替考拉宁的纯化方法

替考拉宁的纯化方法
【专利摘要】本发明涉及纯化替考拉宁的方法，特别地，涉及通过使用商购疏水性或适度极性吸附树脂吸附来自替考霉素游动放线菌培养物的发酵肉汤滤液中特定溶剂的成分与进一步从树脂上洗脱产物有效除去杂质的方法。根据本发明，该方法包括在所述纯化方法的不同步骤时使用水溶液形式的与水混溶的有机溶剂的混合物，诸如在上述的洗脱步骤和/或在截止值3-100kDa的膜上的超滤步骤。该方法还进一步包括用碳处理替考拉宁溶液，例如在洗脱之后和超滤之前。优选地，所述的与水混溶的有机溶剂选自C1-C4醇类、C3-C4酮类或C2-C4腈类。
【专利说明】替考拉宁的纯化方法 发明领域
[0001] 本发明涉及化学【技术领域】，更具体地，本发明涉及抗生素替考拉宁的新的和有效 的纯化方式。
[0002] 发明背景
[0003] 替考拉宁是来自由真菌微生物例如替考霉素游动放线菌（Actinoplanes teichomyceticus)产生的万古霉素-利托菌素家族的一组糖肽抗生素的常用术语。替考 拉宁在J.Antibiotics31 (1978)，p. 170-177中首先作为称作太古霉素八^^和^的三因子 混合物公开。因子A2、后来称作替考拉宁A 2被鉴定为主要成分，其通过Sephadex LH-20? 柱色谱法分离。替考拉宁A2随后被识别为5种分子的混合物（J. Antibiotics37 (1984)， p. 615-620)，其迅速地被解释为在酰基-脂族侧链性质方面不同的结构（J. Am. Chem. Soc. 106(1984) ,4895-4902)。替考拉宁的典型和示例性化合物代表如图1中所示（R可以 表不不同的C1(rC n-烧基残基）。这5种A2化合物构成了替考拉宁与另一种主要成分（A3) 和一些次要成分（例如R s-1至Rs-4)。
[0004] 以有限比例变化形式的这些成分的混合物作为治疗革兰氏阳性菌感染的 Targocid?销售。除万古霉素和万古霉素类抗生素外，仍然存在针对高度耐受性微生物 的关键活性化合物。
[0005] 已经进行了大量尝试从微生物的培养肉汤中分离替考拉宁并且纯化替考拉宁以 达到药用级。根据首先在US 4239751中的公开内容，将培养肉汤分成菌丝体饼和滤液。在 处理所述饼后，用丁醇在酸性pH下提取肉汤级分并且在部分除去溶剂后沉淀粗发酵产物。 采集沉淀，用Sephadex LH20柱和酸性离子交换树脂例如Amberlite IR-120和Dowex50纯 化，并且通过在4°C下沉淀分离产物。然而，该方法是实验室分离试验，对于工业化应用而言 存在复杂性、质量、成本和收率这几方面的缺陷。
[0006] 为了改善这种自我抑制的替考拉宁生产中的发酵收率，尝试通过向培养肉汤中添 加与水混溶的有机溶剂例如丙酮、正丙醇和乙腈（韩国专利KR367890)或通过向其中添加 强酸性阳离子交换树脂例如Dow XFS-43278. 00和Diaion SK-1 02(韩国专利KR 118034) 连续取出产物。但这种方法仍然需要大量有机溶剂来提取替考拉宁，产生操作难题和环境 污染。
[0007] 美国专利申请US4, 845, 194报道了用于纯化替考拉宁的方法，包括阳离子交换技 术，但预先不进行pH调整。使用具有约9-约12pH值的溶液从阳离子交换树脂中洗脱替考 拉宁。
[0008] 通过使用专用的聚酰胺树脂使首先在EP 0241758中公开的替考拉宁有效地结合 疏水性树脂的发现，并且通过在碱性pH下从菌丝体中提取替考拉宁的方法作为主要公开 方法（EP 0479086)的简化，进一步取得了在分离替考拉宁中的进展。然而，替考拉宁的纯 度不会高于85%且脱色不充分。
[0009] 引入商品疏水性树脂、优选作为柱而非混悬液处理施用代表了另一种进步。出版 物 J. Biochem. 275 (2000)，p. 6201-6206 描述了商品疏水性树脂 Dianion HP2MGL? 的应用与 使用NaOH溶液的进一步洗脱。然而，该方法需要连续中和洗脱溶液以防止对碱敏感的产物 表异构化。尽管伴随其它专用方法以得到纯替考拉宁，但是鉴于仅50-60% (w/w)的纯度， 所以这种实验室方法更适合于非药用成分的目的。
[0010] 韩国专利KR 321304公开了中性吸附树脂和使用选自Amberlite XAD16、Diaion HP20、硅胶和活性炭的树脂的外源凝集素-固定的亲和色谱法。然而，在使从碱性溶液中提 取的过滤培养肉汤吸附在树脂例如Diaion HP20上的情况中，大量替考拉宁在吸附步骤中 损耗，且通过甲醇浓度梯度洗脱的替考拉宁纯度极低。此外，必须除去甲醇以便将溶液上外 源凝集素-固定的树脂。此外，因外源凝集素-固定的树脂的成本问题而并不期望应用于 大规模生产策略。
[0011] 根据韩国专利申请KR 2003/017067，使培养肉汤的替考拉宁吸附在多孔吸附树脂 上，用稀盐酸洗涤多孔吸附树脂并且使用水和丙酮的混合溶液使替考拉宁从吸附树脂上解 吸。通过真空蒸馏浓缩包含替考拉宁的洗脱溶液，用活性炭处理，并且碱性沉淀法，且由此 纯化替考拉宁。此外，该方法因替考拉宁不可逆地吸附在树脂上而降低了收率并且因使用 大量溶剂不足以按比例放大。此外，难以仅使用应用多孔吸附树脂的单一方法将替考拉宁 纯化至95面积％或以上。
[0012] 或者，一些另外的研究已经包括反相树脂以便从培养肉汤中分离和纯化替考拉 宁。例如，公布在 Chromatographia24 (1987) ρ· 295-301 中的方法提出 了使用 Lichrosorb? 树脂纯化替考拉宁，但使用大量乙腈且随后碱性树脂交换可能显著地提高生产成本。两种 另外的可替代选择伴随使用反相树脂的色谱法，并且附加纯化方式。例如，韩国专利申请KR 2003/092504描述了用丙酮水溶液提取发酵产物，随后在硅烷包被的硅胶上进行色谱处理， 在分离步骤中在活性炭上吸附，并进行超滤。US 7405267描述了从培养肉汤中纯化替考拉 宁的方法，其包括使用合成吸附剂的主要纯化步骤；使用阳离子交换树脂、催化树脂或螯合 型树脂的二次纯化；使用反相树脂的第三次纯化步骤；和最终的冻干步骤。因此，过多昂贵 的反相的单独的应用不能避免使用另外的吸附剂，由此不能成为额外成本的理由。
[0013] 概括而言，所有上述方法仅提供了部分解决方案，它们未解决分离和纯化替考拉 宁的复杂性问题。专利EP 1735337B1(W0 2005/116059)提供了迄今为止最为综合性的分 离和纯化替考拉宁的解决方案。其追溯到用疏水性树脂的吸附方法，该方法描述了如下纯 化和分离替考拉宁的关键步骤：
[0014] -将菌丝体与在滤液中溶解的替考拉宁中分离；
[0015] -使来自pH6. 5-7. 5的中性10-40% Q-C；-醇类或C3-C4-酮类水溶液介质的粗纯 化的替考拉宁吸附在多孔吸附树脂上，然后用40-90% Ci-C；-醇类水溶液洗脱，其中谨慎地 控制盐浓度；
[0016] -使用根据具有最大30%的甲醇水溶液粗略计算的稀醇水溶液使杂质吸附在活 性炭上；
[0017] -通过吸附在多孔树脂上脱盐，然后用40-90% Ci-C；-醇类水溶液洗脱；
[0018] -用具有3-100kDa孔径的膜在0_4kPa压力下、使用浓度低于纯化20%的替考拉 宁的稀水醇溶液超滤；
[0019]-沉淀替考拉宁。
[0020] 尽管该方法可以代表分离替考拉宁的最佳文献选择，但是其再现性令人意外地显 示存在明显的缺陷：
[0021] -从多孔树脂中脱盐不完全（最大87. 6% );
[0022] -减小超滤中的孔径令人意外地减少了通过膜的替考拉宁，不过，孔是明显大于替 考拉宁分子半径，而使用较大的孔降低了选择性，由此需要几个循环的超滤，从而将溶剂介 质的量提商至庞大体积；
[0023] -除去有色的杂质仍然是主要问题，因为颜色在用树脂吸附步骤未被完全除去，在 使用活性炭和超滤脱色期间也没有被完全除去。
[0024] 随后的公开文献CN 101423547A代表了通过按照预先步骤将替考拉宁溶液调整 至2, 5-6的所述综合性方法的修订，所述预先的步骤例如：
[0025] -将菌丝体与在滤液中溶解的替考拉宁分离；
[0026] -使粗纯化的替考拉宁吸附在多孔吸附树脂上，然后用适度酸性（pH值为3)的与 水混溶的有机溶剂和水的组合物洗脱；
[0027] -使杂质吸附在活性炭上；
[0028] -在实际的实例中使用纳米过滤，任选地提及的超滤。
[0029] 这些方法预先的步骤的有益性尚未清楚地鉴定。作为纳米过滤的可替代选择的超 滤尤其不清楚，因为替考拉宁的分子量在纳米膜与超滤膜的平均截止值之间，由此其功能 应不相同。
[0030] 因此，仍然需要药用级替考拉宁的有效的综合性分离方法。
[0031] 发明概沭
[0032] 本发明提供了如下方面、主题和优选的实施方案，其相应地单独采用或组合采用， 还促成了解决本发明的目的：
[0033] 1.纯化的替考拉宁的制备方法，该方法包含下列步骤：
[0034] a)使替考拉宁吸附在疏水性吸附树脂上；
[0035] b)使用包含水和与水混溶的有机溶剂的介质使替考拉宁从所述树脂上解吸；
[0036] c)用炭处理包含替考拉宁的溶液，然后除去炭；
[0037] d)对包含替考拉宁的溶液进行使用具有3-100kDa截止值的膜的超滤法，其中该 溶液包含20% (v/v)以上的与水混溶的有机溶剂和不超过90% (v/v)的与水混溶的有机 溶剂；
[0038] e)在通过用具有lOOODa截止值的膜超滤进行步骤d)中定义的超滤后任选地浓缩 包含替考拉宁的溶液和/或使其脱盐；
[0039] f)得到纯化的替考拉宁。
[0040] 2.根据项目1的方法，其中如项目1的顺序进行步骤a) -f)。
[0041] 3.根据项目1或2的方法，还包含将有机溶剂添加到替考霉素游动放线菌培养物 中的预先步骤，并且通过过滤和/或离心除去菌丝体和其它不溶物。
[0042] 4.根据项目1或3任一项的方法，其中所述疏水性吸附树脂是具有20 _ 500 A 孔径的聚苯乙烯或聚丙烯酸酯交联的非离子型大孔树脂。
[0043] 5.根据项目1-4任一项的方法，其中所述疏水性吸附树脂具有- 500 A的 孔径。
[0044] 6.根据项目1-5任一项的方法，其中所述疏水性吸附树脂选自 Hypersol-Macronet? ? Dowex? o p t i p 〇 r e、 Amberlite? x a d 16、 A腿berlite⑩ XADieoo、 AmberliteS xadiiso, Diaion? hp2〇、Diaion? S印abeads SP207 和Dianion? HP2MG。
[0045] 7.根据项目i-6任一项的方法，其中所述疏水性吸附树脂选自Amberlite? XAD16、Aniberltte⑩ xadi6〇o 和Amlierltte⑩ XAD1180。
[0046] 8.根据项目1-7任一项的方法，其中使用包含30% (v/v)或以下的与水混溶的溶 剂的溶液进行吸附至疏水性吸附树脂上。
[0047] 9.根据项目1-8任一项的方法，其中使用包含至少40% (v/v)的与水混溶的有机 溶剂的水性介质进行从疏水性吸附树脂上解吸替考拉宁的步骤。
[0048] 10.根据项目1-9任一项的方法，其中所述与水混溶的有机溶剂选自Ci-C；醇类、 C3-C4酮类或C2_C4臆类。
[0049] 11.根据项目1-10任一项的方法，其中所述与水混溶的溶剂是甲醇。
[0050] 12.根据项目1-11任一项的方法，其中使用包含60-70% (v/v)甲醇的水性介质 进行从疏水性吸附树脂上解吸替考拉宁的步骤。
[0051] 13.根据项目1-12任一项的方法，其中使用具有低于4的pH值的水性介质进行从 疏水性吸附树脂上解吸替考拉宁的步骤。
[0052] 14.根据项目13的方法，其中所述水性介质具有2-2. 5的pH值。
[0053] 15.根据项目12或14的方法，其中通过添加无机酸、有机酸或酸性缓冲剂的水溶 液调整水性介质的pH值。
[0054] 16.根据项目13-15任一项的方法，其中通过添加盐酸、硫酸、磷酸或柠檬酸调整 水性介质的pH值。
[0055] 17.根据项目1-16任一项的方法，其中在步骤c)的活性炭处理前浓缩步骤b)中 得到的溶液。
[0056] 18.根据项目1-17任一项的方法，其中通过添加选自无机氢氧化物、碳酸盐、磷酸 盐或通过在炭处理前添加缓冲剂将步骤b)中得到的溶液的pH值调整至pH为6. 0-8. 0。
[0057] 19.根据项目1-18任一项的方法，其中进行炭处理的溶液介质来源于步骤b)且包 含至少40% (v/v)的有机溶剂，其选自（^-(；醇类、C3_C4酮类或C2_C 4腈类。
[0058] 20.根据项目1-19任一项的方法，其中步骤b)中得到的溶液包含60-80% (v/v) 的甲醇或通过添加新鲜溶剂进行校正，以使甲醇具有60-80% (v/v)的浓度。
[0059] 21.根据项目1-20任一项的方法，其中溶液中替考拉宁与活性炭的重量比为 1 : 0.05-1 : 2,优选 1 : 0.2-1 : 1，最优选 1 : 0.5-1 : 0.8。
[0060] 22.根据项目1-21任一项的方法，其中步骤d)的超滤使用步骤c)中得到的溶液 进行，该溶液包含20% (v/v)以上且至多90% (v/v)的(^-(；醇。
[0061] 23.根据项目1-22任一项的方法，其中步骤d)的超滤使用步骤c)中得到的溶液 进行，该溶液已经通过添加新鲜溶剂进行校正，以便包含20% (v/v)以上且至多90% (v/v) 的(^-(；醇。
[0062] 24.根据项目1-23任一项的方法，其中使用包含40-80 % (v/v)的甲醇、优选 60-80% (v/v)的甲醇的在步骤c)中获得的溶液进行步骤d)的超滤。
[0063] 25.根据项目1-24任一项的方法，其中步骤d)的超滤使用具有3-100kDa、优选 5-100kDa、更优选5-10kDa截止值的膜进行。
[0064] 26.根据项目1-25任一项的方法，其中步骤d)的超滤的特征在于替考拉宁浓缩物 的渗余物/渗透物之比不超过〇. 65,更优选不超过0. 4。
[0065] 27.根据项目1-26任一项的方法，其中使用具有lOOODa截止值的膜进行步骤e) 的超滤。
[0066] 28.根据项目1-27任一项的方法，其中得到步骤f)中的纯化替考拉宁通过替考拉 宁分离进行，包括使用蒸发、真空蒸发、冻干、喷雾干燥或通过添加反溶剂沉淀除去溶剂。 [0067] 29.根据项目28的方法，其中将丙酮用作抗溶剂。
[0068] 30.根据项目28或29的方法，其中通过过滤或离心分离沉淀的替考拉宁且任选地 进行真空干燥。
[0069] 31.根据项目1-30任一项的方法，其中纯化的替考拉宁用于制药用途。
[0070] 32.药物组合物的制备方法，包含根据项目1-31任一项的方法，且其中将纯化的 替考拉宁与至少一种药用赋形剂或载体混合。
[0071] 33.根据项目1-8任一项的方法，其中步骤b)和c)中的介质包含至少40% (v/v) 的与水混溶的有机溶剂且具有步骤b)中的pH值和任选地在步骤c)中低于3的pH值。
[0072] 34.纯化的替考拉宁的制备方法，该方法包含下列步骤：
[0073] a)使替考拉宁吸附在疏水性吸附树脂上；
[0074] b)使用包含水和与水混溶的有机溶剂的介质使替考拉宁从所述树脂上解吸；
[0075] c)用炭处理包含替考拉宁的溶液，然后除去炭；
[0076] d)对包含替考拉宁的溶液进行使用具有3-100kDa截止值的膜的超滤法，其中该 溶液包含60% (v/v)以上的与水混溶的有机溶剂和不超过90% (v/v)的与水混溶的有机 溶剂；
[0077] e)在通过用具有lOOODa截止值的膜超滤进行步骤d)中定义的超滤后任选地浓缩 包含替考拉宁的溶液和/或使其脱盐；
[0078] f)得到纯化的替考拉宁，
[0079] 其中步骤b)和c)中的介质包含至少40% (v/v)的与水混溶的有机溶剂，且具有 步骤b)中的pH值和任选地在步骤c)中低于3的pH值。
[0080] 附图简沭
[0081] 图1 :示例替考拉宁的例证和典型化合物代表。
[0082] 图2 :图示替考拉宁的典型脱氨基。
[0083] 图3 :提供根据本发明典型方法的简图概括。
[0084] 图4 :显示作为在指定时间点浓度与起始浓度之比的吸附的替考拉宁部分。
[0085] 图5 :使用中性水-甲醇混合物从Amberlite XAD16?吸附树脂上解吸替考拉宁 和相关杂质：表示为与根据甲醇浓度的替考拉宁（正方形）相比面积％的解吸的替考拉宁 (圆圈）和部分有色的相关杂质的浓度依赖性如图所示，为两组实验的结果。
[0086] 图6 :使用中性水-甲醇混合物从Amberlite XAD1600?吸附树脂上解吸替考拉 宁及其杂质：表示为与根据甲醇浓度的替考拉宁（正方形）相比面积％的解吸的替考拉宁 (圆圈）和部分有色的相关杂质的浓度依赖性如图所示，为两组实验的结果。
[0087] 图7 :使用中性水-甲醇混合物从Amberlite XAD1180?吸附树脂上解吸替考拉 宁及其杂质：表示为与根据甲醇浓度的替考拉宁（正方形）相比面积％的解吸的替考拉宁 (圆圈）和部分有色的相关杂质的浓度依赖性如图所示。
[0088] 图8 :使用酸性水-甲醇混合物从Amberlite XAD16?吸附树脂上解吸替考拉宁及 其杂质：在不同洗脱液pH下（pH = 2-实线，pH = 3-阴影线，pH = 4-虚线）表示为与根 据甲醇浓度的替考拉宁（正方形）相比的面积％的解吸的替考拉宁（圆圈）和部分有色的 相关杂质的浓度依赖性如图所示。
[0089] 图9 :使用酸性水-甲醇混合物从Amberlite XAD1600?吸附树脂上解吸替考拉宁 及其杂质：在不同洗脱液pH下（pH = 2-实线，pH = 3-阴影线，pH = 4-虚线）表示为与 根据甲醇浓度的替考拉宁（正方形）相比的面积％的解吸的替考拉宁（圆圈）和部分有色 的相关杂质的浓度依赖性如图所示。
[0090] 图10 :使用酸性水-甲醇混合物从Amberlite XAD1180?吸附树脂上解吸替考拉 宁及其杂质：在不同洗脱液pH下（pH = 2-实线，pH = 3-阴影线，pH = 4-虚线）表示为 与根据甲醇浓度的替考拉宁（正方形）相比的面积％的解吸的替考拉宁（圆圈）和部分有 色的相关杂质的浓度依赖性如图所示。
[0091] 图11 :水-甲醇混合物中使用活性炭的替考拉宁溶液脱色：根据甲醇浓度的依赖 性中的收率（圆圈）和相对吸收度减少（正方形）如图所示。
[0092] 图12 :使用不同载量的活性炭的替考拉宁溶液脱色：根据炭不同载量的依赖性中 的表示为相对于替考拉宁的w/w的收率（圆圈）和相对吸收度减少（正方形）如图所示。
[0093] 图13 :不同甲醇/水混合物中通过超滤膜的替考拉宁渗透性：取渗透物和浓缩物 样品并且通过HPLC进行分析。
[0094] 发明详沭
[0095] 现在通过优选的实施方案和实施例更详细地描述本发明，然而，这些实施方案和 实施例仅用于示例目的，而不应理解为以任何方式限定本发明的范围。
[0096] 因此，本发明在于提供从产生替考拉宁的真菌微生物例如替考霉素游动放线菌 (Actinoplanes teichomyceticus)的发酵培养物中分离替考拉宁的方法，所述替考拉宁为 药物应用级，基本上除去了颜色。
[0097] 本发明上下文中所使用的术语"替考拉宁"是指由化合物的混合物组成的糖肽抗 生素或所述混合物的单一成分。该混合物的单一成分典型地包含5种主要的成分（A 2-l、 A2-2、A2-3、A2-4、A2-5)，核心糖肽A 3-l和次要成分，例如RS-1、RS-2、RS-3和RS-4。在本文 所述的本发明背景中显示了参考文献。单一成分的含量比不可能恒定且可以根据所用的菌 株、培养条件或所用的纯化方法的不同而改变。
[0098] 替考拉宁的发酵产生深褐色至几乎黑色的培养肉汤，可以通过本领域技术人员公 知的吸附和色谱方法，经选择的工艺方法逐步对其脱色，以便得到终产物，其颜色仍然明显 地是黄色或褐色模式，在贮存中还可能变深。我们令人意外地发现，有色的杂质属于至少3 个物理-化学类型，仅用一种工艺操作不能除去它们。可以将关键杂质分类成如下类型。 [0099] 一种类型表示高分子量有色杂质，其可以通过适合于大分子的分离方法除去，例 如吸附在树脂上或凝胶过滤。它们主要包含细胞结构的大分子残留部分。
[0100] 另一种类型表示低分子量、可能低于l〇〇〇Da的杂质，其具有较低极性，也来源于 包含具有双键键合脂质部分的分子的非特异性细胞成分。
[0101] 第三种类型表示极为相关的降解产物，其特征在出版物J.Antibiotics49(1996)， p. 644-650中，据推测通过氧化氨基分解产生。用酮基替代氨基产生双重效应：所影响的分 子部分变成共轭醌-类结构，从而使最大吸收达到可见光谱且分子失去了碱性（图2)。
[0102] 因此，本发明提供了有效除去杂质的方法，通过使来自产生替考拉宁的真菌微生 物培养物、优选替考霉素游动放线菌培养物的发酵肉汤滤液的部分溶解的成分吸附在商品 疏水性或适度极性的吸附树脂上来进行，同时，进一步从树脂上选择性地洗脱产物。根据本 发明，该方法包括在纯化方法的不同步骤时使用水溶液形式的与水混溶的有机溶剂的混合 物。优选地，所述与水混溶的有机溶剂选自Ci-C；醇类、c 3-c4酮类或c2-c4腈类。
[0103] 本文的替考霉素游动放线菌培养物的发酵肉汤滤液是指通过生物【技术领域】普通 技术人员公知的方法制备的不含菌丝体的过滤的培养肉汤。
[0104] 在一个优选的实施方案中，该方法包含下列步骤：
[0105] a)使替考拉宁吸附在疏水性吸附树脂上；
[0106] b)使用包含水和与水混溶的有机溶剂的介质从所述树脂上解吸替考拉宁；
[0107] c)用炭处理包含替考拉宁的溶液，然后除去炭；
[0108] d)对包含替考拉宁的溶液进行使用具有3-100kDa截止值的膜的超滤法，其中该 溶液包含20% (v/v)以上的与水混溶的有机溶剂和不超过90% (v/v)的与水混溶的有机 溶剂；
[0109] e)在通过用具有lOOODa截止值的膜超滤进行步骤d)中定义的超滤后任选地浓缩 包含替考拉宁的溶液和/或使其脱盐；
[0110] f)最终得到纯化的替考拉宁。
[0111] 商购的疏水性或适度极性的吸附树脂可以选自具有20 - 500盖？L 径的聚苯乙烯或聚丙烯酸酯交联的非离子型大孔树脂，其选自、但不限于商标 Hypersol-Hacronet?、Amberlite? xad、 Dmio霞⑩ hp 和 Sepabeads sp ; 或D_ex藝0ptipore，其优选自具有1_ - ▲孔径的树脂，其选自商标 ▲mbertito? xad 16、AmberMto? xad 1600、xad 1180、DMom? HP2〇、Diaion⑩ s印abeads SP207、Diani__ HP2MG，最优选 A臟berlite馨 xadi6、 Amberlitei) XAD1600、Anibcrlite@ XAD1180。这种类型的树脂选择性地吸附来自水 溶液的具有亲脂性残基的分子，包括适度较大分子量的分子，例如替考拉宁，并且保留低分 子极性成分，包括溶液中的离子溶质和各种大分子。从水溶液中吸附极性较低的分子，所述 水溶液包含不超过30% (v/v)的与水混溶的溶剂，优选不超过20%的(；-(；-醇类、(：3-(；丙 酮或c2-c 4腈类，优选甲醇。
[0112] 易于吸附取决于树脂的类型；可以通过长时间处理补偿有利性较低的吸附。有 代表性的实施例2显示替考拉宁与3种典型树脂的吸附动力学：Amberlite? XAD16、 Amberlite⑩xad 1600、Amberlite? xad 1180。全部3种树脂均显示良好的吸附，但 其中的一些吸附快于其它的树脂。使用AmberMte? xadii8〇,9〇%以上最初存在的替 考拉宁在2小时内从溶液中吸附，而使用XAD16,仅吸附50%。具有较大孔的树脂（例如 Amberlite? XAD1180)吸附快于具有较小孔的树脂（例如Amberiite? XAD16)，但可 以用较小颗粒和较大表面积补偿（例如AmberHte? XAD1600)。有利的动力学导致更有 效的柱吸附，这对有效的工业化规模替考拉宁生产而言是重要的。
[0113] 吸附剂从所述溶液中取出了至少80%的总替考拉宁，优选至少90%，最优选至少 95%总替考拉宁。该吸附过程通过在0-40°C温度、优选在室温振摇混悬于所述替考拉宁溶 液中至少2小时、优选至少12小时、最优选至少24小时的树脂来进行。最终，过滤出包含 替考拉宁的树脂，任选地通过用水再混悬或冲洗洗涤。或者，通过载有在吸附剂上至饱和的 发酵产物的所述吸附剂柱洗脱包含替考拉宁的过滤肉汤。
[0114] 在一个优选的实施方案中，通过用富含有机溶剂的水溶液洗脱从树脂上释放吸附 的材料，所述富含有机溶剂的水溶液优选包含至少40% (v/v)的与水混溶的有机溶剂，其 选自Ci-C；醇类、C3-C4酮类或C 2-C4腈类，优选甲醇。可以通过添加有机溶剂增强替考拉宁 从树脂上的洗脱程度。然而，洗脱不完全且不具有高度选择性。与替考拉宁一起还洗脱了 大部分杂质。洗脱替考拉宁的有机溶剂的浓度因替考拉宁在有机溶剂中的溶解度而受限。 例如，当应用甲醇/水混合物时，根据树脂类型的不同，替考拉宁的洗脱程度在60-80% (v/ v)甲醇浓度时达到最大值，但洗脱程度仍低于总吸附替考拉宁的60%。通过经添加盐提高 离子强度，可以洗脱87.6%的替考拉宁出？ 173533781)，但选择性仍然不足乃至下降；尤 其是仍然难以除去有色的杂质。一般而言，将碱加入到洗脱系统中（J. Biochem. 275 (2000)， p. 6201-6206)是另一种解决方案，但是该方法在替考拉宁的具体情况中不能遵循，因为替 考拉宁在碱性介质中不稳定。
[0115] 根据本发明，优选酸化、优选用无机酸、最优选用盐酸酸化洗脱介质。令人意外地 发现，替考拉宁洗脱效率高于使用现有技术中所述的中性洗脱方法时的洗脱效率。甚至本 发明的方法在除去来源于所述氧化脱氨作用的有色杂质方面提高了选择性。相应附图中 补充的实施例3-5显示了替考拉宁及其氧化杂质从3种典型树脂（Amberlite? XAD16、 XAD1600和XAD1180)上的洗脱效率，其为pH值为6-7的中性介质中有机溶剂浓度的函数， 而实施例6-8显示在pH值分别为2、3和4的酸性介质中的相似试验。显而易见在中性介 质中，有色杂质的相对浓度达到如在有机溶剂浓度下HPLC分析的面积％所测定的替考拉 宁浓度的7-12%，其中替考拉宁解吸具有其最大值。所述杂质在酸性介质中的相对浓度不 超过6%，在pH2下不超过4%。2-3倍以下水平的杂质显然更易于在接下来的替考拉宁分 离步骤中定量地除去。此外，替考拉宁在酸性条件下的稳定性远高于在碱性介质中的稳定 性。
[0116] 实施例6-8和图8-10示例酸性介质对分批方法中替考拉宁释放程度和有色杂质 方面的选择性。当使用60% (v/v)有机溶剂（甲醇）进行洗脱时，洗脱的替考拉宁中杂质 的含量在pH值为2时低于3%，而在相同洗脱条件下当pH值增加至3或4时，杂质含量增 加至8 %。根据Ph. Eur. 7. 2,允许药用级替考拉宁具有5 %最大值的杂质。
[0117] 可以通过从填充了载有替考拉宁的树脂的柱上连续洗脱改善替考拉宁与有色杂 质的分离，此时使得该方法与色谱法类似，其中首先洗脱替考拉宁，然后洗脱所述杂质。其 中，选择性依赖于副级分的截止点。更好的选择性通常降低收率。但是，可以通过使用较长 的柱改善收率/选择性之比，由此将杂质以相对面积％计的相对含量减少至4%以下，优选 2 %以下，最优选1 %以下，正如通过HPLC所测定的。
[0118] 因此，根据本发明的一个优选的实施方案，用包含至少40% (v/v)与水混溶的 有机溶剂的水性介质从具有20-500人孔径的聚苯乙烯或聚丙烯酸酯交联的非离子型 大孔吸附树脂上洗脱替考拉宁，所述树脂优选自AmbeHite? XAD16、AmberMtei) XAD1600、AmberMte? XAD1180,所述有机溶剂选自Ci-C；醇类、c3-c4酮类或c2-c 4腈类，优 选甲醇，最优选包含60-70% (v/v)的甲醇，其中使用的pH值低于4,优选在pH值为2-2. 5 下。通过添加优选自盐酸、硫酸、磷酸或柠檬酸的无机酸或有机酸的水溶液或使用酸性缓冲 剂调节pH值。
[0119] 在本发明的另一个优选的实施方案中，用活性炭处理包含替考拉宁分子的溶液， 其中该溶液包含至少40% (v/v)的与水混溶的有机溶剂。优选预先通过使用疏水性吸附树 脂吸附/解吸、更优选用酸性介质解吸纯化起始溶液。在最优选的情况中，不校正溶剂/水 之比，然后进行炭处理，即仅通过将pH值调整至中性6-8区间从前述步骤中直接转移替考 拉宁溶液。
[0120] 使用吸附树脂和炭的合并处理描述在EP 1735337B1(W0 2005/116059)中。根据 本文的描述，优选首先用水稀释甲醇溶液，得到通过计算具有至多40% (v/v)甲醇的溶液， 然后用活性炭处理。该步骤对已知非极性化合物更好地从更具极性介质吸附在活性炭上的 本领域技术人员显而易见。发明人令人意外地发现，这种用水稀释不一定必要。持续进行 该处理，不水化介质，不会失去亲脂性杂质的除去效率，甚至用富含甲醇的水性混合物更有 效地除去有色的杂质。这种行为是无规律性的，但根据替考拉宁分子的两亲特性解释的推 定，这些分子可以在水性介质中组装成具有亲脂性芯的大分子胶束。所述芯能够俘获一些 亲脂性杂质，从而防止其接触炭表面。
[0121] 因此，在一个优选的实施方案中，用活性炭纯化和脱色替考拉宁溶液的改进方法 包括处理富含有机溶剂替考拉宁溶液，其包含至少40% (v/v)的有机溶剂，其特别地选自 Ci-C；醇类、C3-C4酮类或C2-C 4腈类，优选甲醇，更优选60-80% (v/v)甲醇的溶液。在另一 个优选的实施方案中，替考拉宁/炭的重量比为1 : 0.05-1 : 2,优选1 : 0.2-1 : 1，更 优选1 : 0.5-1 : 0.8。其中温育优选在0-60°C、优选在室温进行5分钟-12小时，优选 0. 5-2小时。然后过滤出活性炭，进一步处理具有减少黄色的替考拉宁如，以分离固体产物。
[0122] 改进的炭处理主要降低了亲脂性低分子量有色化合物的和其它较低极性的杂质 的水平。
[0123] 在一个优选的实施方案中，通过用具有lkDa-100kDa截止值的膜超滤进一步处理 预先主要纯化自低分子量有机杂质的替考拉宁溶液。
[0124] 超滤是通常用于分离发酵产物的方法。该方法主要用于消除大分子杂质。这对用 于胃肠外应用的药用成分而言尤其重要，因为这种大分子具有致热原活性。超滤方法使用 多孔膜，其允许通过较小分子，同时保持了高分子量分子。膜中的孔大小在分子通过膜（渗 透物溶液）和分子截断（渗余物溶液）方面是决定性的。lkDa-100kDa截止值的膜通常用 于超滤，视目的而定。具有小孔的主要渗透溶剂和盐的膜用于浓缩渗余物并且使其脱盐，而 具有较大孔的膜用于除去较大的分子，也称作透析过滤的过程。具有一定分子量的接近孔 径的分子分布于渗透物和渗余物之间。在高渗余物/渗透物浓度比的情况中，可以使用新 鲜溶剂进行几个循环的透析过滤以达到产物在渗透物中可接受的收率。
[0125] 预计具有接近1900Da分子量的替考拉宁分子易于透过具有大于5kDA的孔的膜， 由此具有5kDa或lOOkDa截止值的膜应用于使较大分子与替考拉宁的良好分离。可以通过 使用如上所述的非极性树脂吸附的方法除去大部分大分子。然而。该方法无法提供除去更 大的分子，由此在溶液中遗留了相当数量的潜在热原、大分子有色剂和其它较大分子。EP 1735337B1描述了通过具有30kDa或50kDa的膜、使用替考拉宁与最大20% (v/v)的甲醇或 异丙醇溶液的超滤。这种方法在除去热原方面不充分，因为除去热原需要3kDa_10kDa分子 量截止值的膜。此外，发现当使用具有30kDa-50kDa截止值、例如80 %以上、甚至50-1 OOkDa 膜、使用达20% (v/v)的稀醇溶液时，渗余物/渗透物浓度比极高。必须应用几个循环的透 析过滤，需要数天和大量的新鲜溶剂。为得到不致热原的产物而使用较小的孔，超滤在应用 现有技术的方法时变得几乎无产出。这一观察结果令人意外且不能解释为计算的替考拉宁 分子量，其小于膜的平均截止值几倍。
[0126] 根据本发明，通过经有3-100kDa、优选5-10kDa截止值的膜超滤处理替考拉宁溶 液，其中该溶液包含20% (v/v)、优选60% (v/v)以上的与水混溶的有机溶剂和不超过 90% (v/v)的与水混溶的有机溶剂，其特别地选自（；-(；醇类、C3-C4酮类或C2-C 4腈类，优 选甲醇，更优选40-80% (v/v)甲醇，最优选60-80% (v/v)甲醇。在一个优选的实施方案 中，使用5-10KDa分子量截止值的膜类型和甲醇60-80% (v/v)在替考拉宁溶液中的优选浓 度。渗余物/渗透物的替考拉宁浓度比不超过〇. 65,优选不超过0. 4,其中所述渗透物在视 觉上无黄色。优选地，该方法相应地无需使用5kDa膜的6个以上循环的透析过滤且无需使 用10kDa膜的4个以上循环，以得到在渗透物中超过95%的替考拉宁收率，其中黄色被基本 上除去。该方法主要除去了大分子有色杂质和其它大分子杂质，包括潜在的热原。在一个 优选的实施方案中，将该方法与其它方法合并，以除去其它化学类型的颜色。
[0127] 在超滤期间替考拉宁溶液中的有机溶剂浓度提高的令人意外的有益性表明替考 拉宁分子不是单分子地溶于富含水的溶液，而它们显然组装成多分子簇，它不能透过超滤 膜的孔，这些孔对于一种分子而言在理论上足够大，而对簇不足够大。
[0128] 任选地通过经1000Da截止值膜超滤进一步处理得到的替考拉宁溶液，以使该溶 液脱盐并且浓缩该溶液。可以用抗溶剂进一步处理该溶液，所述抗溶剂优选自酯类、腈类或 酮类，优选丙酮，得到替考拉宁白色沉淀，其具有至少95面积％，优选至少98面积％。
[0129] 在一个优选的实施方案中，具有提高的纯度的替考拉宁的总体制备方法包括从产 生替考拉宁的培养物的发酵肉汤中除去不同分子类型的有色物质和其它发酵和降解产物， 根据本发明，包含下列步骤：
[0130] i)制备发酵肉汤溶液；
[0131] ii)使替考拉宁吸附在疏水性吸附树脂上；
[0132] iii)用包含水和与水混溶的溶剂的酸性介质使替考拉宁从所述树脂上解吸；
[0133] iv)用炭处理得到的溶液，其中该溶液包含至少40% (v/v)的有机溶剂，然后除去 炭；
[0134] v)用具有3-100kDa截止值的膜对所述溶液进行超滤，其中该溶液包含20% (v/v) 以上的有机溶剂；
[0135] vi)任选地通过用具有lOOODa截止值的膜超滤浓缩所述溶液并且使其脱盐；
[0136] vii)分离固体替考拉宁。
[0137] 根据该实施方案，步骤i)包括杀灭产生替考拉宁的真菌微生物，优选替考霉素游 动放线菌的培养物，通过添加有机溶剂分解细胞结构并通过过滤或离心除去菌丝体和其它 不溶发酵产物，得到澄清、但深棕色或几乎黑色的溶液。
[0138] 步骤ii)的疏水性吸附树脂选自具有20-S00又孔径的聚苯乙烯或聚丙烯酸酯 交联的非离子型大孔吸附树脂，其选自商标Hypersol-Mtoerone麵K Amberftte? XAD、Diai〇n? HP 和 Sepabeads SP 或 |>OWeX? 〇PtiP〇re,其优选自 A 孔 径的树脂，其选自商标 Amberlite? XAD16、AmberHte? XAD1600、Amberliti? XAD1180、Diaion? HP20、Diaion? S印abeads SP207、Dianion? HP2MG,最优选 Amberlite? XAD16、Amberlite? XAD1600、Amberlite? XAD1180。可以通过将树 脂添加到溶液中，再在0-40°C温度、优选在室温搅拌或振摇1-48小时、优选至少2小时、更 优选至少12小时、最优选至少24小时进行吸附。随后，过滤出包含替考拉宁的树脂，任选 地用水经再混悬或冲洗洗涤。或者，通过将溶液上填充了所述树脂的柱吸附发酵产物，然后 任选地洗涤。
[0139] 步骤iii)的解吸可以通过用水性介质洗脱吸附的材料进行，所述水性介质包含 至少40% (v/v)的与水混溶的有机溶剂，其选自(^-(；醇类、C3-C4酮类或C2-C 4腈类，优选甲 醇，最优选包含60-70 % (v/v)的甲醇，其中使用的pH值低于4,优选在pH值为2-2. 5下。 通过添加优选自盐酸、硫酸、磷酸或柠檬酸的无机酸或有机酸的水溶液或通过添加酸性缓 冲剂调节pH值。
[0140] 在该实施方案的步骤iv)中，首先任选地将溶液通过添加选自无机氢氧化物、碳 酸盐、磷酸盐的碱或通过添加缓冲剂将pH调整为6-8,然后用活性炭处理。用于该步骤处理 的溶液的介质可以来源于步骤iii)，其包含至少40% (v/v)的有机溶剂，其选自（^-(；-烷 醇、丙酮或乙腈，优选自甲醇，优选在60-80% (v/v)甲醇中，或通过添加新鲜溶剂校正，以 得到所述溶剂含量。活性炭在溶液中的量相对于测定替考拉宁而测定。替考拉宁/炭的 重量比为1 : 0.05-1 : 2,优选1 : 0.2-1 : 1，最优选1 : 0.5-1 : 0.8。用炭将溶液在 0-60°C、优选在室温处理5分钟-12小时，优选0. 5-2小时。然后过滤出活性炭，得到具有 黄色减少的替考拉宁溶液。
[0141] 步骤V)的超滤优选使用上述步骤的溶液进行。可以任选地通过添加新鲜溶剂以 包含20-90% (v/v)的与水混溶的有机溶剂校正该混合物，所述有机溶剂选自醇类、 (：3-(；酮类或(：2-(；腈类，优选甲醇，更优选包含40-80 (%(￥八）的甲醇，最优选60-80(%&/ v)的甲醇。该步骤的膜选自具有截止值3-100kDa、优选5-100kDa、更优选5-10kDa的膜。 在一个优选的实施方案中，该膜具有5-10KDa的截止值且甲醇浓度为60-80% (v/v)。在替 考拉宁溶液中，渗余物/渗透物的替考拉宁浓度比不超过0. 65,优选不超过0. 4。
[0142] 任选的步骤vi)的超滤优选使用上述步骤的溶液、应用具有lOOODa截止值的膜进 行。替考拉宁保留在渗余物中，而一些小分子如溶剂和无机盐保留在渗透物中。应浓缩该 溶液，以达到适合于在下一步中提供高收率的溶剂比例和替考拉宁浓度。
[0143] 步骤vii)中替考拉宁的分离适当地通过使用蒸发、真空蒸发、冻干、喷雾干燥或 通过添加抗溶剂进行沉淀。优选使用抗溶剂沉淀，其中使用上述步骤的溶液作为碱性溶液 和有机溶剂、优选丙酮作为抗溶剂。通过过滤或离心分离沉淀的产物，并真空干燥。
[0144] 本发明实施方案的总体方法图示在图3中。
[0145] 包含高纯度替考拉宁和药学可接受的赋形剂的药物组合物的制剂是本发明的另 一个方面。本发明的药物组合物适合于胃肠外施用且本发明替考拉宁的治疗剂量在任意指 定情况中都取决于所治疗疾病的性质和严重性。剂量和剂量频率还可以根据个体患者的 年龄、体重和响应的不同而改变。一般而言，活性成分的适合剂量在每日50mg-800mg，优选 100mg-400mg，优选100-800mg总每日剂量。剂型包括分散液、溶液、混悬液、乳剂、粉末、植 入物，其中替考拉宁最优选的剂型是干粉注射剂和输注液。在一个最优选的实施方案中，将 本文所述的新替考拉宁溶于无菌和无热原水与稳定剂、缓冲剂和添加剂，将该混合物冻干， 得到无定形粉末，在使用前用液体再溶解。将再溶解的注射剂通过静脉内或肌内施用。例 如，将静脉内注射剂作为推注液或作为30分钟输注液施用。剂量通常为每日1次，但在严 重感染的情况中，应在第一天时施用第二次注射，以更快速地达到所需的血清浓度。 实施例
[0146] 下列实施例进一步示例本发明。提供它们仅为了示例目的，但不预以以任何方式 限制本发明。
[0147] 通过使用AgilentllOO?仪器的HPLC方法测定不同中间体溶液中的替考拉宁成分 或有代表性的实验样品的分离的固体中间体和终产物的量。流动相A包含pH4. 9的5mM磷 酸盐缓冲液且流动相B包含乙腈。在280nm检测色谱峰，柱温为45°C且注射5 μ 1样品。用 安装了前置柱C18,2cmx4·0mm，3μm的柱AscentisExpressC18TM，10cmx4·6mm，2·7μm进 行分离。流速为2. 2ml/min且在色谱过程中的梯度如下：
【权利要求】
1. 纯化的替考拉宁的制备方法，该方法包含下列步骤： a) 使替考拉宁吸附在疏水性吸附树脂上； b) 使用包含水和与水混溶的有机溶剂的介质使替考拉宁从所述树脂上解吸； c) 用炭处理包含替考拉宁的溶液，然后除去炭； d) 对包含替考拉宁的溶液进行使用具有3-100kDa截止值的膜的超滤法，其中该溶液 包含20% (v/v)以上的与水混溶的有机溶剂和不超过90% (v/v)的与水混溶的有机溶剂； e) 在通过用具有l〇〇〇Da截止值的膜超滤进行步骤d)中定义的超滤后任选地浓缩包含 替考拉宁的溶液和/或使其脱盐； f) 得到纯化的替考拉宁。
2. 根据权利要求1的方法，其中如权利要求1的顺序进行步骤a)-f)。
3. 根据权利要求1或2的方法，还包含将有机溶剂添加到替考霉素游动放线菌培养物 中的预先步骤，并且通过过滤和/或离心除去菌丝体和其它不溶物。
4. 根据权利要求1或3任一项的方法，其中所述疏水性吸附树脂是具有20 - 500人 孔径的聚苯乙烯或聚丙烯酸酯交联的非离子型大孔树脂。
5. 根据权利要求1-4任一项的方法，其中所述疏水性吸附树脂选自 Hypersol-Maeronet? ^ Dowex? o p t i p 〇 r e、 Amberlite? x A d l 6、 Amberlite? XAD1600、Amberlite? XAD1180、Diaion? HP2〇、Diaion? Sepabeads SP207 和Dienion? HP2MG。
6. 根据权利要求1-5任一项的方法，其中使用包含至少40% (v/v)的与水混溶的有机 溶剂的水性介质进行从疏水性吸附树脂上解吸替考拉宁的步骤。
7. 根据权利要求1-6任一项的方法，其中所述与水混溶的有机溶剂选自CfC4醇类、 C3-C4酮类或C2_C4臆类。
8. 根据权利要求1-7任一项的方法，其中使用具有低于4的pH值的水性介质进行从疏 水性吸附树脂上解吸替考拉宁的步骤。
9. 根据权利要求8的方法，其中通过添加无机酸、有机酸或酸性缓冲剂的水溶液调整 水性介质的pH值。
10. 根据权利要求1-9任一项的方法，其中进行炭处理的溶液介质来源于步骤b)且包 含至少40% (v/v)的有机溶剂，其选自醇类、C3-C4酮类或C2-C4腈类。
11. 根据权利要求1-10任一项的方法，其中步骤b)中得到的溶液包含60-80% (v/v) 的甲醇或通过添加新鲜溶剂进行校正，以使甲醇具有60-80% (v/v)的浓度。
12. 根据权利要求1-11任一项的方法，其中步骤d)的超滤使用步骤c)中得到的溶液 进行，该溶液包含20% (v/v)以上且至多90% (v/v)的(^-(；醇；或使用步骤c)中得到的 溶液进行，该溶液已经通过添加新鲜溶剂进行校正，以便包含20% (v/v)以上且至多90% (v/v)的 醇。
13. 根据权利要求1-12任一项的方法，其中步骤d)的超滤使用具有3-100kDa、优选 5-100kDa、更优选5-10kDa截止值的膜进行，和/或其中步骤e)的超滤使用具有1000Da截 止值的膜进行。
14. 根据权利要求1-13任一项的方法，其中得到步骤f)中的纯化替考拉宁通过替考拉 宁分离进行，包括使用蒸发、真空蒸发、冻干、喷雾干燥或通过添加反溶剂沉淀除去溶剂。
15.药物组合物的制备方法，包含提供如权利要求1-14任一项的方法，且其中将纯化 的替考拉宁与至少一种药学可接受的赋形剂或载体混合。
【文档编号】A61K38/14GK104066747SQ201280066349
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2012年11月9日 优先权日:2011年11月11日
【发明者】S·安德伦塞克, D·赛尼卡 申请人:力奇制药公司