半乳凝素-9在系统性红斑狼疮或类似炎症性疾病中的作用的制作方法

半乳凝素-9在系统性红斑狼疮或类似炎症性疾病中的作用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及半乳凝素-9或其活性衍生物、或其药物学可接受的盐用于制备用于治疗系统性红斑狼疮疾病或相类似机制的炎症性疾病的药物的应用。本发明提供一种治疗系统性自身免疫疾病的方法，该方法包括将治疗有效量的半乳凝素-9或其活性衍生物、或其药物学可接受的盐，与药物学可接受的载体一起给药于有此需要的对象，其中所述的系统性自身免疫疾病得到有效治疗或缓解。
【专利说明】半乳凝素-9在系统性红斑狼疮或类似炎症性疾病中的作用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药领域。具体而言，本发明涉及半乳凝素-9或其活性衍生物、或其药物学可接受的盐用于制备用于治疗系统性自身免疫疾病的药物的应用。所述的系统性自身免疫疾病包括系统性红斑狼疮疾病或相类似机制的炎症性疾病。
【背景技术】
[0002]系统性红斑狼疮疾病(SLE)是一种原型系统性自身免疫疾病。成人系统性红斑狼疮诊断和治疗指南(Guidelines for Referral and Management of Systemic LupusErythematosus in Adults, Arthritis Rheuml999 ;42:1785)指出该病包括全身症状和病症，肌肉骨骼，皮肤，肾脏，肠胃系统，呼吸系统，心血管系统，网状内皮组织，血液和神经系统均有病变。其中皮肤表现是SLE中最为常见的，此外，血清学异常包括抗核抗体，双链DNA, SM，RNP, Ro/SSA和La/SSB的抗体，以及低补体水平。
[0003]SLE在美国每100，000人口中会发生40-50例。发病率为每年每十万人中有2_8例新增病例。受到种族基因的影响，在美国SLE在亚洲人，黑人和加勒比海人以及夏威夷人更为常见。在英国，印度裔亚洲人的SLE发病率较高(ArthritisRheum.1998 ；41:1714-24.Hormonal, environmental, and infectious riskfactors for developing systemiclupus erythematosus.Cooper GS, Dooley MA, Treadwell EL, St Clair EW, Parks CG,Gilkeson GS.)。SLE显著影响妊娠年龄的妇女可能与激素部分相关。该病可在任何年龄发病，儿童中，女性和男性的发病率之比为3: 1，在妊娠年龄期间，这个比例高达10: 1，而在老年人中降之为8: I。对于所有的SLE患者，女性与男性的整体发病率之比为9或10: I。约20%的患者在16岁之前发病，65%在16-65岁之间发病，而15%在55岁之后发病。
[0004]SLE可表现为各种器官的病变；疲劳(74-100% )、关节炎/关节痛(83_95%)、皮肤(80-91% )、发热(40-80 % `)、体重减轻(44-60 % )、肾病(34-73 %)、肠胃疾病(38-44% )、肺病(24-98%)、心脏病(20-46%)、淋巴结病(21-50%)、脾脏肿大(9-20%)、肝肿大(7-25 % )、中枢神经系统症状(25-75 % ) (Systemic Lupus Erythematosus:Clinical and Laboratory Features,Klippel JH,Crofford LJ，Stone JH，Weyand CM editon Primer on the Rheumatic Diseases，12th edition，2001 ;335_346)
[0005]系统性红斑狼疮的临床诊断分类目前是按照系统性红斑狼疮国际协作组(SLICC)在2009年ACR大会上公布了对ACR SLE分类标准的修订版。该分类标准包括临床标准11条:1.急性或亚急性皮肤狼疮；2.慢性皮肤狼疮；3.口腔或鼻咽部溃疡；4.非瘢痕形成引起的脱发；5.炎性滑膜炎:医生观察到的两个或以上肿胀关节或者伴有晨僵的压痛关节；6.浆膜炎；7.肾脏:尿蛋白/肌酐异常(或24hr尿蛋白> 500mg)或红细胞管型；8.神经系统:癫痫发作，精神异常，多发性单神经炎，脊髓炎，外周或颅神经病，脑炎(急性精神错乱状态)溶血性贫血；10.白细胞减少(< 4000/mm3，至少一次)或淋巴细胞减少(< 1000/mm3至少一次)；11.血小板减少(< 100，000/mm3，至少一次)；免疫学标准6条:
1.ANA高于实验室正常参考值范围；2.抗dsDNA抗体高于实验室正常参考值范围(ELISA方法则要两次均高于实验室正常参考值范围)；3.抗Sm抗体；4.抗磷脂抗体包括狼疮抗凝物，梅毒试验假阳性，抗心磷脂抗体(至少两次异常或中高滴度)，抗_b2gpl ;5.低补体包括低C3、低C4、低CH50 ；6.直接Coombs试验阳性(非溶血性贫血状态)。确定SLE需符合
1.肾活检证实为狼疮肾炎且ANA阳性或抗dsDNA阳性或2.满足四条标准，包括至少一条临床标准和至少一条免疫学标准。。[0006]SLE的治疗目前总的来说是缺乏系统性药物治疗方案的。目前的治疗手段包括免疫抑制剂如环磷酰胺、甲氨蝶呤和霉酚酸吗乙酯。对轻微的SLE的治疗主要用非留类抗炎药物和镇痛药治疗发热、关节炎等。可适当增加抗疟疾药如羟氯喹和皮质类固醇以控制关节痛。中重度时采用皮质类固醇和类固醇如硫唑嘌呤、环磷酰胺等,但长期使用皮质类固醇和类固酉享药物有可倉泛造成心血管并发症。(Development of autoantibodies before theclinical onset of systemic lupus erythematosus.Arbuckle MRiMcClain MTiRubertoneMV，Scofield RH，Dennis GJ，James JA，Harley JB.N Engl J Med.2003 ；349:1526-33.)，不仅如此，长期使用皮质类固醇和类固醇药物还可能造成骨质疏松，骨无血管性坏死，库兴样特征，皮肤变化，肌肉萎缩和肌无力等等。临床上一直在探索新的治疗途径。
[0007]1.干扰素-a (IFN- α )和浆细胞样树突细胞在SLE中的作用
[0008]1982年，Preble等在SLE患者的血清里发现了干扰素的活动(Preble 0T, BlackRJ, Friedman RM, Klippel JH, Vilcek J.Science.1982 ；216:429-31.Systemic lupuserythematosus:presence in human serum of an unusual acid-labile leukocyteinterferon) ; 1990年，Ronnblom等在使用I型干扰素时发现干扰素(IFN)-α/ β可诱导自身免疫(R6nnblom LE, Aim GV, Oberg KE.J Intern Med.1990 ；227:207-10.Possibleinduction of systemic lupus erythematosus by interferon-alpha treatment in apatient with a malignant carcinoid tumour.)。之后大量的有关 IFN-α 诱发产生包括抗核抗体，抗双链DNA抗体在内的红斑狼疮临床病例被发现；活动期SLE患者血清IFN-水平升高，并与疾病活动性、抗dsDNA滴度显著相关。
[0009]I型IFN是由13种功能性IFN-α基因、I种IFN-β基因、I种IFNF-Θ基因、I种IFN-K基因和I种IFN-ω基因表达的细胞因子组成。(Immunol Rev.2005 ；24:9-26)。
[0010]几乎所有的细胞都可以被病毒和细菌刺激产生I型IFN，但浆细胞样树突细胞(pDC)是天然的产生IFN细胞，比其他细胞类型高出1000倍。用单链RNA(ssRNA)、细菌DNA中的低甲基化CpG、或自身抗原-抗体免疫复合物刺激细胞的Toll样受体(TLR)可诱导I型IFN的产生。
[0011]树突细胞是一类在免疫应答与免疫耐受中发挥重要作用的免疫细胞，其最突出的功能特点是在病毒刺激下产生大量的I型干扰素，因此又被称为是天然I型干扰素产生细胞。树突状细胞是迄今所知的功能最强的抗原提呈细胞，Toll样受体(Toll-likereceptors, TLRs)是其重要的模式识别受体，在DCs分化和功能成熟中发挥重要作用。它通过识别细菌、虫体、真菌和病毒等保守的病原相关分子模式(pathogenassociatedmolecularpatterns, PAMPs)而捕获病原体,刺激DCs分化和功能成熟。
[0012]未成熟浆细胞样树突细胞主要通过TLR-NF- κ B途径识别并捕获抗原，在其成熟过程中同时发生迁移，由外周组织进入次级淋巴器官的T细胞依赖区，有效地将抗原提呈给初始T细胞并使之激活，触发免疫应答。多种因素可影响浆细胞样树突细胞功能，如脂多糖、病毒、免疫抑制剂、T调节细胞、细胞因子、肿瘤抗原等。
[0013]浆细胞样树突细胞它在抗病毒、抗HIV感染以及自身免疫反应等方面均发挥十分重要的作用(Fitzgerald-Bocarsly, Jihong Dai, Sukhwinder Singh, et alPlasmacytoiddendritic cells and type I IFN:50years of convergent history.Cytokine &Growth Factor Reviews.2008，19:3-19)。通过大量产生I型干扰素、细胞因子、趋化因子以及与其它细胞之间的相互作用等途径，浆细胞样树突细胞广泛地参与到机体的固有免疫和适应性免疫应答过程中。它可以调控NK、T、B等细胞参与免疫反应的强度、持续时间以及应答方式，从而在肿瘤、感染和自身免疫性疾病过程中均发挥十分重要的功能(Colonna M.Toll-like receptors and IFN-alpha:partners in autoimmunity.J ClinInvest.2006，116:2319-22)。
[0014]研究表明:不同的病毒在初次感染机体时，一般都可诱导浆细胞样树突细胞产生I型干扰素来抵抗病毒感染，并递呈抗原给T细胞和B细胞诱导特异性的免疫应答。持续性病毒感染患者当再次感染时，浆细胞样树突细胞的免疫剌激功能降低，从这些病人体内分离的衆细胞样树突细胞表现出很弱的T细胞剌激增殖作用(van der Molen RG，SprengersD，Binda RS, et al.Functional impairment of myeloid and plasmacytoid dendriticcells of patienwith chronic hepatitis B.Hepatology.2004，40:738_7460 MurakamiH，Akbar SM，Matsni H，et al.Decreased interferon—alphaproduction and impairedT heIperIpolarization by dendritic cells from patient with chronichepatitisC.Clin Exp.2004,137:559_565。Feldman S，Stein D，Amrute S，et al.Decreasedinterferon alpha production in HIV-1nfected patients correlates with numericaland functional deficiencies in circulating type2dendritic cell precursors.ClinImmunol.2001，101:201-210)。病毒可通过直接感染使浆细胞样树突细胞失能(PatteixmS，RaeA, HockeyN, et a·l.Plasmacytoid dendritic cells are highly susceptible tohuman immunodeficiency virus type I infection and release infectious virus.J Viml.2001，75:6710_6713。Mengshol JA, Golden-Mason L, Castel-blanco N，etal.1mpaired plasmacytoid dendritic cell maturation and differential chemotaxisin chronic hepatitis C virus !associations with antiviral treatment outcomes.Gut.2009,58:964-73o Amjad M，Abdel-Haq N，Faisal M，Kamal M，Moudgal V.Decreasedinterferon-alpha production and impaired regulatory function of plasmacytoiddendritic cells induced by the hepatitis C virus NS5protein.MicrobiolImmunol.2008,52(10):499-507)。
[0015]HIV感染者和艾滋病人外周血中浆细胞样树突细胞数目减少，功能降低，而在长时间存活的HIV阳性病人，其外周血浆细胞样树突细胞的数目与HIV感染者、艾滋病人，甚至正常人相比并未减少反而增多，并有活性的增强。浆细胞样树突细胞高的HIV感染者其外周血HIV的RNA检测到低，甚至检测不到。体内研究证实浆细胞样树突细胞及其分泌的IFN-α可抑制HIV的复制。进一步的研究发现艾滋病病人外周血浆细胞样树突细胞低下与巨细胞病毒感染、进展性多灶性淋巴细胞浸润性脑炎和卡氏肺囊虫的发生有关(SoumefisV，Scott I，Liu YJ, et al.Natural typelIFN producing cells in HIV infection.HumInmaunol.2002，63:1206_1212。Soumelis V，Scott I，Gheyas F，et al.Depletion ofcirculating natural typellFN-producing cells in HIV-1nfected patients.Blood,2001,98:906-912)。因此，增强浆细胞样树突细胞分泌IFN-α的试剂可以为有效治疗免疫功能低下所导致的病毒长期感染及HIV感染提供新的途径。
[0016]研究表明浆细胞样树突细胞在系统性红斑狼疮疾病的发病中起了非常重要的作用。在活动期SLE病人的外周血中发现了可诱导浆细胞样树突细胞产生I型干扰素的诱导因子。在SLE的发病机制中，浆细胞样树突细胞及其分泌的IFN-a起到了至关重要的作用。SLE病人组织损伤产生的凋亡细胞和血清中的自身抗体结合后，形成免疫复合物，刺激浆细胞样树突细胞分泌大量的IFN-α，而分泌的IFN-α可诱导单核细胞向树突细胞分化，单核细胞转化的树突细胞摄取凋亡细胞后递呈自身抗原给自身反应性T细胞,并促进自身反应性B细胞的增殖，大量产生自身抗体，自身抗体的产生又加剧了组织的损伤，形成了一个恶性的循环(Banchereau J, Paczesny S, Blanco P, et al.Dendritic cells:controllersof the immune system and a new promise for immunotherapy.Ann NY Acad Sci,2003,987:180-187)。
[0017]2.半乳凝素和半乳凝素-9
[0018]半乳凝素(Galectin)是一类β _半乳糖苷结合蛋白的总称，属于凝集素家族，至今为止已有15位半乳凝素家族成员被发现，他们均含有以下2个特性:1)含特征性的氨基酸序列。由大约130个高度保守的氨基酸序列组成糖识别结构域(carbohydraterecognition domain, CRD) ；2)对β-半乳糖苷的亲和性。半乳凝素属于可溶性蛋白质，存在于细胞中或分泌到胞外。 [0019]半乳凝素缺乏信号肽，它在胞质中合成，不经过内质网、高尔基体，而由小泡直接分泌到细胞外。这种特殊的分泌方式避免了半乳凝素过早地和新生成的糖蛋白上的寡糖黏附。半乳凝素通过与细胞表面复合糖上的β_半乳糖苷结合，而发挥调节细生存和信号转导的生物学功能。半乳凝素的多价性会引导特定细胞表面的糖受体交联、凝集，与细胞的信号转导有关。半乳凝素家族个体成员的多价性在发挥不同生物学效应中起重要作用，具有参与细胞生长和凋亡、细胞黏附、血管形成及mRNA剪切等多种生物学功能，与许多肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移密切相关。
[0020]半乳凝素-9 (Galectin-9)是1997年由Wada等从鼠胚肾组织中分离出来的，随后由Tureci等在结节性硬化型霍奇金淋巴瘤的肿瘤组织中克隆并命名(WadaJ，Kanwar YS.1dentification and characterization of galectin-9, a NovelB-galactoside-binding mammalian lectin.J Biol Chem，1997，272:6078-6086.Tureci0，SchmittH，Fadle N.et al Molecular definition of a novelhuman galectin which isimmunogenic in patients with hodgkin’sdisease.J B iolChem，1997，272:6416-6422)。它具有半乳凝素家族成员特征性的保守氨基酸序列并在过敏反应中能起到诱导嗜酸粒细胞聚集和活化的功能。半乳凝素-9在人体组织中广泛分布于肺脏、胰岛细胞、肝脏、扁桃体、肠管和多种免疫细胞中，且在多种肿瘤组织中也有表达。
[0021]研究表明，半乳凝素-9广泛参与了体内的调节细胞的发育、分化，诱导细胞凋亡以及抗肿瘤等多种生物学活动。半乳凝素-9的特异性受体现在发现的有T细胞免疫球蛋白及黏蛋白-3 (Tcell Igmucin-3, Tim-3),半乳凝素-9/Tim_3结合后的信号通路是通过:I)诱导T细胞凋亡在免疫耐受的诱导及自身免疫病防治中发挥重要作用；2)活化树突状细胞促进机体的免疫应答。但是半乳凝素-9通过何种机制介导不同的功能的机理目前仍不清楚。
[0022]半乳凝素-9的诱导细胞凋亡功能:Sdinchez-Fueyo等的研究发现(Sdinchez-FueyoA, Tian J, Picarella D, et al.Tim_3inhibits Thelper type 1-mediated auto—anda.11oimmune responses and promotesimmunological tolerance.Nat Immunol,2003,4:1050-1052.)半乳凝素-9对于Thl细胞免疫的调节是负调节作用，半乳凝素_9结合Tim_3分子后可以下调自身免疫性疾病，诱导免疫耐受，导致了 T效应细胞的凋亡。这在自身免疫性糖尿病小鼠(Chou FC, Shieh SJ, Sytwu HK.Attenuation of Thlresponsethroughgalectin_9and Tcell Ig mucin3interaction inhibits autoimmunediabetes in NODmice.Eur J Immunol，2009，39:2403-2411]模型，以及炎性肠道疾病的小鼠模型[Li X，Chen G, Li Y, et al.1nvolvement of T cell Ig mucin-3 (Tim-3) in the negativeregulation of inflammatory bowel disease.Clin Immunol, 2010,134:169-177]都得至Ij的证实。在对类风湿性关节炎患者外周血⑶4+T细胞的研究中发现Tim-3可能直接参与类风湿性关节炎的发病，Seki 等(Seki M, Oomizu S, Sakata KM, et al.Galectin_9suppressesthegeneration of Thl7, promotes the induction of regulatory T cells, andregulates experimental autoimmune arthritis.Clin Immunol, 2008,127:78-88)。
[0023]经研究证明，半乳凝素-9与Thl7细胞表面的Tim-3分子结合可以诱导Thl7细胞凋亡，并可促进调节性T细胞因子的分泌，缓解类风湿性关节炎症状。同样在多发性硬化实验性自身免疫性脑脊髓炎的动物模型中，半乳凝素_9/Tim-3通路通过诱导Thl效应细胞凋亡，降低了自身免疫性EAE小鼠的发病程度及死亡率(Zhu C，Anderson AC，Schubart A,et al.The Tim-3ligand galectin-9negatively regulates T helper type I immunity.NatImmunoI, 2005,6:1245-1252)。
[0024]半乳凝素-9的肿瘤免疫功能:半乳凝素-9可诱导骨髓瘤细胞凋亡和影响肿瘤细胞转移。重组半乳凝素-9可通过活化了 JNK和P38-MAPK信号通路和caspase8、9、3参与的细胞凋亡途径实现对5种骨髓瘤细胞的增殖抑制(Kobayashi T, Kuroda J, AshiharaE, et al.Galectin-9exhibitsant1-mye1ma activity through JNK and p38MAP kinasepathways.Leukemia, 2010, 24:843-850)。半乳凝素-9可以通过作用于Jurkat细胞表面的N-聚糖诱导 Jurkat 细胞凋亡(Lu LH, Nakagawa R, Kashio Y, et al.Characterization ofgalectin-9-1nduced death of Jurkat T cells.J Biochem，2007，141:157-172)。乳腺癌细胞中高表达半乳凝素-9的亚克隆细胞MCF-7在体外培养增殖时表现为聚集成簇，而低表达半乳凝素 _9 的亚克隆细胞不聚集(Irie A, Yamauchi A, Kontani K, et al.Galectin_9asa prognosticfactor with antimetastatic potential in breast cancer.ClinCancerRes, 2005,11:2962-2968)。说明半乳凝素_9可诱导乳腺癌细胞的聚集，影响细胞的远程转移。
[0025]目前的研究局限在自身免疫性糖尿病小鼠，炎性肠道疾病的小鼠，多发性硬化实验性自身免疫性脑脊髓炎的动物模型中，在临床病例中类风湿性关节炎患者外周血和体外肿瘤细胞上也有过初步的探讨，但目前尚无半乳凝素-9在SLE疾病上的作用的研究报到。在治疗SLE疾病的机理上，把抑制浆细胞样树突细胞产生过多的IFN-α，当作有效治疗和缓解SLE疾病发生和进行的有效途径和手段。
[0026]2.1.半乳凝素-9及其亚型
[0027]半乳凝素-9是在人类中由LGALS9基因编码的蛋白质。(Tureci O, Schmitt H，Fadle N, Pfreundschuh M, Sahin U (1997)." Molecular definition of a novel humangalectin which is immunogenic in patients with Hodgkin' s disease".J BiolChem272(10):6416-22; " Entrez Gene:LGALS91ectin, galactoside-binding, soluble,9(galectin9) ".http://www.ncb1.nlm.nih.gov/sites/entrez ? Db = gene&Cmd =ShowDetailView&TermToSearch = 3965.)作为半乳凝素家族一员，半乳凝素-9含有两个糖识别结构域(carbohydraterecognition domains, CRD)结构，即 N 端 CRD(含有 148个氨基酸)和C端CRD (含有149个氨基酸)，两者由一条肽链连接。依据其肽链长度的不同，可将半乳凝素-9分为三类:长链半乳凝素-9(galectin9L，肽链58个氨基酸，分子量约43，500)、中链半乳凝素_9(galectin9M，肽链26个氨基酸，分子量约39，900)和短链半乳凝素-9 (galectin9S,肽链14个氨基酸，分子量约38700)。(TureciO, SchmittH,FadleN,PfreundschuhM and SahinU.Molecular definition of a novel human galectinwhich is immunogenicin patients with Hodgkin' s diseasel997.J.Biol.Chem.272,6416-6422.MatsumotoR, MatsumotoH, SekiM, HataM, AsanoY, KanegasakiS, StevensRL andHirashimaM.Human ecalectin,a variant of human galectin-9,is a novel eosinophilchemoattractant produced by T lymphocytes1998.J.Biol.Chem.273,16976-16984)
[0028]2.2.半乳凝素-9的衍生物
[0029]半乳凝素-9可以通过改进蛋白质结构来加强或减弱其功能，如在基因的某一点的定点突变、或一个/几个基因的缺失突变、或插入基因片段。也可利用与Fe或白蛋白等的融合蛋白以及化学修饰 等形式来延长其代谢。
[0030]长效的蛋白质药物的技术方法包括:蛋白药物的化学修饰、蛋白质融合、微囊化/纳米粒、糖基化、构建抗蛋白酶突变体等。
[0031]化学修饰是将分子量小的蛋白质药物共价连接到具有较大分子量的分子上，例如聚乙二醇，共价连接到大分子上能减小免疫原性，改善可溶性和生物学利用度，以及增加抗蛋白水解作用，同时也能够延长半衰期。聚乙二醇(polyethylenelycol, PEG)是由环氧乙烷聚合而成的大分子聚合物，PEG类修饰剂和其他修饰剂相比，具有无毒性，良好的溶解性，免疫原性低，且相对分子量范围宽，选择余地大等优点。而且PEG可以将它的许多优良特性赋予修饰后的生物分子。经聚乙二醇共价修饰后，蛋白质药物的相对分子质量有所增加，减少了药物排泄，增加其抵抗蛋白酶分解的稳定性，降低免疫原性，这些改变均有利于延长药物在体内的半衰期，从而，蛋白质药物的药代动力学和药效性质得到明显改善。1991年，第一种经聚乙二醇修饰的蛋白质药物-PEG腺苷脱氨酶被FDA批准上市，用于治疗一种严重的儿童免疫缺陷症。2001年，PEG修饰的干扰素(PEG Intron)获FDA批准上市，用于治疗慢性丙型肝炎。
[0032]蛋白质融合是将两个或多个基因的编码区首尾连接，由同一调控序列控制构成的基因表达产物。此技术具有设计简单，构建时不需要插入连接序列而直接在C端或N端融合。常选用人血清白蛋白(HSA)或免疫球蛋白(IgG)的Fe片段应用最为广泛。人血清白蛋白是血浆中含量最多的蛋白，分子量67kDa，它在血管和血管外室的循环中分布广，半衰期可达到19天，且结构非常稳定，无明显的免疫原性，是血液中重要的物质输送和药物运输载体，所以它成为药物设计理想的载体蛋白，用于改善药物的半衰期，延迟药物清除，增加药物暴露，减少注射频率，改善病人对治疗的顺从性和耐受性。
[0033]另一种蛋白质融合技术是Fe融合。抗体Fe段所特有的生物学功能与某些多肽或蛋白融合也可增加该蛋白质的血浆半衰期。人IgG免疫球蛋白是体内的主要抗体，它的半衰期约为20天。IgG融合蛋白的构建方式大多是将IgG的Fe (Hinge CH2，CH3)片段或CH(CHlHinge CH2，CH3)片段的N端与活性蛋白的C端相连。
[0034]微囊化技术也是一种长效的蛋白质药物的技术，它能增强治疗因子的药代动力学特性，改进药物稳定性以及使药物靶向释放等。用微囊包埋蛋白质和多肽药物，不仅可以通过缓释作用实现长效皮下注射制剂，而且可以通过微囊表面和粒径的设计，实现口服、黏膜给药、吸入等新剂型。技术的原理是将药物活性部分包封于聚合层中，通过皮下或肌肉给药，聚合层随着时间减少，使药物从微囊中缓慢持续释放，这有利于稳定药物，减少胃肠道酶的破坏，改变其体内运转过程，延长药物在体内的作用时间。Medus持续释放系统也被用于蛋白质药物缓释过程中，它是由多聚L-谷氨酸骨架组成，带有疏水的生育酚分子，形成毫微球粒的胶体悬液。由于毫微球粒的疏水区域的药物相互作用产生了持续释放药物的效果。在体内，蛋白质药物被生理溶液中内源蛋白代替，导致药物缓释。蛋白质药物最高浓度显著降低，药物释放明显延长。
[0035]抗蛋白酶突变体:因为蛋白质很容易被内源血清中或组织中蛋白酶分解，并且蛋白酶对蛋白的降解可以发生在吸收、分布及排泄等各个阶段，这就直接影响药物的体内半衰期、生物利用度、血浆清除率等参数。将一个或多个抗蛋白水解突变体引入到生物活性分子上，是长效的蛋白质药物的药物设计和发展的要点。这些变体发生细小的构象变化，导致增强抗蛋白水解作用。
[0036]糖基化:蛋白质表面的糖链能够影响蛋白的药物动力学性质、生物活性和稳定性等，并且，糖基化是某些蛋白质发挥生物活性所必需的。对比治疗性蛋白质的糖基化形式和非糖基化形式，一方面蛋白质药物表面增加了侧链，提高蛋白质稳定性，阻碍蛋白酶对蛋白药物的降解作用，另一方面使蛋`白质药物分子量增大，减少肾小球滤过。
[0037]本领域的技术人员应该理解，本文引用的参考文献不应视为承认是请求保护的本发明的现有技术。

【发明内容】

[0038]本发明人对半乳凝素对浆细胞样树突细胞的影响进行了一系列的研究，对照了在各类刺激物影响下I型干扰素分泌的情况，发现半乳凝素-9能够抑制在系统性红斑狼疮疾病中被激活的树突细胞I型干扰素的分泌，从而起到抑制系统性红斑狼疮疾病的病理发展，减缓症状的作用。因此，本发明提供一种新型的治疗系统性红斑狼疮疾病或相类似机制的炎症性疾病的方法。具体地，所述方法使用半乳凝素-9进行。
[0039]另外，本发明提供半乳凝素-9或其活性衍生物、或其药物学可接受的盐用于制备用于治疗系统性红斑狼疮疾病或相类似机制的炎症性疾病的药物的应用。
[0040]在本发明的第一方面中，本发明提供一种治疗系统性自身免疫疾病的方法，该方法包括将治疗有效量的半乳凝素-9或其活性衍生物、或其药物学可接受的盐，与药物学可接受的载体一起给药于有此需要的对象，其中所述的系统性自身免疫疾病得到有效治疗或缓解。
[0041]在一个实施方案中，所述系统性自身免疫疾病是系统性红斑狼疮疾病(SLE)或相类似机制的炎症性疾病。
[0042]在一个实施方案中，所述半乳凝素-9是是长链、中链，或短链半乳凝素_9。
[0043]在一个实施方案中，所述半乳凝素-9包括N端糖识别结构域CRD和C端糖识别结构域CRD。在一个优选实施方案中，所述半乳凝素-9是氨基酸序列SEQ ID No:l。
[0044]在一个实施方案中，所述半乳凝素-9活性衍生物是化学修饰的半乳凝素_9。在一个进一步的实施方案中，所述半乳凝素-9活性衍生物是聚乙二醇修饰的半乳凝素_9。
[0045]在一个实施方案中，所述半乳凝素-9活性衍生物是含有半乳凝素-9序列的融合蛋白。在一个优选的实施方案中，所述半乳凝素-9活性衍生物是半乳凝素-9与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白。在又一个实施方案中，所述半乳凝素-9活性衍生物是半乳凝素-9与免疫球蛋白(IgG)的Fe片段的融合蛋白。
[0046]本发明还提供半乳凝素-9或其活性衍生物、或其药物学可接受的盐用于制备用于治疗系统性红斑狼疮疾病或相类似机制的炎症性疾病的药物的应用。其中术语“乳凝素-9或其活性衍生物、或其药物学可接受的盐”具有与上述相同的定义。
[0047]在本发明的第二方面中，本发明还提供一种调节体内干扰素水平的方法，该方法包括将有效量的半乳凝素-9或其活性衍生物、或其药物学可接受的盐，与药物学可接受的载体一起给药于有此需要的对象，其中所述的体内干扰素水平得到调节。在一个进一步实施方案中，所述调节是降低。
[0048]在一个实施方案中，其中所述干扰素是I型干扰素。
[0049]本发明还提供乳凝素-9或其活性衍生物、或其药物学可接受的盐用于制备调节体内干扰素水平的药物的应用。其中术语“乳凝素-9或其活性衍生物、或其药物学可接受的盐”具有与上述相同的定义。
[0050]在本发明的第三方面中，本发明提供一种抑制浆细胞样树突细胞产生干扰素能力的方法，所述方法包括使半乳凝素-9或其活性衍生物接触浆细胞样树突细胞。
[0051 ] 在本发明的第四方面中，本发明还提供一种抑制炎症的方法，该方法包括将有效量的半乳凝素-9或其活性衍生物、或其药物学可接受的盐，与药物学可接受的载体一起给药于有此需要的对象，其中所述的炎症得到有效抑制。
[0052]在一个实施方案中，所述炎症是由系统性红斑狼疮或相类似机制的炎症性疾病引起的。在另一个实施方案中，所述炎症是由I型干扰素引起的。
[0053]本发明还提供半乳凝素-9或其活性衍生物、或其药物学可接受的盐用于制备用于治疗由I型干扰素引起的炎症的药物的应用。
[0054]本领域技术人员应该理解，术语“半乳凝素-9活性变种”包括任何与半乳凝素-9具有大致相同的功能和/或生物特性(如结合受体的能力)和/或大致相同结构(即氨基酸序列)的化合物或复合物。术语“半乳凝素-9活性衍生物”包括任何含有半乳凝素-9或半乳凝素-9活性变种的化合物或复合物。
[0055]从本文提供 的其它描述，包括不同实施例，本发明的其他特征和优点将是显而易见的。所提供的实施例举例说明在实践本发明中有用的不同组分和方法。实施例不限制请求保护的本发明。基于本公开内容，本领域技术人员可以鉴定和采用对于实践本发明有用的其他组分和方法。
【专利附图】

【附图说明】
[0056]从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中:
[0057]图1.人半乳凝素-9蛋白(长链)序列(SEQ ID No:1)；
[0058]图2.人树突细胞(2万个细胞)在不同培养条件下分泌IFN-a的情况。在培养液中加入各种刺激物共培养16个小时，其中一组加有Galectin-9 (4ug/ml)，用ELISA方法测定 IFN-a。
[0059]图3.人树突细胞(2万个细胞)在与CpG2216并分别在不同浓度的人重组Galectin-9蛋白或Galectin-1蛋白的条件下共培养16个小时，用ELISA方法测定IFN_a分泌情况。
【具体实施方式】
[0060]下文提供了实施例以进一步举例说明本发明的不同特征。这些实施例仅是用于举例说明对于实践本发明有用的方法。这些实施例对请求保护的本发明不构成限制。
[0061 ] 实施例1重组人半乳凝素-9 (Gal-9)蛋白的表达:
[0062]通过化学合成的方法，设计合成重组人Gal-9蛋白基因的序列(SEQ ID No:2)，其序列包括长度为Ala2-Thr323共322AA，(NCBI Accession#BAA31542)，前端加入与表达载体相连的Not I酶切位点，6个His(用于亲和层析，与镍柱结合，减少纯化步骤)和EK酶切位点，还包括终止密码子TAA，·及克隆用KpNI限制性内切酶接头共9bp。
[0063]用限制型内切酶Not I和KpNI将上述重组人Gal_9蛋白基因单体切下，与经NotI及KpN I酶切的载体pET32a连接，转化大肠杆菌，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子。经质粒提取，酶切鉴定后证明重组人Gal-9蛋白基因单体已克隆至pET32a中。用CaCl2法将pET32a转化大肠杆菌BL21/DE3感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子，经质粒检测和酶切分析获得含有pET32a的重组转化子BL21/pET32a。
[0064]利用大肠杆菌工程菌BL21/pET32a生产重组人Gal_9蛋白。挑取大肠杆菌工程菌BL21/pET32a，接种于LB培养基中，接种量I~2% V/V，于30°C培养过夜，次日在无菌条件下将上述培养好的种子培养基按1: 10V/V或1: 5V/V接种于发酵培养基上，30°C发酵至0.D600达到0.4~0.8，升温至42°C诱导，3~5小时后离心收菌；取少量细胞加2X上样缓冲液，按标准做SDS-PAGE凝胶电泳，经诱导的BL21/pET32a的碎菌后的上清在20kD的位置出现一条新的蛋白带，转化PET32空载体的BL21/DE3菌和经诱导的BL2 l/pET32a的碎菌后的沉淀中不出现此条带，证明重组蛋自在BL21/pET32a中诱导可溶表达。表达的重组蛋白的纯化是将上述收集菌体用NaCl加磷酸盐缓冲液(pH7.0-8.0)悬浮，超声破碎，4°C离心，收集上清，得粗提液。将粗提液进行SephaCryl5200分子筛纯化，收集特征峰(第二洗脱峰)即为纯化的重组蛋白，其纯度可达90%以上。
[0065]检测重组蛋白是利用抗体结合活性的试验。在96孔板中每孔包被重组蛋白样品IOOul，37°C，Ih ;孔以IOOul的1%的BSA封闭，37°C，lh ;每孔加入抗人Gal_9蛋白抗体(购自Abcom公司)，37°C，Ih ;每孔加IOOul 二抗的1: 1000辣根过氧化物酶标记抗体，37°C，Ih;经ELISA检测表明本发明提取的重组蛋白与人Gal-9蛋白抗体结合活性强，每孔包被ng水平重组蛋白即可获得明显的检测信号，结果显示本发明提供的重组蛋白可用于抗体的检测。
[0066]实施例2人浆细胞样树突细胞的培养以及影响浆细胞样树突细胞I型干扰素分泌的研究
[0067]材料和方法:
[0068]R848 (I μ g/mL)(购自 InvivoGen, San Diego, CA)
[0069]CpG typeA 寡脱氧核苷酸链(2216，5 μ Μ)，type B (2006，5 μ Μ)，type C(C274,5 μ Μ)
[0070]Y-辐射的单纯疱疹病毒(HSV)-1 (KOS strain ；10PFU/cell)
[0071]流感病毒(PR8strain；IOPFU/cell)
[0072]仙台病毒(Sendaivirus) (Cantellstrain ；5PFU/cell)
[0073]重组Galectin-1 (购自 R&D Systems, Minneapolis, MN)
[0074]重组人GM-CSF(lOOng/mL,购自 R&D Systems, Minneapolis, MN)
[0075]重组人IL-4(200ng/mL,购自 R&D Systems, Minneapolis, MN)
[0076]IFN-α ELISA kit(PBL, Biomedical Laboratories, Piscataway, NJ)
[0077]人CD14 微珠(购自 Miltenyi Biotec, Auburn, CA)
[0078]BDCA4+分离试剂盒(购自 Miltenyi Biotec, Auburn, CA)
[0079]抗人CD123-PE
[0080]抗人CD14-PE
[0081]抗人BDCA2-FITC
[0082]抗人CD 11 c-APC
[0083]抗人CD4-APC_Cy7
[0084]实验步骤:
[0085]人浆细胞样树突细胞的培养。人外周血单核细胞获取是采新鲜抗凝健康人外周血，肝素抗凝后，用Ficoll密度梯度离心法分离患者外周血的单个核细胞。PBS洗去血小板，浆细胞样树突细胞的分离是利用流式细胞分选仪进行的(FACS Aria，BD Biosciences,Sunnyvale, CA)。经过抗-CD123-PE ;抗-CDlIc-APC 或抗-CDllc-PE ;FITC_ 标记的 mAbs 和抗-CD4-APC-Cy7混合物的筛选将CD123high/CDllc7lineage7CD4+浆细胞样树突细胞分离出来，并按照BDCA2的标准分离纯度达到99%以上。台盼蓝染色，细胞活率须> 98%。
[0086]部分研究中在分离患者外周血的单个核细胞后，将悬浮单个核细胞利用流式细胞分选仪进行的ant1-⑶14-PE的的筛选或用⑶14磁珠将⑶14+细胞分离出来。⑶14+单个核细胞细胞悬液铺在培养皿中，加入扩增浆细胞样树突细胞培养液，其为含100ng/ml GM-CSF和200ng/ml IL-4。培养5天后，获得未成熟的树突细胞。
[0087]将细胞浓度为I X IO5个/200uL，接种于96孔培养板，200uL/孔，分别加入R848，CpG,流感病毒(PR8strain ;10PFU/cell),仙台病毒(Cantellstrain ;5PFU/cell),血清等，其中一组加入人重组半乳凝素_9(4ug/ml)然后置于37%，5% CO2培养箱内培养16小时。
[0088]IFN-a因子的检测。培养16小时的上清转入独立1.5mL离心管中。以IFN kit检测上清液中的I型干扰素的含量，具体操作参照试剂盒说明书进，用酶标仪(A450nm波长)测定各孔吸光度，与标准曲线对照，求出IFN值。
[0089]结果如图2所示:
[0090]人树突细胞(2万个细胞/每孔)在不同培养条件下的分泌IFN-a情况。在培养液中加入各种刺激物共培养16个小时,其中一组加有Galectin-9 (4ug/ml)，用ELISA方法测定IFN-a。
[0091]实施例3半乳凝素-9对浆细胞样树突细胞I型干扰素分泌的抑制作用的研究
[0092]材料和方法:
[0093]R848 (I μ g/mL)(购自 InvivoGen, San Diego, CA)
[0094]CpG typeA 寡脱氧核苷酸链(2216，5 μ Μ)，type B (2006，5 μ Μ)，type C(C274,5 μ Μ)
[0095]Y-辐射的单纯疱疹病毒(HSV)-1 (KOS strain ；10PFU/cell)
[0096]流感病毒(PR8strain；IOPFU/cell)
[0097]仙台病毒(Cantellstrain；5PFU/cell)
[0098]重组Galectin-l (R&D Systems, Minneapolis, MN) [0099]重组人GM-CSF(lOOng/mL,购自 R&D Systems, Minneapolis, MN)
[0100]重组人IL-4(200ng/mL,购自 R&D Systems, Minneapolis, MN)
[0101]IFN-α ELISA kit(PBL, Biomedical Laboratories, Piscataway, NJ)
[0102]人CD14 微珠(购自 Miltenyi Biotec, Auburn, CA)
[0103]BDCA4+分离试剂盒(购自 Miltenyi Biotec, Auburn, CA)
[0104]抗人CD123-PE、抗人 CD14-PE、抗人 BDCA2-FITC、抗人 CDllc_APC、抗人CD4-APC-Cy7
[0105]实验步骤:
[0106]人浆细胞样树突细胞的培养。人外周血单核细胞获取是采新鲜抗凝健康人外周血，肝素抗凝后，用Ficoll密度梯度离心法分离患者外周血的单个核细胞。PBS洗去血小板，浆细胞样树突细胞的分离是利用流式细胞分选仪进行的(FACS Aria，BD Biosciences,Sunnyvale, CA)。经过抗 CD123-PE ;抗 CDlIc-APC 或抗 CDllc-PE ;以及 FITC-标记的 mAbs和抗⑶4-APC-Cy7混合物的筛选将⑶123high/⑶Ilc7lineage7⑶4+浆细胞样树突细胞分离出来，并按照BDCA2的标准分离纯度达到99%以上。台盼蓝染色，细胞活率须> 98%。
[0107]部分研究中在分离患者外周血的单个核细胞后，将悬浮单个核细胞利用流式细胞分选仪进行的抗CD14-PE的的筛选或用CD14磁珠将CD14+细胞分离出来。CD14+单个核细胞细胞悬液铺在培养皿中，加入扩增浆细胞样树突细胞培养液，其为含100ng/ml GM-CSF和200ng/ml IL-4。培养5天后，获得未成熟的树突细胞。
[0108]将细胞浓度为1父105个/200此，接种于96孔培养板，2001117孔，培养基中加入CpG2216用来刺激树突细胞的分泌并分为二组，分别加入梯度浓度的人重组半乳凝素-9或半乳凝素-1 (4ug/ml)然后置于37%，5% CO2培养箱内培养16小时。
[0109]IFN-a闵子的检测。培养16小时的上清转入独立1.5mL离心管中。以IFN kit检测上清液中的I型干扰素的含量，具体操作参照试剂盒说明书进行，用酶标仪(A450nm波长)测定各孔吸光度，与标准曲线对照，求出IFN值。结果如图3所示:[0110]人树突细胞(2万个细胞/每孔)在与CpG2216并分别在不同浓度的人重组Galectin-9蛋白或Galectin-1的条件下共培养16个小时，用ELISA方法测定IFN_a分泌情况。
[0111]应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意
组合。`
【权利要求】
1.半乳凝素-9或其活性衍生物、或其药物学可接受的盐用于制备用于治疗系统性自身免疫性疾病的药物的应用。
2.权利要求1的应用，其中所述系统性自身免疫疾病是系统性红斑狼疮疾病(SLE)或相类似机制的炎症性疾病。
3.权利要求1的应用，其中所述半乳凝素-9是长链、中链，或短链半乳凝素_9。
4.权利要求1的应用，其中所述半乳凝素-9包括N端糖识别结构域CRD和C端糖识别结构域CRD。
5.权利要求1的应用，其中所述半乳凝素-9是人半乳凝素-9，其氨基酸序列为SEQIDNo:1。
6.权利要求1的应用，其中所述半乳凝素-9活性衍生物是化学修饰的半乳凝素_9。
7.权利要求6的应用，其中所述半乳凝素-9活性衍生物是聚乙二醇修饰的半乳凝素_9。
8.权利要求1的应用，其中所述半乳凝素-9活性衍生物是含有半乳凝素-9序列的融合蛋白。
9.权利要求8的应用，其中所述半乳凝素-9活性衍生物是半乳凝素-9与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白。
10.权利要求9的应用，其中所述半乳凝素-9活性衍生物是半乳凝素-9与免疫球蛋白(IgG)的Fe片段的融合蛋白。
11.半乳凝素-9或其活性衍生物、或其药物学可接受的盐用于制备调节体内干扰素水平的药物的应用。
12.权利要求11的应用，其中所述干扰素为I型干扰素，所述调节是降低。
13.半乳凝素-9或其活性衍生物、或其药物学可接受的盐用于制备用于治疗由I型干扰素引起的炎症的药物的应用。
14.抑制浆细胞样树突细胞产生干扰素能力的方法，所述方法包括使半乳凝素-9或其活性衍生物接触浆细胞样树突细胞。
15.抑制炎症的方法，所述方法包括将有效量的半乳凝素-9或其活性衍生物、或其药物学可接受的盐，与药物学可接受的载体一起给药于有此需要的对象，其中所述的炎症得到有效抑制。
16.权利要求15的方法，其中所述炎症是由系统性红斑狼疮或相类似机制的炎症性疾病引起的。
17.权利要求15的方法，其中所述炎症是由I型干扰素引起的。
【文档编号】A61P37/02GK103623393SQ201310280152
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年7月4日 优先权日:2012年8月23日
【发明者】李立新 申请人:上海博笛生物科技有限公司