祖师麻与甘草中药组合物、其制备方法及其在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用的制作方法
【专利摘要】祖师麻与甘草中药组合物，特征是原料药的重量比组成是，祖师麻：甘草=?3：1-3：2.5。优化的重量比是，祖师麻：甘草=?3：1-3：2或3：1.8。最佳比例祖师麻：甘草=?3：1.5。进一步优化是采用原料药的浓缩水煎液：取祖师麻药材粗粉+甘草饮片，分别加水煎煮两次，第一次10倍量水煎煮2h；第二次5倍量水煎煮1h，合并水煎液，浓缩，即得。本发明有助抗炎，缓解AA症状，改善AA大鼠免疫功能和组织结构，两者配伍作用优于单用祖师麻，且祖师麻甘草3:2配伍组药效优于3:1配伍组。其降低血清炎症细胞因子TNF-α、IL-1β含量可能是该药治疗类风湿性关节炎机理之一。
【专利说明】祖师麻与甘草中药组合物、其制备方法及其在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种中药组合物，具体涉及一种祖师麻与甘草中药组合物、这种祖师麻甘草中药组合物的制备方法，以及这种祖师麻与甘草中药组合物在制备治疗关节炎药物中的应用。
【背景技术】
[0002]类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种以慢性侵蚀性关节炎为特征的全身性自身免疫病。类风湿关节炎的病变特点为关节滑膜的慢性炎症、细胞浸润、滑膜翳形成，以及由此造成的关节软骨和骨质破坏，最终导致关节畸形。如果不经过正规治疗，约75%的患者在3年内出现残废。类风湿关节炎分布于世界各地，在不同人群中的患病率为0.18%~1.07%，其发病具有一定的种族差异，印地安人高于白种人，白种人高于亚洲黄种人。在我国的总患病人数逾500万。类风湿关节炎在各年龄中皆可发病，高峰年龄在30~50岁左右,一般女性发病多于男性。
[0003]类风湿关节炎的发病原因尚不明确，一般认为与遗传、环境、感染等因素密切相关。类风湿关节炎患者I级亲属中患病的风险较普通人群高1.5倍。孪生子研究结果显示，与类风湿关节炎相关的各种因素中，遗传因素占50%~60%。与类风湿关节炎发病相关的易感基因包括HLA-DR、PAD14和PTPN22等。某些病毒和细菌感染可能作为始动因子，启动携带易感基因的个体发生免疫反应，进而导致类风湿关节炎的发病。与类风湿关节炎发病相关的病原体包括EB病毒、细小病毒B19、流感病毒及结核分枝杆菌等。
[0004]现有技术对类风湿关节炎的一般治疗，是强调患者教育及整体和规范治疗的理念。适当的休息、理疗、体疗、外用药、正确的关节活动和肌肉锻炼等对于缓解症状、改善关节功能具有重要作用。
[0005]其药物治疗一般采用非留类抗炎药(NSAIDs):这类药物主要通过抑制环氧合酶(COX)活性，减少前列腺素合成而具有抗炎、止痛、退热及减轻关节肿胀的作用，是临床最常用的类风湿关节炎治疗药物。非留类抗炎药对缓解患者的关节肿痛，改善全身症状有重要作用。其主要不良反应包括胃肠道症状、肝和肾功能损害以及可能增加的心血管不良事件。
[0006]改善病情抗风湿药(DMARDs):该类药物较非甾类抗炎药发挥作用慢，大约需I~6个月，故又称慢作用抗风湿药(SAARDs)这些药物可延缓或控制病情的进展。常用于治疗类风湿关节炎的改善病情抗风湿药包括如下几种:甲氨蝶呤(Methotrexate, MTX)、来氟米特(Leflunomide, LEF)、柳氮磺吡唳(Salicylazosulfapyriding, SASP)、轻氯喹(hydroxychloroquine, HCQ)。
[0007]生物制剂:是目前积极有效控制炎症的主要药物，减少骨破坏，减少激素的用量和骨质疏松。治疗类风湿关节炎的生物制剂主要包括肿瘤坏死因子(TNF)-Ci拮抗剂、白细胞介素(IL)-1和IL-6拮抗剂、抗CD20单抗以及T细胞共刺激信号抑制剂等。
[0008]糖皮质激素:糖皮质激素能迅速改善关节肿痛和全身症状。在重症类风湿关节炎伴有心、肺或神经系统等受累的患者，可给予短效激素，其剂量依病情严重程度而定。针对关节病变，如需使用，通常为小剂量激素(泼尼松<7.5mg/d)仅适用于少数类风湿关节炎患者。
[0009]植物药制剂
[0010]雷公藤:对缓解关节肿痛有效，是否减缓关节破坏尚乏研究。一般给予雷公藤多苷30~60mg/d，分3次饭后服用。主要不良反应是性腺抑制，一般不用于生育期患者。其他不良反应包括皮疹、色素沉着、指甲变软、脱发、头痛、纳差、恶心、呕吐、腹痛、腹泻、骨髓抑制、肝酶升高和血肌酐升高等。
[0011]白芍总苷:常用剂量为600mg，每日2~3次。其不良反应较少，主要有腹痛、腹泻、纳差等。
[0012]祖师麻:为瑞香科植物黄瑞香Daphne giraldii Nitsche.、陕甘瑞香D.tanguticaMaxim.或凹叶瑞香D.retusa Hemsl.的干燥莖皮和根皮,具有祛风湿,活血止痛的功效,用于风湿痹痛，关节炎，类风湿性关节痛[1]。
[0013]甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草 G.1n flataBat.或光果甘草G.glabra L.的干燥根和根茎，其性平味甘，有缓急止痛、调和诸药及解毒等作用[2]。“甘草解百药毒”，能够制约药物毒性和峻烈之性，有“十方九草”之说[3]。
[0014]但是现有技术中，尚未发现在治疗风湿痹痛，关节炎，类风湿性关节痛的药物中使用袓师麻与甘草配伍的记载。
[0015]参考文献
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【发明内容】
[0027]本发明的目的是提供一种祖师麻与甘草的中药组合物、这种祖师麻与甘草中药组合物的制备方法，以及这种祖师麻与甘草中药组合物在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。本发明首次将祖师麻、甘草进行组合配伍，研究其治疗类风湿性关节炎的治疗效应、作用机制，为临床提供依据，并提供一种可供选择的治疗类风湿性关节炎的临床药物。
[0028]完成上述发明任务的技术方案是，一种祖师麻与甘草中药组合物，其特征在于，该组合物原料药的重量比组成是，祖师麻:甘草=3:1-3:2.5。
[0029]优化方案中，该组合物原料药的重量比组成是:祖师麻:甘草=3:1_3:2，再优化为:祖师麻:甘草=3:1.5-3:1.8。最佳比例为，祖师麻:甘草=3:1.5。
[0030]进一步改进的优化方案中，该组合物采用原料药的浓缩水煎液。
[0031]所述的浓缩水煎液，是指采用以下方法制备的浓缩水煎液:取祖师麻药材粗粉与甘草饮片，分别加水煎煮两次，第一次是10倍量水，水煎煮2小时；第二次是5倍量水，水煎煮I小时，合并水煎液，浓缩，即得。
[0032]本发明中的祖师麻为瑞香科植物黄瑞香Daphne giraldii Nitsche.、陕甘瑞香D.tangutica Maxim.或凹叶瑞香D.retusa Hemsl.的干燥莖皮和根皮。甘草为豆科植物甘草 Glycyrrhiza uralen sis Fisch.、胀果甘草 G.1n f lata Bat.或光果甘草 G.glabraL.的干燥根和根莖。
[0033]临床应用研究表明，甘草配伍祖师麻具有良好的增效减毒作用。本项目前期研究发现，祖师麻因配伍甘草而活性增强，主要活性成分瑞香素、7-羟基香豆素等生物利用度显著提高M，提出甘草配伍祖师麻协同增效机制在于祖师麻与甘草主要活性成分作用于类风湿性关节炎相关作用靶点。本发明首次将祖师麻、甘草进行组合配伍，研究其治疗类风湿性关节炎的治疗效应、作用机制，为临床提供依据，以期开发成抗类风湿性关节炎的新药。
[0034]完成本申请第二个发明任务的技术方案是，上述祖师麻与甘草中药组合物的制备方法，原料药的重量比组成是:祖师麻:甘草=3:1-3:2.5，其特征在于，步骤如下:
[0035]⑴.按比例取祖师麻+甘草作为原料；
[0036]⑵.两种原料药分别加10倍量水，煎煮2小时；
[0037]⑶.两种原料药分别加5倍量水，煎煮I小时；
[0038](4).合并两次的水煎液；
[0039](5).浓缩合并的水煎液，即得。
[0040]完成本申请第三个发明任务的技术方案是，上述祖师麻甘草中药组合物在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。
[0041]上述药物的给药方式是:大鼠灌胃给药；[0042]给药剂量是:相当于临床拟用剂量的1、2、4倍；
[0043]疗程是:于造模前两天开始给药，每天给药一次，连续给药31天。
[0044]以下为本发明技术效果的证明。
[0045]本实验采用AA大鼠模型，通过观察甘草配伍祖师麻后对大鼠关节炎的治疗效果、相关炎症介质的影响以及病理学的改变，对二者配伍比例进行筛选，并探讨其可能的作用机制。
[0046]不同比例甘草配伍祖师麻抗大鼠佐剂性关节炎的实验研究
[0047]目的:观察不同比例甘草配伍祖师麻后对大鼠佐剂性关节炎(AA)模型的治疗效应，筛选两者配伍比例，研究配伍作用机制，探讨两者配伍意义。
[0048]方法:大鼠随机分为15组，每组各10只，即对照组、模型组、12个给药组及阳性对照组，其中给药组分别设:祖师麻+甘草3:1配伍低、中、高剂量组，祖师麻+甘草3:2配伍低、中、高剂量组，祖师麻低、中、高剂量组，甘草低、中、高剂量组，以及阳性对照组给予雷公藤多苷片。弗氏完全佐剂诱导大鼠佐剂性关节炎，每天给药一次，连续给药31d，观察各组大鼠一般情况、足趾肿胀度、关节炎指数的变化；检测大鼠血清炎症细胞因子如肿瘤坏死因子-α (TNF-α )、白细胞介素-1 β (IL_1 β )的含量变化；观察大鼠膝关节组织病理改变。
[0049]结果:与对照组比较，AA模型组大鼠体重减轻，关节肿胀、变形等均较明显，Al升高，血清TNF-a、IL_1 β含量增加(P < 0.01)，关节组织发生明显病理改变；祖师麻甘草配伍组及祖师麻组能够明显抑制AA大鼠体重减轻的趋势，对抗AA大鼠足肿胀度及Al的增大，降低血清TNF-a、IL-1 β水平(P < 0.05、0.01 )，病理组织变化得到显著改善，且祖师麻甘草配伍组药效优于祖师麻组，祖师麻甘草3:2配伍组优于3:1配伍组。
[0050]结论:祖师麻与甘草 配伍后能有助抗炎，缓解AA症状，作用优于单用祖师麻，祖师麻与甘草3:2是其最佳配伍比例。降低血清炎症细胞因子TNF-a、IL-1 β含量可能是祖师麻甘草配伍治疗类风湿性关节炎机理之一。
[0051]I实验材料与仪器
[0052]1.1药品与试剂
[0053]祖师麻，为瑞香科瑞香属植物黄瑞香的根皮及莖皮Daphne giraldii Nitsche.,购置陕西省医药公司，批号20120812
[0054]甘草，为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草 G.1n flataBat.或光果甘草G.glabra L.的干燥根及根茎。购置安徽省万生中药饮片有限公司，批号20120901
[0055]雷公藤多苷片，浙江得恩德制药有限公司，国药准字Z33020422
[0056]卡介苗冻干粉，北京生物制品研究所，批号20110928
[0057]大鼠TNF-a ELISA 试剂盒，美国 eBioscience 公司，批号 Ε09491-1636
[0058]大鼠IL-1 PELISA 试剂盒，美国 eBioscience 公司，批号 E09307-1638
[0059]1.2实验动物
[0060]SD雄性大鼠，清洁级，150只，体质量200~220g，由上海斯莱克实验动物责任有限公司提供，生产许可证:SCXK (沪)2012-0002。
[0061]1.3实验仪器
[0062]电子天平，上海精密科学仪器有限公司，型号PA1204B[0063]电热恒温水浴锅，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司，型号HH-6
[0064]足趾容积测量仪，济南益延科技发展有限公司，型号YSL-7B
[0065]台式高速离心机，长沙湘智离心机仪器有限公司，型号TG16-WS
[0066]多功能酶标仪，美国BioTek公司，型号PMT49984
[0067]二氧化碳培养箱，美国 Thermo Scientific 公司，型号 HERAcell 150?
[0068]自动脱水机:德国LEICA公司，型号TP 1020
[0069]石蜡切片机:德国LEICA公司，型号RM2235
[0070]摊片烤片机:湖北孝感宏业医用仪器有限公司，型号CS-VI
[0071]组织包埋中心:日本SAKURA公司，型号Tissue-Tek TEL
[0072]光学显微镜:德国LEICA公司，型号LEICA DM-1000
[0073]隔水式电热恒温培养箱:上海市跃进医疗器械一厂
[0074]微波炉:TCL有限公司
[0075]2实验方法
[0076]2.1给药样品溶液的制备
[0077]祖师麻、甘草水煎液:取祖师麻+甘草(3:1 ;3:2)、祖师麻粗粉以及甘草饮片，分别加水煎煮两次(10倍量水，2小时；5倍量水，I小时)，合并水煎液，浓缩，即得；雷公藤多苷片样品液:用蒸馏水配制成0.9375g/L的溶液。于4°C冰箱保存备用。
[0078]2.2佐剂性关节炎模型的建立
[0079]2.2.1弗氏完全佐剂(FCA)的制备
[0080]取卡介苗冻干粉，80°C灭活30min后，与液体石蜡、羊毛脂以3:2比例于研钵内研磨混匀，制备成10mg/ml的混悬液。高压灭菌。
[0081]2.2.2佐剂性关节炎的诱发
[0082]取体重为220±10g的健康雄性大鼠140只，按照文献法[6]，于左后足跖皮内注射弗氏完全佐剂0.1ml致炎。另取大鼠10只，于相同部位，采用相同手法注射0.1ml生理盐水，作为空白对照组。
[0083]2.3分组及给药
[0084]大鼠随机分为15组，每组各10只，即对照组、模型组、12个给药组及阳性对照组，其中给药组分别设:祖师麻+甘草3:1配伍低、中、高剂量[生药(405g+135g)/kg、(810+270 )/kg、(1620+540 )/kg]组，祖师麻+甘草3:2配伍低、中、高剂量[生药(405+270 )/kg、(810+540) /kg、(1620+1080) /kg]组，祖师麻低、中、高剂量(生药 405、810、1620g/kg)组，甘草低、中、高剂量(生药270、540、1080g/kg)组，分别相当于临床拟用剂量的1、2、4倍，以及阳性对照组给予雷公藤多苷片7.5g/kg。以上各组灌胃给予相应剂量药物，给药体积均为8.0mL/kg,于造模前两天开始给药，每天给药一次，连续给药31天。模型组与对照组给予给体积的蒸馏水。
[0085]2.4大鼠一般情况观察
[0086]造模及治疗前后观察大鼠体重、体毛色泽的改变，神志及活动状态，饮食变化及关节红肿情况。在给药前及给药后3、10、17、24、29天，分别测量各鼠体重。
[0087]2.5 AA大鼠足肿胀度的测量
[0088]在大鼠踝关节处作标记，用大鼠足趾体积测量仪分别测造模前大鼠左右足趾体积，造模后第1、2、3天左后足趾体积，造模后第8、10、12、16、20、24天右后足趾体积，测3次，取平均值，并计算出其关节肿胀度。肿胀度=Vt/V0。注:Vtl为造模前足趾体积，Vt为造模后体积。
[0089]2.6 关节炎指数(Arthritis index, Al)的计算
[0090]致炎后第7天开始观察并记录全身关节病变程度，每7天记录I次。全身病变按5级评分法评价，根据未注射佐剂的其余3只肢体的病变程度累计积分，计算出Al。O分:无红肿；1分:足小趾关节红肿；2分:趾关节和足跖均肿胀；3分:踝关节以下的足爪均肿胀；4分:包括踝关节在内的全部足爪红肿。把各个关节的积分累计起来，即为每只大鼠的AIm0
[0091]2.7血清炎症细胞因子的检测
[0092]连续给药31天后,大鼠麻醉颈总动脉取血,离心IOmin,转速为3000r/min,采集血清并分装，ELISA法检测血清TNF- a、IL-1 β含量。
[0093]2.8病理组织学检查方法
[0094]连续给药31天后，颈动脉取血，并处死大鼠，取其膝关节用10%福尔马林固定，经过脱钙、脱水、常规石蜡包埋，切片(厚度约4~5 μ m)和常规HE染色后，检查阅片，具体观察指标包括:炎细胞浸润、滑膜病变、骨质破坏、关节肿胀等病理变化。
[0095]2.9统计学方法
[0096]数据以均数土标准差(f士S)表示，应用SPSS 16.0统计软件对多样本均数间比较采用One-way ANOVA分析，组间比较采用方差分析和两样本均数比较的t检验。以P < 0.05作为具有统计学意义的判定标准。
[0097]3实验结果
[0098]3.1不同比例甘草配伍祖师麻对AA大鼠一般情况的影响
[0099]与对照组相比，AA大鼠造模IOd后，表现出精神倦怠、活动减少、食欲下降、被毛失去光泽且体质量减轻(P < 0.01)，表明类风湿性关节炎模型大鼠复制成功，其余各组大鼠的活力、毛色、状态均优于模型组。祖师麻甘草3:1、3:2配伍组，及祖师麻组，在造模17d后，均可剂量依赖性地缓解RA大鼠体质量的减轻，与模型组比较差异有统计学意义(P < 0.05、P < 0.01)。雷公藤多苷片7.5mg/kg也能抑制AA大鼠体质量的下降(P < 0.05,P < 0.01)。结果见表1与图1。
[0100]表1不同比例甘草配伍祖师麻对AA大鼠体质量的影响(f±S, n=10)
[0101]Tablel Effects of different rate of CD and GU on body weight of AA
rats(j土s.n=l0)
【权利要求】
1.一种甘草祖师麻中药组合物，其特征在于，该组合物原料药的重量比组成是，祖师麻:甘草=3:1-3:2.5。
2.根据权利要求1所述的甘草祖师麻中药组合物，其特征在于，该组合物原料药的重量比组成是，祖师麻:甘草=3:1 - 3:2。
3.根据权利要求2所述的甘草祖师麻中药组合物，其特征在于，该组合物原料药的重量比组成是，祖师麻:甘草=3:1.5 - 3:1.8。
4.根据权利要求1-3之一所述的甘草祖师麻中药组合物，其特征在于，该组合物采用原料药的浓缩水煎液。
5.根据权利要求4所述的甘草祖师麻中药组合物，其特征在于，所述的浓缩水煎液，是指采用以下方法制备的浓缩水煎液:取祖师麻饮片+甘草饮片，分别加水煎煮两次，第一次是10倍量水，水煎煮2h ;第二次是5倍量水，水煎煮lh，合并水煎液，浓缩，即得。
6.根据权利要求4所述的甘草祖师麻中药组合物，其特征在于，所述的祖师麻为瑞香科植物黄瑞香giraldii Nitsche.、陕甘瑞香tangutica Maxim.1Daphneretusa Hemsl.的干燥莖皮和根皮；所述的甘草为豆科植物甘草uralensisFisch.、胀果甘草in flat a Bat.或光果甘草glabra L.的干燥根和根茎。
7.权利要求1所述的甘草祖师麻中药组合物的制备方法，原料药的重量比组成是:祖师麻:甘草=3:1-3:2，其特征在于，步骤如下: (1).按比例取祖师麻+甘草作为原料； (2).两种原料药分别加10倍量水，煎煮2h； (3).两种原料药分别加5倍量水，煎煮Ih； (4).合并两次的水煎液； (5).浓缩合并的水煎液，即得。
8.权利要求1所述的甘草祖师麻中药组合物甘草祖师麻中药组合物在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的甘草祖师麻中药组合物甘草祖师麻中药组合物在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用，其特征在于， 药物的给药方式是:灌胃给药； 给药剂量是:相当于临床拟用剂量的1、2、4倍； 疗程是:于造模前两天开始给药，每天给药一次，连续给药31d。
【文档编号】A61K36/484GK103463310SQ201310363121
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年8月20日 优先权日:2013年8月20日
【发明者】狄留庆, 张雯, 陈良慧, 单进军, 陈乐天, 许惠琴 申请人:南京中医药大学