一种生物样品纯化的装置及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种生物样品纯化的装置及其应用，该装置包含强阳或强阴离子交换捕集柱、连接部件和反相捕集柱，可实现生物样品中强阳或强阴离子表面活性剂或离子液体和盐类的同时去除。该装置具有高效、回收率高、快速、操作简单的优点，可广泛应用于蛋白质组样品的纯化。
【专利说明】一种生物样品纯化的装置及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生物样品纯化的装置及其应用，可实现生物样品中强阳离子或强 阴离子表面活性剂或离子液体和盐类的同时去除。该装置具有高效、回收率高、快速、操作 简单的优点，并可广泛应用于蛋白质样品的纯化。
【背景技术】
[0002] 表面活性剂是一类能显著地改变通常液体表面张力或两相间界面张力的物质， 他们的分子中含有亲水和憎水的两个组成部分。表面活性剂一般分为阳离子表面活性 齐U、阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂。由于表面活性剂有着强大的增溶能力， 往往被用作生物样品的增溶剂，用于溶解膜蛋白质等难溶性生物样品（Wisniewski，J. R. ;Zougman，A. ;Nagaraj，N. ;Mann，M.Nat Methods2009,6,359_362)。近年来，离子液体 由于其出色的溶解能力，也被用于膜蛋白质等难溶性生物样品的溶解（Sun, L. L. ; Tao, D. Y. ; Hanj Β. ; Maj J. F. ; Zhuj G. J. ; Liang, Z. ; Shan, Y. C. ; Zhang, L. H. ; Zhang, Y. K. Anal Bioanal Chem2011，399, 3387 - 3397)。此外，由于生物样品预处理过程中对酸、碱性环境的 要求，需要添加适当的缓冲盐来调节反应所需的pH值。
[0003] "Bottom-up"技术是目前蛋白质组学分析鉴定中最常用的技术，该技术是先将蛋 白质酶解成肽段，然后通过一维或者多维分离技术进行分离及在线质谱鉴定。而样品预处 理过程中，添加的表面活性剂和盐类对于液相色谱的分离及质谱鉴定存在着极为不利的影 响。
[0004] 目前，存在着很多去除表面活性剂和盐类的方法，例如采用离子交换色谱法 (Weber, K. ;Kuter, D. J. J. Biol. Chem. 1971，246, 4504-4509),反相液相色谱法（Abian J, Oosterkamp AJ, Gelpi E.J. Mass Spectrom. 1999, 34, 244-254)，透析法（Hjelmeland，L. Μ· Methods Enzymol. 1990，182, 277-282 ;Liu C，Wu Q，Harms AC, Smith RD. Anal. Chem. 1996, 68, 3295-3299)等。然而，目前所用的色谱方法，单次进样，只能去除表面活性剂 或盐类，无法达到两类物质的同时去除。本发明发展了一种将两根捕集柱串联的装置，该装 置通过填充相应的固定相，单次进样，即可实现表面活性剂和盐类的同时去除，具有回收率 高、方便、快捷的优点，并且易实现自动化。
【发明内容】
[0005] 本发明涉及一种生物样品纯化的装置，可实现生物样品中强阳离子或强阴离子表 面活性剂或离子液体和盐类的同时去除。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0007] 1、构建生物样品纯化的装置：填充强阳离子交换捕集柱/强阴离子交换捕集柱和 反相捕集柱，用保护柱与分析柱连接件将两根捕集柱连接起来。
[0008] 2、采用进样针，通过进样头注入生物样品，使其先后通过两根捕集柱，保留于反相 捕集柱上。
[0009] 3、断开保护柱与分析柱连接件与反相捕集柱间的连接，采用进样针，通过进样头， 向反相捕集柱内注入80%的乙腈水溶液，将样品从反相捕集柱上洗脱下来并收集。
[0010] 一种生物样品纯化的装置，包括两根捕集柱和连接件，于强阳或强阴离子交换捕 集柱中填充强阳或强阴离子交换材料，于反相捕集柱中填充反相材料，两根捕集柱间用保 护柱与分析柱连接件连接。
[0011] 样品固载过程中，于强阳/强阴离子交换捕集柱的远离反相捕集柱的一端设有进 样头，进样头与注射器相连；反相捕集柱的远离强阳/强阴离子交换捕集柱的一端与废液 管相连；该装置的连接顺序从进样端开始依次为：注射器与进样头相连，进样头与强阳/强 阴离子交换捕集柱相连，强阳/强阴离子交换捕集柱与保护柱与分析柱连接件相连，保护 柱与分析柱连接件与反相捕集柱相连，反相捕集柱与废液管相连；生物样品采用注射针，通 过进样头注入，先后通过两根捕集柱，并保留于反相捕集柱上；
[0012] 最后，将样品从反相捕集柱上洗脱下来，收集洗脱液，即为纯化后的生物样品；样 品洗脱过程中，从装置上取下反相捕集柱，于反相捕集柱一端设有进样头，进样头与注射器 相连；反相捕集柱的另一端与收集管相连，该装置的连接顺序从进样端开始依次为：注射 器与进样头相连，进样头与反相捕集柱相连，反相捕集柱与收集管相连。
[0013] 强阳/强阴离子交换捕集柱和反相捕集柱的柱管内部为横截面直径为0. 3-7mm的 圆柱体，柱管长度为〇. 5-3cm，材质为抛光不锈钢或石英毛细管或塑料；于捕集柱的内部二 端均设有筛板，筛板孔径为3nm_20 μ m。
[0014] 强阳离子交换材料为含有磺酸基团或磷酸基团的硅胶或聚合物基质材料(如：聚 丙烯酸酯类基质、聚苯乙烯类基质、或聚丙烯酰胺类基质）；强阴离子交换材料为含有季铵 基团的硅胶或聚合物基质材料(如：聚丙烯酸酯类基质、聚苯乙烯类基质、或聚丙烯酰胺类 基质）；
[0015] 反相材料为含有C4、C8、C12或C18基团的硅胶或聚合物基质材料（(聚丙烯酸酯类 基质、聚苯乙烯类基质、聚丙烯酰胺类基质)。
[0016] 所述装置用于生物样品的纯化。
[0017] 所述生物样品为含有表面活性剂和盐的生物样品，为：细胞提取液、胞浆提取液、 血浆提取液、蛋白质溶液、或多肽溶液。
[0018] 单次注入样品，即可完成表面活性剂和盐类的同时去除。
[0019] 需要纯化的生物样品中同时含有两大类物质，一类是阳离子或阴离子表面活性剂 或离子液体（阳离子表面活性剂包括胺盐型表面活性剂、季铵盐型表面活性剂、杂环类阳离 子表面活性剂、或鎗盐型表面活性剂；阴离子离子液体包括磺酸盐型、羧酸盐型、硫酸酯盐 型、或磷酸酯盐型表面活性剂；离子液体包括咪唑类离子液体或吡啶类离子液体或季铵盐 离子液体、季鱗盐离子液体或吡咯盐离子)，另一类是盐类(尿素、三羟甲基氨基甲烷-盐酸 盐、钠盐、钾盐、铵盐、醋酸盐、甲酸盐、碳酸盐、或磷酸盐）；
[0020] 若生物样品中含有阳离子表面活性剂和盐类或离子液体和盐类，则靠近注射器一 侧的捕集柱中填装强阳离子交换材料，生物样品的PH需调节至pH > 8 ;
[0021] 若生物样品中含有阴离子表面活性剂和盐类，则靠近注射器一侧的捕集柱中填装 强阴离子交换材料，生物样品的PH需调节至pH彡4。
[0022] 生物样品采用注射针，通过进样头注入，先后通过两根捕集柱和，并保留于反相捕 集柱上；
[0023] 最后，将样品从反相捕集柱上洗脱下来，收集洗脱液，即为纯化后的生物样品；
[0024] 样品从反相捕集柱上的洗脱时，只需采用注射器，通过进样头，向反相捕集柱内注 入体积浓度为80%的乙腈水溶液，即可将样品从反相捕集柱上洗脱下来并通过收集管收 集。
[0025] 该装置可用于含有表面活性剂和盐类或离子液体和盐类的蛋白质溶液的纯化。
[0026] 本发明具有如下优点：
[0027] 1.装置简单。只需通过保护柱与分析柱连接件将两根捕集柱串联即可。
[0028] 2.回收率高。表面活性剂和盐类的去除，通过单次进样，即可完成。减少了多次 进样过程中，管路及连接部件的吸附。
[0029] 3.方便、快捷。采用本发明中的装置，表面活性剂和盐类的去除可手动、离线操作， 且单次进样即可完成。
【专利附图】
【附图说明】
[0030] 图1.生物样品纯化流程图。
[0031] 图2.捕集柱再生示意图。
[0032] 图中：1 :注射器；2 :进样头；3 :强阳或强阴离子交换捕集柱；4 :保护柱与分析柱 连接件；5 :反相捕集柱；6 :废液管；7 :收集管
[0033] 图3.牛血清白蛋白的酶解产物未经纯化和纯化后的MALDI-T0F质谱图；A :未经 纯化的BSA酶解产物质谱图，B :经过纯化的BSA酶解产物质谱图。
【具体实施方式】
[0034] 1.装置构建：将强阴离子交换填料（日本东曹达，TSK-GELSuper Q-5PW，10 μ m， 1000 A)及C18反相填料(北京艾杰尔，Venusil XBP-C18, 5 μ m，120人）分别填装到两根捕 集柱3和5中，并将各部件按图1连接。
[0035] 2.捕集柱的平衡：按图1所示(上图），用注射器1，通过进样头2,注入50倍柱体 积的0. 1% (体积分数）的甲酸水溶液。
[0036] 3.样品的纯化、富集：按图1所示(上图），用注射器1，通过进样头2,注入500 μ L 摩尔浓度为〇. lmg/mL的牛血清白蛋白（BSA)酶解产物(含质量浓度0. 5%SDS，20mM NH4HCO3) 后，再用注射器1注入5倍柱体积的0. 1% (体积分数）的甲酸水溶液，BSA酶解产物被捕集 并富集于反相捕集柱5上。
[0037] 4.样品洗脱、收集：按图1所示(下图)，采用注射器1，通过进样头2,向反相捕集 柱5内注入80% (体积分数）的乙腈水溶液，将样品从反相捕集柱5上洗脱下来，并通过收 集管7收集样品。
[0038] 5.强阴离子交换捕集柱的再生：按图2所示，用注射器1，通过进样头2,注入50 倍柱体积的IM NaCl水溶液进行冲洗，洗脱吸附的SDS并活化强阴离子交换捕集柱3。
[0039] 6.将未经纯化的BSA酶解产物和步骤4中收集的纯化的BSA酶解产物，用 MALDI-T0F质谱检测。质谱图见图3,数据检索结果见表1。
[0040]
【权利要求】
1. 一种生物样品纯化的装置，其特征在于： 包括两根捕集柱和连接件，于强阳或强阴离子交换捕集柱（3)中填充强阳或强阴离子 交换材料，于反相捕集柱（5)中填充反相材料，两根捕集柱间用保护柱与分析柱连接件（4) 连接。
2. 根据权利要求1所述的装置，其特征在于： 样品固载过程中，于强阳/强阴离子交换捕集柱（3)的远离反相捕集柱（5)的一端设 有进样头（2)，进样头（2)与注射器（1)相连；反相捕集柱（5)的远离强阳/强阴离子交换 捕集柱（3)的一端与废液管（6)相连；该装置的连接顺序从进样端开始依次为：注射器（1) 与进样头（2)相连，进样头（2)与强阳/强阴离子交换捕集柱（3)相连，强阳/强阴离子交 换捕集柱（3)与保护柱与分析柱连接件（4)相连，保护柱与分析柱连接件（4)与反相捕集 柱（5)相连，反相捕集柱（5)与废液管（6)相连；生物样品采用注射针（1)，通过进样头（2) 注入，先后通过两根捕集柱（3)和（5)，并保留于反相捕集柱（5)上； 最后，将样品从反相捕集柱上洗脱下来，收集洗脱液，即为纯化后的生物样品；样品洗 脱过程中，从装置上取下反相捕集柱（5)，于反相捕集柱（5) -端设有进样头（2)，进样头 ⑵与注射器⑴相连；反相捕集柱（5)的另一端与收集管（7)相连，该装置的连接顺序从 进样端开始依次为：注射器（1)与进样头（2)相连，进样头（2)与反相捕集柱（5)相连，反 相捕集柱（5)与收集管（7)相连。
3. 根据权利要求1所述的装置，其特征在于： 强阳/强阴离子交换捕集柱（3)和反相捕集柱（5)的柱管内部为横截面直径为 0. 3-7mm的圆柱体，柱管长度为0. 5-3cm，材质为抛光不锈钢或石英毛细管或塑料；于捕集 柱的内部二端均设有筛板，筛板孔径为3nm_20 μ m。
4. 根据权利要求1所述的装置，其特征在于： 强阳离子交换材料为含有磺酸基团或磷酸基团的硅胶或聚合物基质材料(聚丙烯酸酯 类基质、聚苯乙烯类基质、聚丙烯酰胺类基质）；强阴离子交换材料为含有季铵基团的硅胶 或聚合物基质材料(聚丙烯酸酯类基质、聚苯乙烯类基质、聚丙烯酰胺类基质）； 反相材料为含有C4、C8、C12或C18基团的硅胶或聚合物基质材料（(聚丙烯酸酯类基 质、聚苯乙烯类基质、聚丙烯酰胺类基质)。
5. -种权利要求1、2、3或4所述装置的应用，其特征在于： 所述装置用于生物样品的纯化。
6. 根据权利要求5所述装置的应用，其特征在于： 所述生物样品为含有表面活性剂和盐的生物样品，为：细胞提取液、胞浆提取液、血浆 提取液、蛋白质溶液、或多肽溶液。
7. 根据权利要求6所述装置的应用，其特征在于： 单次注入样品，即可完成表面活性剂和盐类的同时去除。
8. 根据权利要求6或7所述装置的应用，其特征在于：需要纯化的生物样品中同时含 有两大类物质，一类是阳离子或阴离子表面活性剂或离子液体（阳离子表面活性剂包括胺 盐型表面活性剂、季铵盐型表面活性剂、杂环类阳离子表面活性剂、鎗盐型表面活性剂；阴 离子离子液体包括磺酸盐型、羧酸盐型、硫酸酯盐型、磷酸酯盐型表面活性剂；离子液体包 括咪唑类离子液体或吡啶类离子液体或季铵盐离子液体、季鱗盐离子液体和吡咯盐离子)， 另一类是盐类(尿素、三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐、钠盐、钾盐、铵盐、醋酸盐、甲酸盐、碳酸 盐、磷酸盐）； 若生物样品中含有阳离子表面活性剂和盐类或离子液体和盐类，则靠近注射器一侧的 捕集柱中填装强阳离子交换材料，生物样品的pH需调节至pH > 8 ; 若生物样品中含有阴离子表面活性剂和盐类，则靠近注射器一侧的捕集柱中填装强阴 离子交换材料，生物样品的pH需调节至pH彡4。
9. 根据权利要求8所述装置的应用，其特征在于： 生物样品采用注射针（1)，通过进样头（2)注入，先后通过两根捕集柱（3)和（5)，并保 留于反相捕集柱（5)上； 最后，将样品从反相捕集柱上洗脱下来，收集洗脱液，即为纯化后的生物样品； 样品从反相捕集柱上的洗脱时，只需采用注射器，通过进样头，向反相捕集柱内注入体 积浓度为80%的乙腈水溶液，即可将样品从反相捕集柱上洗脱下来并通过收集管收集。
10. 根据权利要求5或6所述装置的应用，其特征在于：该装置可用于含有表面活性剂 和盐类或离子液体和盐类的蛋白质溶液的纯化。
【文档编号】G01N1/34GK104236984SQ201310237476
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年6月14日 优先权日:2013年6月14日
【发明者】张丽华, 赵群, 杨开广, 吴慈, 张玉奎 申请人:中国科学院大连化学物理研究所