一种采用低渗透压收获液收获病毒的方法
【专利摘要】本发明提供了一种采用低渗透压收获液收获病毒的方法。本发明的收获液渗透压为0～150mOsmol/kg，其配方为磷酸二氢钾和磷酸氢二钠或在此基础上添加氯化钠和/或蔗糖；或者选用稀释后的细胞培养基或细胞缓冲液PBS作为低渗收获液。本发明的低渗收获液裂解细胞能在10-60分钟内使细胞发生明显膨胀，震摇后细胞裂解比例为100%，且收获的病毒液滴度与现有技术相仿，无降低。本发明方法能够高效裂解细胞，使胞内病毒释放并得到有效收集，打破了在大规模平面培养病毒工艺中由于收获工艺的限制带来的壁垒。通过改变细胞渗透压的方式收获病毒的工艺方法操作简单，便于规模化生产，可有效提高产业化能力。
【专利说明】一种采用低渗透压收获液收获病毒的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体地，涉及一种采用低渗透压收获液裂解细胞使病毒释放并使其得到有效收获的工艺方法。
【背景技术】
[0002]水痘-带状疱疫病毒(Varicella-Zoster virus, VZV)属a疱疫病毒亚科,为双链DNA病毒，其原发感染为水痘，潜伏感染再激活时可引发带状疱疹。接种疫苗是预防由VZV引起的水痘与带状疱疹的最有效措施。迄今为止，水痘减毒活疫苗(Oka株)是唯一获准用于预防由VZV引起的疾病的疫苗。接种疫苗是公认的预防由VZV引起的水痘的最有效措施。
[0003]轮状病毒(Rotavirus，RV)是引起婴幼儿严重腹泻和脱水的主要病因，在发展中国家和发达国家都是一个重要的公共卫生问题，全世界〈5岁的儿童每年大约有600，000左右的死亡病例，85%的死亡儿童在发展中国家。轮状病毒腹泻不但造成社会的疾病负担，而且带来了巨大的经济损失。疫苗免疫是唯一可行的预防轮状病毒腹泻较高发病率和死亡率的方法。有鉴于此，世界卫生组织在1997年将轮状病毒疫苗的开发列为全球新疫苗研制开发的第一项目，世界各国的有关机构都在积极进行轮状病毒疫苗的研制工作。
[0004]EV71病毒和CA16病毒均为引起婴幼儿手足口病的主要病原体。人肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科，基因组为单股正链RNA，长度约为7400个核苷酸，仅含有一个开放读码框，编码的多聚蛋白约含2190个氨基酸。该病毒最早于1969~1970年间在美国加利福尼亚州发生中枢 神经系统症状的婴儿粪便中分离得到。电镜观察发现该病毒的形态及理化特性都与当时已知的其他肠道病毒类似，但中和抗体试验和免疫扩散试验却未发现交互作用，因此认为是一种新型肠道病毒，命名为人肠道病毒71型。
[0005]柯萨奇病毒A组16型(简称:CA16)于1958年被分离出，CA16是单正链RNA病毒，病毒颗粒呈球形，为二十面体立体对称，无包膜。基因组长约7 400bp,包括5'及3'端的非编码区和中间一个大的开放读码框(ORF)，依次由VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D 11个基因组成，主要编码产生病毒结构蛋白。在历次手足口病的流行中，EV71与CA16交替或共同出现，成为HFMD的主要病原体。
[0006]甲型病毒性肝炎简称甲型肝炎，是由甲型肝炎病毒(甲肝病毒)引起的一种急性传染病，粪-口传播是其主要传播途径。甲型肝炎病毒属于微小核糖核酸病毒科，肝病毒属。病毒颗粒呈球形，直径约为27nm，无囊膜，衣壳由32个壳粒组成，呈20面体立体对称，每个壳粒具有四个多肽分别为病毒蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，基因组为单股正链RNA，其长度相当于7500个核苷酸左右。在RNA的3'末端有多聚的腺苷序列，在5'末端以共价形式与病毒基因组蛋白。根据病毒核苷酸序列分析，人甲肝病毒可以分为四个基因型，但其抗原性相似，所以甲型肝炎病毒只有一个血清型。
[0007]病毒疫苗的制备一般是先将毒种接种于未感染的适宜代次的细胞上进行传代，当达到一定程度细胞病变时收获感染细胞，加适量疫苗液制成原液。原液经冻融，超声破碎，离心，过滤澄清，得到上清液，加入疫苗稳定剂即半成品；半成品冻干或直接分装后即成为冻干疫苗或液体剂型疫苗。
[0008]自1974年Oka株水痘减毒活疫苗问世以来，欧美等国家陆续开始了水痘疫苗的生产，其生产工艺均采用克氏瓶静止培养，生产规模和病毒产量受到一定的限制。轮状病毒的大规模培养主要采用转瓶或细胞工厂，EV71、CA16病毒和甲肝病毒的大规模培养主要采用细胞工厂，上述病毒均属于胞内病毒，在病毒的收获工艺中需要有效的破碎裂解细胞使病毒释放，并保证病毒颗粒的完整性。而不同的收获工艺对细胞的裂解程度和病毒颗粒的完整性的影响不同。收获方式直接影响病毒滴度值，而病毒收获液的有效高滴度值是影响疫苗品质的重要因素。因此，选择一种合适、有效的病毒收获方式至关重要。[0009]水痘病毒、轮状病毒、EV71病毒、CA16病毒和甲肝病毒均属于细胞内病毒，具有很强的细胞结合活性，病毒收获时必须收集并破碎细胞才能得到游离的病毒颗粒。目前针对上述病毒的上市产品中，各厂家多采用冻融法收集和破碎细胞，该方法适合于转瓶和克式瓶等培养方式，但不适用于细胞工厂培养系统；也有厂家采用含EDTA或胰蛋白酶的消化液经消化收集细胞，并采用冻融法破碎细胞，该方法适用于细胞工厂培养系统，但存在引入消化液成份并难以去除的弊端，对疫苗的安全性存在风险。
[0010]现有的技术中，EV71病毒、CA16病毒和甲肝病毒采用10层或40层细胞工厂的大规模培养中，采用冻融方式收获病毒的可行性差，需要大量的超低温保存设备，消耗能源并延长生产周期；另一种方式则为收集病毒培养上清液，由于病毒为胞内病毒，上清液中病毒滴度值较冻融破碎细胞后收集的病毒液滴度值低，难以制成合格的成品。低渗收获工艺可通过改变细胞内外的渗透压使细胞膨胀并破裂，成功收获细胞内的病毒，避免因冻融引起的操作时间的延长及病毒滴度的下降。
【发明内容】
[0011]本发明的目的在于提供一种采用低渗透压收获液收获病毒的方法。
[0012]渗透压法是通过渗透压的改变达到破碎细胞、收获病毒的目的。正常的渗透压为285~310m0smol/kg，当细胞置于低渗透压溶液中时，由于渗透压的作用，水分渗入细胞发生膨胀，引起细胞破裂，通过震摇可使细胞脱落，从而实现收获病毒。
[0013]本发明首先提供了一种用于破碎裂解细胞收获病毒的低渗透压收获液，该低渗收获液的渗透压为0~150m0smol/kg。
[0014]本发明提供的低渗透压收获液含有磷酸二氢盐和磷酸氢二盐或在此基础上添加氯化钠和/或蔗糖。即该低渗收获液可以仅含磷酸二氢盐和磷酸氢二盐，也可在这个基础上添加氯化钠，也可以在两种磷酸盐的基础上添加蔗糖，还可以在两种磷酸盐的基础上同时添加氯化钠和蔗糖。
[0015]具体地，本发明的低渗透压收获液含有如下组分:0.0026%-0.052%的磷酸二氢盐、0.029%-0.58%的磷酸氢二盐、0-0.34%的氯化钠和0_1%的蔗糖。所述％均为质量体积比，单位为g/ml。
[0016]优选地，上述低渗透压收获液含有如下组分:0.0052%-0.026%的磷酸二氢盐，0.058%-0.290%的磷酸氢二盐，0-0.170%的氯化钠和0-1%的蔗糖。所述％均为质量体积比，单位为g/ml。[0017]更优选地，上述低渗透压收获液含有如下组分:0.026%的磷酸二氢盐，0.290%的磷酸氢二盐，0%的氯化钠和0%的蔗糖。所述％均为质量体积比，单位为g/ml。
[0018]本发明所述的磷酸二氢盐、磷酸氢二盐为钾盐或钠盐。
[0019]上述低渗透压收获液的配制为采用注射用水为溶剂，将磷酸二氢盐和磷酸氢二盐和/或氯化钠和/或蔗糖按照上述的质量体积比分别加入至注射水中，至完全溶解，PH值为7.0-7.5，过滤除菌，备用。
[0020]另一方面，本发明所述的低渗透压收获液还可以为稀释后的细胞培养基或细胞缓冲液PBS。将细胞培养基或细胞缓冲液进行稀释一定倍数，使其渗透压处于0~150m0Smol/kg的范围内，常用的培养基为MEM、199、无酚红199。
[0021 ] 本发明提供了上述低渗透压收获液在制备疫苗中的应用。
[0022]进一步地，本发明提供了一种采用低渗透压收获液收获病毒的方法，包括如下步骤:
[0023]( I)在病毒培养环境中，当细胞出现病变并CPE程度大于50%时，弃去细胞培养液，加入上述低渗透压收获液，室温静置；
[0024](2)显微镜下观察细胞状态，待细胞发生明显膨胀时震摇使细胞脱落，收集病毒液。
[0025]本发明所述的低渗透压收获液收获病毒的方法适用于胞内病毒，包括水痘-带状疱疫病毒、轮状病毒、EV71病毒、CA16病毒或甲肝病毒。
[0026]本发明方法中，采`用细胞瓶或细胞工厂培养病毒。病毒培养采用的细胞为疫苗行业常用的如Vero细胞、二倍体细胞等。采用细胞瓶或细胞工厂等平面培养的模式培养细胞。
[0027]步骤(1)中加入低渗收获液后,室温静置5~30min。
[0028]并显微镜下观察细胞状态，待细胞发生明显膨胀时震摇细胞瓶或细胞工厂，收集病毒液。
[0029]本发明提供了低渗透压收获液在制备用于预防或治疗水痘病毒、轮状病毒、EV71病毒、CA16病毒或甲肝病毒所致疾病的疫苗或药物中的应用。
[0030]本发明提供的低渗透压收获液配方主要由小分子盐类组成，可有效保证产品的安全性和有效性。该低渗收获液裂解细胞能在10-60分钟内使细胞发生明显膨胀，震摇后细胞裂解比例为100%，且收获的病毒液滴度与现有技术相仿，无降低。本发明方法能够高效裂解细胞，使胞内病毒释放并得到有效收集，打破了在大规模平面培养病毒工艺中由于收获工艺的限制带来的壁垒。采用传统的冻融方式收获病毒由于时间过长影响病毒稳定性导致滴度下降；通过直接收集培养上清液的方式收获的病毒由于胞内病毒在培养过程中不能完全的释放而导致病毒滴度值较低，由于传统的疫苗生产中的转瓶工艺批间差大、污染的风险较大并且耗费能源已经制约了一些疫苗企业的产能及效益；采用本发明所述的低渗透压法收获病毒对病毒的滴度无任何影响，其滴度值明显高于冻融对照组和上清对照组，在大规模的生产过程中能够提高病毒产量，且工艺简单，便于操作，具有明显的优势，使得使用细胞工厂工艺收获细胞内病毒成为可能。
【具体实施方式】[0031]以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0032]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；实施例中所用的试剂为市售商品。本发明所述的MEM、199、无酚红199培养基为常用市售产品，并按照说明书进行的配制。
[0033]实施例1低渗透压收获液的配制
[0034]于无菌环境中配制低渗透压收获液，步骤如下:
[0035]( I)向注射水中分别加入磷酸二氢钾和磷酸氢二钠和/或氯化钠和/或蔗糖，充分溶解；
[0036]或者，将细胞培养基或细胞缓冲液PBS采用无菌注射水稀释；加量或稀释倍数见表1、表2所不。
[0037](2)将步骤(1)已充分溶解的溶液采用注射水定容至目标体积；
[0038](3 )维持 pH 值为 1.0-7.5 ；
[0039](4)过滤除菌,室温保存,备用。
[0040](5)采用全自动冰点渗透压计法测定各溶液渗透压。
[0041]表1低渗收获液成分表(I)
【权利要求】
1.一种用于破碎细胞收获病毒的低渗透压收获液，其特征在于，该低渗收获液的渗透压为 O ~150m0smol/kg。
2.根据权利要求1所述的低渗透压收获液，其特征在于，含有磷酸二氢盐和磷酸氢二盐或在此基础上添加的氯化钠和/或蔗糖。
3.根据权利要求2所述的低渗透压收获液，其特征在于，含有如下组分:0.0026%-0.052%的磷酸二氢盐、0.029%-0.58%的磷酸氢二盐、0-0.34%的氯化钠和0_1%的蔗糖，前述％均为质量体积比，单位为g/ml。
4.根据权利要求2所述的低渗透压收获液，其特征在于，含有如下组分:0.0052%-0.026%的磷酸二氢盐，0.058%-0.290%的磷酸氢二盐，0-0.170%的氯化钠和0-1%的蔗糖；前述％均为质量体积比，单位为g/ml。
5.根据权利要求2所述的低渗透压收获液，其特征在于，含有如下组分:0.026%的磷酸二氢盐，0.290%的磷酸氢二盐，0%的氯化钠和0%的蔗糖，前述％均为质量体积比，单位为g/ml o
6.根据权利要求1所述的低渗透压收获液，其特征在于，为稀释后的细胞培养基或细胞缓冲液PBS。
7.根据权利要求6所述的低渗透压收获液，其特征在于，所述细胞培养基为MEM培养基、199培养基或无酚红培养基。
8.一种采用低渗透压收获液收获病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)在病毒培养环境中，当细胞出现病变CPE程度大于50%时，弃去细胞培养液，加入权利要求1-7任一所述的低渗透 压收获液，室温静置5-30min ； (2)显微镜下观察细胞状态，待细胞发生明显膨胀时震摇使细胞脱落，收集病毒液。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的病毒为胞内病毒。
10.权利要求1-7任一所述的低渗透压收获液在制备用于预防或治疗水痘病毒、轮状病毒、EV71病毒、CA16病毒或甲肝病毒所致疾病的疫苗或药物中的应用。
【文档编号】A61K39/125GK103602639SQ201310363119
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年8月16日 优先权日:2013年8月16日
【发明者】黄金凤, 张嵬, 于巍, 孟凡红, 何玉君, 谷业新, 高强, 尹卫东 申请人:科兴（大连）疫苗技术有限公司