形 式或结构上的任何修饰、改变或工程化，或多核苷酸或蛋白质在其天然环境或周围事物上 的任何修饰、改变或工程化。多核苷酸或蛋白质的修饰、改变或工程化可包括但不限于一 个或多个核苷酸或氨基酸的缺失、整个基因的缺失、基因的密码子最优化、氨基酸的保守置 换、一个或多个异源多核苷酸的插入。
[0058] 术语"多价疫苗或组合物"、"组合或复合（combo)疫苗或组合物"和"多价疫苗或 组合物"可互换用于指包含超过一种组合物或疫苗的组合物或疫苗。多价疫苗或组合物可 包含2、3、4或更多种组合物或疫苗。多价疫苗或组合物可包含重组病毒载体、活性或减毒 或杀死的野生型病毒或重组病毒载体与以活性或减毒的或杀死的形式存在的野生型病毒 的混合物。
[0059] 本发明的一个实施方案提供了包含突变的糖蛋白C(gC或UL44)基因的重组禽疱 疹病毒3型（MDV-2)载体。术语"突变的gC基因"是指被改变或工程化（所述改变或工程 化导致在表达后产生无功能的gC蛋白）的禽疱疹病毒3型（MDV-2)的gC基因。gC基因的 改变或工程化包括为功能性gC蛋白的表达所必需的gC基因区段的突变或缺失。术语"突变 的gC基因"还包括其中gC蛋白不被表达的禽疱疹病毒3型（MDV-2)完整gC基因的缺失。 本发明的另一个实施方案提供了重组禽疱疹病毒3型（MDV-2)，其中天然（野生型）禽疱 疹病毒3型（MDV-2)基因组的编码gC蛋白的糖蛋白C(gC)被缺失。术语"糖蛋白C(gC)基 因"包括编码禽疱疹病毒3型（MDV-2)的糖蛋白C(gC)及其同源物、片段或变体的任何基因 或多核苷酸。gC基因可编码与SEQ ID N0:35具有至少75%、80%、85%、90%、95%、95%、 96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或 99. 9%的序列同一性的gC蛋白或其变体。与SEQ ID N0:34具有至少75%、80%、85%、 90%,95%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 1%,99. 2%,99. 3%,99. 4%,99. 5%,99. 6%, 99. 7 %、99. 8 %或99. 9 %的序列同一性的gC基因也包括在本发明中。
[0060] 本发明的另一个实施方案提供了重组禽疱疹病毒3型（MDV-2)病毒载体，其包含 编码并表达禽类病原体的至少一个抗原或多肽的一个或多个异源多核苷酸。用于重组病毒 载体的禽疱疹病毒3型（MDV-2)株可以是任意SB-1株，包括但不限于商业马立克氏病疫苗 (SB-1 疫苗）（Merial Select Inc.，Gainesville, GA30503, USA)、具有如由 GenBank 登录号 HQ840738. 1定义的基因组序列的SB-1株。用于重组病毒载体的禽疱疹病毒3型（MDV-2) 株可以是任何其它禽疱疹病毒3型分离株，包括具有如由GenBank登录号AB049735. 1定义 的基因组序列的HPRS24株，或具有如由GenBank登录号NC_002577. 1定义的基因组序列 的HPRS24株。HPRS24与SB-1的基因组共有98. 4%的序列同一性（Spatz和Schat, 2011 ; Virus Gene42, 331-338)。用于该重组病毒载体的禽疱疹病毒3型（MDV-2)株可以是由 Witter (1987Avian Dis31, 752-765)或由 Witter 等人（1987Avian Dis31, 829-840)描述的 301B/1分离株。禽疱疹病毒3型（MDV-2)株可以是任何禽疱疹病毒3型（MDV-2)株，所述 株包含与如 GenBank 登录号 HQ840738. 1 (SEQ ID N0:14)、ΑΒ049735· 1 或 NC_002577. 1 中定 义的序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一 性的基因组序列。
[0061] 编码抗原或多肽的基因可以是编码如下蛋白的那些基因：新城疫病毒融合蛋白 (NDV-F)、新城疫病毒血细胞凝集素神经氨酸酶（NDV-HN)、马立克氏病病毒糖蛋白C(gC)、 马立克氏病病毒糖蛋白B(gB)、马立克氏病病毒糖蛋白E(gE)、马立克氏病病毒糖蛋白 I(gl)、马立克氏病病毒糖蛋白H(gH)或马立克氏病病毒糖蛋白L(gL)、IBDVVP2、IBDV VPX、 IBDV VP3、IBDV VP4、ILTV糖蛋白 B、ILTV糖蛋白 I、ILTV UL32、ILTV糖蛋白 D、ILTV糖蛋白 E、 ILTV糖蛋白C、流感血凝素（HA)、流感神经氨酸酶（ΝΑ)、来源于鸡败血支原体（Mycoplasma gallisepticum) (MG)或滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae) (MS)的保护性基因或其组 合。抗原或多肽可以是来自家禽病原体的任何抗原，所述病原体选自禽脑脊髓炎病毒、禽 呼肠孤病毒、禽副粘病毒、禽偏肺病毒、禽流感病毒、禽腺病毒、鸡痘病毒、禽冠状病毒、禽 轮状病毒、鸡贫血病毒、禽星状病毒、禽细小病毒、球虫病病毒（艾美球虫属的种（Eimeria sp.))、弯曲杆菌属的种（Campylobacter sp.)、沙门菌属的种（Salmonella sp.)、巴斯德菌 属的种（Pasteurella sp.)、禽杆菌属的种（Avibacterium sp.)、鸡败血支原体、滑液囊支 原体（Mycoplasma synoviae)、梭菌属的种（Clostridium sp)和大肠杆菌（E.coli)。
[0062] 此外，上述抗原或多核苷酸的同源物意欲在本发明的范围内。如本文中所用，术语 "同源物"包括直系同源物、类似物和旁系同源物。术语"类似物"是指具有相同或相似功 能，但已在无关生物中分开进化的两个多核苷酸或多肽。术语"直系同源物"是指来自不同 物种、但已通过物种形成从共同祖先基因进化而来的两个多核苷酸或多肽。通常地，直系同 源物编码具有相同或相似功能的多肽。术语"旁系同源物"是指通过基因组内的复制而相 关的两个多核苷酸或多肽。旁系同源物通常具有不同功能，但这些功能可以相关。野生型 多肽的类似物、直系同源物和旁系同源物可与野生型多肽在翻译后修饰、氨基酸序列或两 者方面有差异。具体地，本发明的同源物通常显示与上述抗原的多核苷酸或多肽序列的全 部或部分有至少 80-85%、85-90%、90-95%或95%、96%、97%、98%、99%的序列同一性， 并且可显示相似的功能。
[0063] 在一个实施方案中，本发明提供了包含编码和表达NDV-F抗原或多肽的1个、2个 或更多个异源多核苷酸的重组禽疱疫病毒-3型（MDV-2)病毒载体。在该实施方案的一个方 面，NDV-F抗原或多肽与具有SEQ ID N0:2、9、50、52或54所示序列的多肽或这些多肽之一 的保守变体、等位基因变体、同源物或包含所述多肽的至少8个或至少10个连续氨基酸的 免疫原性片段或这些多肽的组合具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、 98%或99%的序列同一性。在该实施方案的另一个方面，异源多核苷酸编码与具有SEQ ID N0:2、9、50、52 或 54 所示序列的多肽具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、 97%、98 %或99%的序列同一性的NDV-F抗原或多肽。在该实施方案的另一个方面，异源多 核苷酸与具有SEQ ID N0:l、8、49、51或53所示序列的多核苷酸具有至少70%、75%、80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%的序列同一性。
[0064] 变体包括等位基因变体。术语〃等位基因变体〃是指包含导致蛋白质的氨基酸序 列的变化并且存在于天然群体（例如，病毒的种或变种）内的多态性的多核苷酸或多肽。这 样的天然等位基因变异通常可导致多核苷酸或多肽内1-5%的变异。等位基因变体可通过 对许多不同物种的目标核酸序列进行测序来鉴定，这可通过使用杂交探针鉴定那些物种中 相同基因的基因座来容易地进行。作为天然等位基因变异的结果并且不改变目标基因的功 能活性的任何和所有这样的核酸变异和所得的氨基酸多态性或变异意欲包括在本发明的 范围内。
[0065] 关于序列的术语"同一性"可指例如具有相同核苷酸或氨基酸的位置数目除以 两个序列中更短序列内的核苷酸或氨基酸数目，其中两个序列的比对可按照Wilbur和 Lipman的算法（Wilbur和Lipman)来测定。两个氨基酸序列的序列同一丨生或序列相似性或 者两个核苷酸序列之间的序列同一性可使用Vector NTI软件包（Invitrogen, 1600Faraday Ave.，Carlsbad，CA)来测定。当RNA序列被认为是与DNA序列相似的或与其具有一定程度 的序列同一性或同源性时，该DNA序列中的胸腺嘧啶（T)被认为等同于RNA序列中的尿嘧 啶（U)。因此，RNA序列包括在本发明的范围内并且可来源于DNA序列，其中DNA序列中的 胸腺嘧啶⑴被认为等同于RNA序列中的尿嘧啶（U)。
[0066] 本公开内容的多核苷酸包括作为遗传密码的结果（例如对于特定宿主的最优化 密码子选择）是简并的序列。如本文中所用，"最优化的"是指经遗传工程改造以增加其在 给定物种中的表达的多核苷酸。为了提供编码NDV-F多肽的最优化的多核苷酸，NDV-F蛋 白基因的DNA序列可被修饰来1)包含在特定物种中高度表达的基因所偏好的密码子；2) 以与大体上在所述物种中发现的核苷酸碱基组成相似的核苷酸碱基组成包含A+T或G+C含 量；3)形成所述物种的初始序列；或4)消除引起RNA的去稳定作用、不适当的多聚腺苷酸 化、降解和终止或形成二级结构发夹或RNA剪接位点的序列。NDV F蛋白在所述物种中的增 加表达可通过使用真核生物和原核生物中或特定物种中的密码子用法分布频率来实现。术 语"偏好密码子用法的频率"是指由特定宿主细胞在核苷酸密码子的使用中显示的指定给 定氨基酸的偏好性。存在20种天然氨基酸，其大部分由超过一个密码子指定。因此，所有 简并核苷酸序列包括在本公开内容中，只要由所述核苷酸序列编码的NDV-F多肽的氨基酸 序列在功能上不被改变即可。
[0067] 在另一个实施方案中，本发明提供了用于产生重组禽疱疫病毒_3型或SB-1病毒 载体的方法，包括将1、2或更多个分离的多核苷酸在SB-1基因组的非必需区域中引入SB-1 基因组。在另一个实施方案中，本发明提供了用于产生重组禽疱疹病毒-3型或SB-1病毒 载体的方法包括改变、工程化gC基因或从SB-1基因组缺失gC基因。术语"非必需区域" 是指不是病毒在组织培养物或在鸡中复制和繁殖所必需的病毒基因组区域。可将任何非 必需区域或其部分从SB-1基因组缺失或可将任何外来序列插入其中，因缺失或插入而产 生的重组禽疱疹病毒-3型或SB-1载体的活力和稳定性可用于确定被缺失区域或其部分 是否确实是非必需的。在该实施方案的一个方面，非必需区域位于SB-1基因组的独特长 (UL)和独特短（US)区域中（参见 Spatz 等人，Virus Genes42:331-338,2011)。SB-1 的 UL区域在长度上为约109,744bp至约109,932bp，并且可从SEQ ID N0:14(GenBank登录号 即840738.1)的位置12,209延伸至121，952或其它581-基因组的等同位置，例如册1?24 基因组的11，826bp至121，757bp。SB-1的US区域在长度上为约12, 109bp至约12, 910bp， 并且可从 SEQ ID NO: 14(GenBank 登录号 HQ840738. 1)的位置 143, 514 延伸至 156, 423 或 其它SB1-基因组的等同位置，例如从HPRS24基因组的142,681bp至154,789bp(Spatz 等人，2011)。在该实施方案的一个方面，非必需区域位于SB-1的独特长（UL)区域中的 UL550RF与L0RF50RF之间。在另一个方面，将多核苷酸插入SB-1糖蛋白C基因（也称为 UL44)内或替代其。gC基因座的使用可允许产生不能生产功能性gC蛋白和不能被水平传播 的重组病毒。在另一个实施方案中，非必需区域可存在于UL7与UL8之间、UL21与UL22之 间、UL40与UL41之间、UL50与UL51之间、UL54与L0RF4之间、US10与S0RF4之间的基因间 区域中，或UL43、US2、US10或US6(编码gD)基因（参见GenBank登录号HQ840738.1)内。在 另一个实施方案中，非必需区域可存在于SEQ ID N0:14的核苷酸位置118057-118306(基 因间 UL55-L0RF5)、98595-100031(gC 或 UL44)、25983-26038(基因间 UL7-UL8)、 49865-50033 (基因间 UL21-UL22)、75880-75948 (基因间 UL35-UL36)、93928-93990 (基因 间 UL40-UL41)、109777-109847 (基因间 UL50-UL51)、116466-116571 (基因间 UL54-L0RF4)、 146548-146697(基因间 US10-S0RF4)、97141_98385(UL43)、147857-148672 (US2)、 145853. · 146548 (US10)或 150322-151479 (gD 或 US6)的区域中。
[0068] 重组病毒的构建在本领域中是公知的，如例如美国专利No. 4, 769, 330、 4,722,848、4,603，112、5，174,993和 5,756，103、6,719,979 中描述的。具体地，可在两个步 骤中构建重组禽疱疹病毒-3型（MDV-2)病毒载体。第一，将禽疱疹病毒-3型（MDV-2)或 插入位点侧翼的SB-1基因组区域克隆入大肠杆菌（E. coli)质粒构建体；将独特的限制位 点置于两个侧翼区域（插入质粒）之间以允许供体表达盒DNA的插入。单独地，待插入的 cDNA或DNA基因序列位于对于禽疱疹病毒-3型（MDV-2)或SB-1载体和/或真核细胞特 异性的启动子区域（基因起始区域）和终止子（或多聚腺苷酸化，poly-Α)序列之后。随 后将完整表达盒（启动子-外来基因-poly-A)插入所述插入质粒的独特限制位点，以构建 "供体质粒"，所述供体质粒包含侧翼连接有插入基因座侧翼的禽疱疹病毒-3型（MDV-2)或 SB-1 "臂"的表达盒。随后通过在大肠杆菌细菌中生长来扩增所得的供体质粒构建体，提取 质粒DNA。随后使用切割质粒骨架（在禽疱疹病毒-3型（MDV-2)或SB-1的臂和表达盒的 外部）的限制性内切酶线性化该质粒。随后用亲代禽疱疹病毒-3型（MDV-2)或SB-1DNA 和线性化供体质粒DNA共转染鸡胚成纤维细胞。随后通过多个有限稀释步骤克隆所得的病 毒群体，在所述步骤中将表达外来基因的病毒与不表达的病毒群体分离。类似地，可将另一 个外来盒插入另一个插入基因座以产生表达两个基因的双重禽疱疹病毒-3型（MDV-2)或 SB-1重组体。可将第二盒插入相同基因座。与亲代禽疱疹病毒-3型（MDV-2)或SB-1MD疫 苗类似地，在原代鸡胚成纤维细胞中产生禽疱疹病毒-3型（MDV-2)或SB-1重组体。在温 育后，收获感染的细胞，将其与冷冻培养基混合，从而允许感染的细胞存活，通常将其冷冻 于冷冻小瓶或玻璃安瓿中并于液氮中贮藏。
[0069] 插入的cDNA基因序列被修饰的感染性病毒成功表达需要两个条件。首先，必须将 插入引入病毒基因组的区域以使被修饰病毒保持活力。表达插入的cDNA的第二个条件是 允许基因在病毒背景中表达的调控序列（例如：启动子、增强子、供体和受体剪接位点和内 含子、Kozak翻译起始共有序列、多聚腺苷酸化信号、非翻译序列元件）的存在。
[0070] -般而言，有利地使用在真核细胞中具有功能的强启动子。启动子包括但不限于 立即早期巨细胞病毒（CMV)启动子、豚鼠 CMV启动子、SV40启动子、假性狂犬病毒启动子 例如糖蛋白X启动子、单纯疱疹病毒-1的启动子例如α 4启动子、马立克氏病病毒（包括 MDV-UMDV-2和HVT)启动子例如驱动糖蛋白gC、gB、gE或gl表达的启动子、感染性喉气管 炎病毒启动子例如糖蛋白gB、gE、gl、gD基因的启动子或其它疱疹病毒启动子。当插入基 因座由SB-1基因（例如，gC、gD、US2或US10基因）组成时，可将外来基因插入不具有另外 的启动子序列的载体，因为载体的被缺失基因的启动子将驱动被插入的外来基因转录。
[0071] 在一个实施方案中，本发明涉及药物组合物或疫苗，其包含本发明的一个或多 个重组禽疱疹病毒-3型（MDV-2)病毒载体和药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、 媒介物或佐剂。用于重组禽疱疹病毒-3型病毒载体的禽疱疹病毒3型（MDV-2)株可以 是任何SB-1株、HPSR24株或301B/1株。禽疱疹病毒-3 (MDV-2)株还可包括Witter等 人（Avian Diseases34, 944-957; 1990)、Witter(Avian Pathology21, 601-614, 1992)和 WUter(Avian Pathology24, 665-678, 1995)中描述的那些株：280-5/l、281MI/l、287C/l、 298B/1、301A/1、401/1、437A/1、437B/1、468A/1、468A/2、468B/1、471B/1 或 HN-1/1。
[0072] 在另一个实施方案中，本发明提供了组合物或疫苗，其包含：i)包含编码并表达 禽类病原体的至少一个抗原的异源多核苷酸的重组禽疱疹病毒-3型载体（MDV-2);和ii) 下述中至少一种：包含编码并表达禽类病原体的至少一个抗原的异源多核苷酸的重组HVT 载体（或MDV-3或吐绶鸡疱疹病毒-1型）、或野生型MDV-3、或包含编码并表达禽类病原体 的至少一个抗原的异源多核苷酸的重组MDV-1载体（或禽疱疹病毒-2型）或野生型MDV-1。 组合物或疫苗中还可包含药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、媒介物或佐剂。该组合 物还可包含重组鸡痘病毒载体，其包含编码并表达禽类病原体的至少一个抗原的异源多核 苷酸；或野生型鸡痘病毒。
[0073] 在该实施方案的一个方面，组合物或疫苗包含一种（或多种）重组禽疱疹病毒-3 型（MDV-2)载体和一种或多种野生型HVT(MDV-3)。在另一个方面，组合物或疫苗包含一种 (或多种）重组禽疱疹病毒-3型（MDV-2)载体和一种或多种重组HVT(MDV-3)。在另一个 方面，组合物或疫苗包含一种或多种重组禽疱疹病毒-3型（MDV-2)载体和一种或多种野生 型或遗传修饰型MDV-1。在另一个方面，组合物或疫苗包含一种或多种重组禽疱疹病毒-3 型（MDV-2)载体和一种或多种重组MDV-1。在另一个方面，组合物或疫苗包含一种或多种 重组禽疱疹病毒-3型（MDV-2)载体、一种或多种野生型HVT(MDV-3)以及一种或多种野生 型MDV-1。在另一个方面，组合物或疫苗包含一种或多种重组禽疱疹病毒-3型（MDV-2)载 体、一种或多种重组HVT(MDV-3)以及一种或多种野生型MDV-1。在另一个方面，组合物或 疫苗包含一种或多种重组禽疱疹病毒-3型（MDV-2)载体、一种或多种野生型HVT(MDV-3) 以及一种或多种重组MDV-1。在另一个方面，组合物或疫苗包含一种或多种重组禽疱疹病 毒-3型（MDV-2)载体、一种或多衙重组HVT(MDV-3)以及一种或多种重组MDV-1。野生 型HVT(MDV-3)或野生型MDV-1可以是活的、减毒的或遗传修饰的。重组禽疱疹病毒-3型 (MDV-2载体、重组HVT (MDV-3)载体和重组MDV-1载体中的异源多核苷酸可编码来自相同或 不同禽类病原体的相同或不同抗原。
[0074] 药学上或兽医学上可接受的载体或佐剂或媒介物或赋形剂对于本领域技术人员 来说是公知的。例如，药学上或兽医学上可接受的载体或佐剂或媒介物或赋形剂可以是用 于MD疫苗的马立克氏病疫苗稀释剂。可用于本发明的方法的其它药学上或兽医学上可接 受的载体或佐剂或媒介物或赋形剂包括但不限于〇. 9% NaCl (例如，盐水）溶液或磷酸盐 缓冲液、多聚-(L-谷氨酸）或聚乙烯吡咯烷酮。药学上或兽医学上可接受的载体或媒介物 或赋形剂可以是有利于载体（或从本发明的载体体外表达的蛋白质）的施用或有利于载体 (或蛋白质）的转染或感染和/或改善其保存的任何化合物或化合物的组合。剂量和剂量 体积在本文一般描述中进行了论述，其还可由本领域技术人员根据本公开内容结合本领域 的知识来确定，而无需任何过度的实验。
[0075] 任选地可添加其它化合物作为药学上或兽医学上可接受的载体或佐剂或媒 介物或赋形剂，包括但不限于明矾；CpG寡核苷酸（0DN)，特别地0DN2006、2007、2059 或 2135 (Pontarollo R.A.等人，Vet. Immunol. Immunopath，2002,84 :43-59 ;Wernette C. M.等人，Vet. Immunol. Immunopath, 2002, 84 :223-236 ;Mutwiri G.等人，Vet. Immunol. Immunopath, 2003, 91 :89-103) ;polyA_polyU，二甲基双十八烧基溴化铵（DDA) ( "Vaccine Design The Subunit and AdjuvantApproach，'，由 Michael F. Powell 和 Mark J. Newman 编 辑的，Pharmaceutical Biotechnology, 6 :ρ· 03, p. 157) ;N, N-双-十八烧基-N，，N，-双 (2-羟乙基）丙二胺（例如,4VR丨rMNDi') (Ibid，p. 148);卡波姆、壳聚糖（参见例如美 国专利系列No. 5, 980. 912)。
[0076] 根据本发明的药物组合物和疫苗可包含一种或多种佐剂或基本上由一种或多种 佐剂组成。用于实施本发明的适当佐剂为（1)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、马来酸酐 和烯基衍生物的聚合物，（2)免疫刺激序列（ISS)例如具有一个或多个非甲基化CpG单 位的寡脱氧核糖核苷酸序列（Klinman等人，1996;W098/16247)，（3)水包油乳剂，例如在 由 M.Powell，M. Newman, Plenum Pressl995 出版的"Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach"的第147页上描述的SPT乳剂，和相同著作的第183页上描述的乳剂 MF59 ; (4)包含季铵盐例如，DDA的阳离子脂质，（5)细胞因子，（6)氢氧化铝或磷酸错，（7) 皂苷或⑶在引用的和通过引用并入本申请中的任何文献中论述的其它佐剂或（9)其任意 组合或混合物。
[0077] 本发明的另一个方面涉及用于诱导动物中抗一种或多种抗原的免疫反应或者动 物中抗一种或多种禽类病原体的保护性反应的方法，所述方法包括用本发明的疫苗或药物 组合物接种动物至少一次。本发明的另一个方面涉及用于诱导动物中针对一种或多种抗原 的免疫反应，或在初免-加强施用方案中诱导动物中抗一种或多种禽类病原体的保护性反 应的方法，所述方法包括使用至少一种常用多肽、抗原、表位或免疫原的至少一次初始施用 和至少一次加强施用。初始施用中使用的免疫组合物或疫苗可以相同，可在性质上与用作 加强剂的免疫组合物或疫苗不同。
[0078] 禽类病原体可以是新城疫病毒（NDV)、传染性法氏囊病病毒（8卩，IBDV或禽肾病病 毒）、马立克氏病病毒（MDV)、传染性喉气管炎病毒（ILTV)、禽脑脊髓炎病毒和其它微小核 醣核酸病毒、禽呼肠孤病毒、禽副粘病毒、禽偏肺病毒、禽流感病毒、禽腺病毒、鸡痘病毒、禽 冠状病毒、禽轮状病毒、禽细小病毒、禽星状病毒和鸡贫血病毒球虫病（艾美球虫属的种）、 弯曲杆菌属的种、沙门菌属的种、鸡败血支原体、滑液囊支原体、巴斯德菌属的种、禽杆菌属 的种、大肠杆菌和梭菌属的种。
[0079] 通常地，在1日龄时通过皮下或肌内途径进行疫苗的一次施用，或在17-19日龄胚 胎中通过卵内途径进行疫苗的一次施用。第二次施用可在第一个10日龄内进行。动物优 选在第一次施用时为至少17日胚胎或1日龄。
[0080] 在0日龄鸡中可以例如皮下或肌内、皮内、经皮肤地使用多种施用途径。可在羊膜 囊和/或胚胎中进行卵内接种。商购可得的卵内和SC施用装置可用于接种。
[0081] 本发明现通过下列非限定性实施例来进一步描述。 实施例
[0082] 使用由 J. Sambrook 等人（Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989)描述的标准 分子生物学技术进行DNA插入物、质粒和重组病毒载体的构建。
[0083] 实施例1表达NDV-F的重组vSBl-004的构建
[0084] 本工作的目的是构建重组SB-1病毒，其中将包含小鼠巨细胞病毒（mCMV)启动子、 新城疫病病毒融合蛋白（NDV-F)和猿猴病毒40(SV40)poly A尾的表达盒插入SB-1病毒的 US10与S0RF4位点之间的基因间位点内（表1和图2)。
[0085] 表 1 vSBl-004 的特征
[0086]
【权利要求】
1. 一种组合物或疫苗，其中所述组合物或疫苗包含一种或多种重组禽疱疹病毒3型 (MDV-2)载体，所述载体包含一个或多个编码并表达禽类病原体的至少一个抗原的异源多 核苷酸，或所述组合物或疫苗包含一种或多种包含突变的糖蛋白C(gC)基因的重组禽疱疹 病毒3型（MDV-2)载体。
2. 权利要求1的组合物，其还包括选自下述的一种或多种组合物或疫苗：包含编码并 表达禽类病原体的至少一个抗原的异源多核苷酸的重组HVT载体（或MDV-3或Meleagrid 疱疹病毒-1)、野生型HVT(MDV-3)、包含编码并表达禽类病原体的至少一个抗原的异源多 核苷酸的重组MDV-1载体（或禽疱疹病毒-2)、野生型MDV-1及其组合。
3. 权利要求2的组合物或疫苗，其包含野生型HVT (MDV-3)。
4. 权利要求2的组合物或疫苗，其包含重组HVT (MDV-3)。
5. 权利要求2的组合物或疫苗，其包含野生型MDV-1。
6. 权利要求2的组合物或疫苗，其包含重组MDV-1。
7. 权利要求2的组合物或疫苗，其包含野生型HVT(MDV-3)和野生型MDV-1。
8. 权利要求2的组合物或疫苗，其包含重组HVT (MDV-3)和野生型MDV-1。
9. 权利要求2的组合物或疫苗，其包含野生型HVT (MDV-3)和重组MDV-1。
10. 权利要求2的组合物或疫苗，其包含重组HVT (MDV-3)和重组MDV-1。
11. 权利要求1-10中任一项的组合物或疫苗，其中禽疱疹病毒3型中的异源多核苷酸 被插入所述禽疱疹病毒3型载体的独特长（UL)区域中的ORF UL55与ORF LORF5之间的区 域内。
12. 权利要求1-10中任一项的组合物或疫苗，其中禽疱疹病毒3型中的异源多核苷酸 被插入禽疱疹病毒3型糖蛋白C内或替代该基因。
13. 权利要求1-12中任一项的组合物或疫苗，其中任何重组载体中的异源多核苷酸对 应于禽类病原体新城疫病病毒F(NDV-F)的基因。
14. 权利要求1-12中任一项的组合物或疫苗，其中任何重组载体中的异源多核苷酸对 应于禽类病原体新城疫病病毒血细胞凝集素神经氨酸酶（NDV-HN)的基因。
15. 权利要求1-12中任一项的组合物或疫苗，其中任何重组载体中的异源多核苷酸对 应于来自禽类病原体马立克氏病病毒的一个或多个基因。
16. 权利要求1-12中任一项的组合物或疫苗，其中任何重组载体中的异源多核苷酸对 应于选自如下的基因：马立克氏病病毒糖蛋白C(gC)、马立克氏病病毒糖蛋白B(gB)、马立 克氏病病毒糖蛋白E(gE)、马立克氏病病毒糖蛋白I(gl)、马立克氏病病毒糖蛋白H(gH)或 马立克氏病病毒糖蛋白L(gL)，及其组合。
17. 权利要求1-12中任一项的组合物或疫苗，其中任何重组载体中的异源多核苷酸对 应于禽类病原体传染性法氏囊病病毒（即，IBDV或禽肾病病毒）的基因。
18. 权利要求1-12中任一项的组合物或疫苗，其中所述异源多核苷酸对应于禽类病原 体的基因 IBDV VP2、IBDV VPX、IBDV VP3 和 / 或 IBDV VP4。
19. 权利要求1-12中任一项的组合物或疫苗，其中任何重组载体中的异源多核苷酸对 应于禽类病原体感染性喉气管炎病毒（ILTV)的基因。
20. 权利要求1-12中任一项的组合物或疫苗，其中任何重组载体中的异源多核苷酸对 应于禽类病原体的基因 ILTV糖蛋白B、ILTV糖蛋白I、ILTV糖蛋白D、ILTV糖蛋白E、ILTV 糖蛋白C或其组合。
21. 权利要求1-12中任一项的组合物或疫苗，其中任何重组载体中的异源多核苷酸对 应于禽类病原体的基因，所述病原体选自禽脑脊髓炎病毒、禽呼肠孤病毒、禽副粘病毒、禽 流感病毒、禽腺病毒、鸡痘病毒、禽冠状病毒、禽轮状病毒、禽细小病毒、禽星状病毒和鸡贫 血病毒以及球虫病（艾美球虫属的种）、弯曲杆菌属的种、沙门菌属的种、鸡败血支原体和 滑液囊支原体、大肠杆菌、巴斯德菌属的种、禽杆菌属的种、梭菌属的种。
22. 权利要求1-12中任一项的组合物或疫苗，其中任何重组载体中的异源多核苷酸对 应于禽类病原体的基因，所述基因选自流感血凝素（HA)、流感神经氨酸酶（NA)、来自鸡败 血支原体（MG)和/或滑液囊支原体（MS)的保护基因。
23. 权利要求1-12中任一项的组合物或疫苗，其中任何重组载体中的编码并表达重组 禽疱疹病毒3、重组HVT(MDV-3)和重组MDV-1中的禽类病原体的一个或多个抗原的异源多 核苷酸编码不同抗原。
24. 权利要求1-23中任一项的组合物或疫苗，其中所述重组禽疱疹病毒3型载体包含 启动子。
25. 权利要求1-23中任一项的组合物或疫苗，其还包含药学上或兽医学上可接受的载 体、赋形剂、媒介物或佐剂。
26. -种重组禽疱疫病毒3型载体，其包含一种或多种异源多核苷酸，所述多核苷酸编 码并表达禽类病原体或包含突变的gC基因的重组禽疱疹病毒3型载体中。
27. 权利要求26的重组禽疱疹病毒3型载体，其中任何重组载体中的异源多核苷酸对 应于禽类病原体新城疫病病毒F的基因（NDV-F)。
28. 权利要求26的重组禽疱疹病毒3型载体，其中任何重组载体中的异源多核苷酸对 应于禽类病原体马立克氏病病毒的基因。
29. 权利要求26的重组禽疱疹病毒3型载体，其中所述异源多核苷酸对应于选自如下 的基因：马立克氏病病毒糖蛋白C(gC)、马立克氏病病毒糖蛋白B(gB)、马立克氏病病毒糖 蛋白E(gE)、马立克氏病病毒糖蛋白I(gl)、马立克氏病病毒糖蛋白H(gH)或马立克氏病病 毒糖蛋白L(gL)及其组合。
30. 权利要求26的重组禽疱疫病毒3型载体，其中所述异源多核苷酸对应于禽类病原 体传染性法氏囊病病毒（即，IBDV或禽肾病病毒）的基因。
31. 权利要求26的重组禽疱疫病毒3型载体，其中所述异源多核苷酸对应于禽类病原 体的基因 IBDV VP2、IBDV VPX、IBDV VP3 和 / 或 IBDV VP4。
32. 权利要求26的重组禽疱疫病毒3型载体，其中所述异源多核苷酸对应于禽类病原 体传染性喉气管炎病毒（ILTV)的基因。
33. 权利要求26的重组禽疱疫病毒3型载体，其中所述异源多核苷酸对应于禽类病原 体ILTV糖蛋白B、ILTV糖蛋白I、ILTV糖蛋白D、ILTV糖蛋白E、ILTV糖蛋白C或其组合的 基因。
34. 权利要求26的重组禽疱疹病毒3型载体，其中所述异源多核苷酸对应于选自下 述的禽类病原体的基因：禽脑脊髓炎病毒、禽呼肠孤病毒、禽副粘病毒、禽流感病毒、禽腺 病毒、鸡痘病毒、禽冠状病毒、禽轮状病毒、禽细小病毒、禽星状病毒和鸡贫血病毒和球虫病 (艾美球虫属的种）、弯曲杆菌属的种（Campylobacter sp.)、沙门菌属的种（Salmonella sp.)、鸡败血支原体（Mycoplasma gallisepticum)、滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae)、大肠杆菌（Escherichia coli)、巴斯德菌属的种（Pasteurella sp.)、禽杆菌属 的种（Avibacterium sp.)和梭菌属的种（Clostridium sp·)。
35. 权利要求26的重组禽疱疫病毒3型载体，其中所述异源多核苷酸对应于禽类病原 体的基因，所述基因选自流感病毒血凝素（HA)、流感病毒神经氨酸酶（NA)或两者。
36. 权利要求26-35中任一项的重组禽疱疹病毒3型载体，其中所述重组禽疱疹病毒3 型载体包含启动子。
37. 权利要求36的重组禽疱疹病毒3型载体，其中所述启动子选自下组中：立即早期 CMV启动子、豚鼠 CMV启动子、SV40启动子、假性狂犬病病毒糖蛋白X启动子、单纯疱疹病 毒-1 α 4启动子、马立克氏病病毒糖蛋白A(或gC)启动子、马立克氏病病毒糖蛋白B启动 子、马立克氏病病毒糖蛋白E启动子、传染性喉气管炎病毒糖蛋白B、传染性喉气管炎病毒 糖蛋白E、传染性喉气管炎病毒糖蛋白D或传染性喉气管炎病毒糖蛋白I启动子和牛疱疹病 毒1. 1VP8启动子。
38. -种接种动物的方法，包括至少施用一次权利要求1-37中任一项的组合物或载 体。
39. 权利要求38的方法，其中所述方法包括初免-加强施用方案。
40. -种用于诱导动物中抗一种或多种禽类病原体的免疫原性或保护性反应的方法， 包括至少施用一次权利要求1-37中任一项的组合物或载体。
41. 权利要求38-41中任一项的方法，其中所述动物是禽类。
42. -种产生重组SB-1病毒载体的方法，包括将一个或多个分离的异源多核苷酸在 SB-1基因组的非必需区域内引入所述SB-1基因组。
43. 权利要求42的方法，其中所述异源多核苷酸被插入独特的长（UL)区域或独特的短 (US)区域或替代SB-1糖蛋白C基因。
【文档编号】A61K39/12GK104159605SQ201280066324
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2012年11月29日 优先权日:2011年11月30日
【发明者】M·巴布洛特, T·梅巴特森, J·普利特查德, P·林茨 申请人:梅里亚有限公司