本发明涉及针对CAPRIN-1蛋白质的抗体或其片段作为胆囊癌的治疗和/或预防剂等的药物用途。
背景技术：
近年来，以癌细胞上的抗原蛋白质为靶的、用于治疗癌的各种抗体药物在世界上兴起。作为癌特异性治疗药获得了一定的药效而受到关注，但成为靶的抗原蛋白质大部分在正常细胞中也表达，作为抗体施与的结果，不仅是癌细胞，连表达抗原的正常细胞也被毒害，其结果所产生的副作用成为问题。因此，如果能够鉴定在癌细胞表面特异性地表达的癌抗原、并使用以该癌抗原为靶的抗体作为药物，则可以期待实现副作用更少的利用抗体药物的治疗。
其中，在癌中，胆囊癌是缺乏自觉症状·初期症状、早期发现非常困难的癌，另外，进行了淋巴转移和/或肝脏转移、肺转移、骨转移、腹膜播种等的胆囊癌治疗非常困难，不适应手术的胆囊癌患者的5年生存率几乎为0％，本领域技术人员的技术常识已知胆囊癌治疗非常困难，且尚未开发出有效的胆囊癌的治疗药。
细胞质增殖相关蛋白1(Cytoplasmic-and proliferation-associateed protein 1，CAPRIN-1)作为已知在分裂间期的正常细胞发生活化和/或细胞分裂时表达，并在细胞内与RNA形成细胞内应激颗粒而参与mRNA的转运、翻译的控制等的细胞内蛋白质被知晓，但被发现在乳癌细胞等的癌细胞的表面特异性地表达，因而作为用于癌治疗的抗体药物的靶正在被进行研究(专利文献1)。然而，在专利文献1中并未确认CAPRIN-1蛋白质在胆囊癌细胞上表达，关于CAPRIN-1蛋白质可以成为胆囊癌的抗原蛋白质既没有记载也没有启示。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2010/016526
技术实现要素：
发明要解决的课题
本发明的目的是鉴定在胆囊癌细胞的表面表达的癌抗原蛋白质，提供以其作为靶的抗体作为胆囊癌的治疗和/或预防剂的用途。
用于解决课题的方法
本发明者进行了深入研究，结果发现，CAPRIN-1蛋白质的一部分在胆囊癌细胞的细胞表面表达，进而发现针对CAPRIN-1蛋白质的抗体毒害表达CAPRIN-1蛋白质的胆囊癌细胞，从而完成了本发明。
因此，本发明具有以下特征。
本发明提供用于胆囊癌的治疗和/或预防的药物组合物，其特征在于，包含抗体或其片段作为有效成分，所述抗体或其片段与CAPRIN-1蛋白质、或包含该蛋白质的氨基酸序列中的连续7个以上氨基酸残基的该蛋白质的片段具有免疫反应性，所述CAPRIN-1蛋白质具有序列号2～30中的偶数序列号所示的任一氨基酸序列、或与该氨基酸序列有80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上的序列同一性的氨基酸序列。
在其他的实施方式中，上述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
在其他的实施方式中，上述抗体是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体或多特异性抗体。
在其他的实施方式中，上述抗体是与肽或其片段具有免疫反应性的抗体，所述肽具有序列号271、序列号273或序列号266或序列号270或序列号272或序列号269所示的氨基酸序列、或与该氨基酸序列具有80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上的序列同一性的氨基酸序列。
在其他的实施方式中，上述抗体是以下(a)～(ao)的任一抗体，并且是与所述CAPRIN-1蛋白质等具有免疫反应性的抗体；或者是用于胆囊癌的治疗和/或预防的药物组合物，其特征在于，包含该抗体作为有效成分。
(a)含有包含由序列号37、38和39所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号41、42和43所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(b)含有包含由序列号47、48和49所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号51、52和53所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(c)含有包含由序列号57、58和59所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号61、62和63所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(d)含有包含由序列号67、68和69所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号71、72和73所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(e)含有包含由序列号77、78和79所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号81、82和83所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(f)含有包含由序列号87、88和89所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号91、92和93所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(g)含有包含由序列号97、98和99所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号101、102和103所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(h)含有包含由序列号107、108和109所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号111、112和113所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(i)含有包含由序列号117、118和119所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号121、122和123所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(j)含有包含由序列号127、128和129所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号121、122和123所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(k)含有包含由序列号132、133和134所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号136、137和138所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(l)含有包含由序列号142、143和144所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号146、147和148所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(m)含有包含由序列号142、143和144所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号152、153和154所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(n)含有包含由序列号157、158和159所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号161、162和163所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(o)含有包含由序列号167、168和169所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号171、172和173所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(p)含有包含由序列号167、168和169所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号177、178和179所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(q)含有包含由序列号167、168和169所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号182、183和184所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(r)含有包含由序列号167、168和169所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号187、188和189所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(s)含有包含由序列号167、168和169所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号192、193和194所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(t)含有包含由序列号197、198和199所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号201、202和203所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(u)含有包含由序列号207、208和209所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号211、212和213所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(v)含有包含由序列号217、218和219所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号221、222和223所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(w)含有包含由序列号227、228和229所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号231、232和233所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(x)含有包含由序列号237、238和239所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号241、242和243所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(y)含有包含由序列号247、248和249所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号251、252和253所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(z)含有包含由序列号276、277和278所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号280、281和282所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(aa)含有包含由序列号276、277和278所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号286、287和288所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(ab)含有包含由序列号291、292和293所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号295、296和297所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(ac)含有包含由序列号301、302和303所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号305、306和307所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(ad)含有包含由序列号311、312和313所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号315、316和317所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(ae)含有包含由序列号321、322和323所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号325、326和327所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(af)含有包含由序列号331、332和333所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号335、336和337所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(ag)含有包含由序列号341、342和343所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号345、346和347所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(ah)含有包含由序列号351、352和353所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号354、355和356所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(ai)含有包含由序列号351、352和357所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号354、355和356所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(aj)含有包含序列号373、374和375所示的氨基酸序列的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含序列号377、378和379所示的氨基酸序列的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(ak)含有包含序列号383、384和385所示的氨基酸序列的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含序列号387、388和389所示的氨基酸序列的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(al)含有包含序列号393、394和395所示的氨基酸序列的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含序列号387、388和389所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(am)含有包含由序列号398、399和400所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号402、403和404所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(an)含有包含序列号408、409和410的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含序列号412、413和414的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
(ao)含有包含序列号418、419和420的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含序列号422、423和424的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体。
在本发明的其他实施方式中，本发明的抗体或其片段与抗肿瘤剂缀合。
本发明还提供组合地包含本发明的上述药物组合物、和含抗肿瘤剂的药物组合物的组合药物。
本发明还提供胆囊癌的治疗和/或预防方法，包括将本发明的上述药物组合物或上述组合药物施与受试者的步骤。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申2012-080780号的说明书和/或附图所记载的内容。
发明的效果
本发明中使用的针对CAPRIN-1蛋白质的抗体(以下，多次记为“抗CAPRIN-1抗体”)毒害胆囊癌细胞。因此，针对CAPRIN-1蛋白质的抗体在胆囊癌的治疗和/或预防中是有用的。
具体实施方式
本发明中使用的针对由序列号2～30中的偶数序列号所示的氨基酸序列组成的多肽的抗体的抗肿瘤活性，可以通过在生物体内调查对荷癌动物的肿瘤增殖的抑制来评价，或者，如后所述，通过在生物体外调查对表达该多肽的肿瘤细胞是否显示介由免疫细胞或补体的细胞毒活性来评价。
此外，编码由序列号2～30中的偶数序列号(即，序列号2、4、6……8、30)的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的碱基序列分别在序列号1～29中的奇数的序列号(即，序列号1、3、5……27、29)中显示。
序列表的序列号6、8、10、12和14所示的氨基酸序列是通过使用了来源于狗精巢组织的cDNA文库和患乳癌的狗的血清的SEREX法，作为与在来源于荷癌狗的血清中特异性地存在的抗体结合的多肽分离而得的CAPRIN-1蛋白质的氨基酸序列，另外序列号2和4所示的氨基酸序列是作为其人同源因子(同源物或直系同源物)分离而得的CAPRIN-1蛋白质的氨基酸序列，序列号16所示的氨基酸序列是作为其牛同源因子分离而得的CAPRIN-1蛋白质的氨基酸序列，序列号18所示的氨基酸序列是作为其马同源因子分离而得的CAPRIN-1蛋白质的氨基酸序列，序列号20～28所示的氨基酸序列是作为其小鼠同源因子分离而得的CAPRIN-1蛋白质的氨基酸序列，序列号30所示的氨基酸序列是作为其鸡同源因子分离而得的CAPRIN-1蛋白质的氨基酸序列(参照后述的实施例1)。已知CAPRIN-1蛋白质在分裂间期的正常细胞发生活化和/或细胞分裂时表达。
通过本研究明确了，CAPRIN-1蛋白质在胆囊癌细胞的细胞表面表达。在本发明中，优选使用与CAPRIN-1蛋白质中在胆囊癌细胞的细胞表面表达的部分结合的抗体。作为在胆囊癌细胞的细胞表面表达的CAPRIN-1蛋白质中的部分肽(片段)，可列举包含序列表的序列号2～30中除了序列号6和序列号18以外的偶数号所示的氨基酸序列中的氨基酸残基号(aa)233-343、氨基酸残基号(aa)512-C末端、氨基酸残基号(aa)50-98的区域内的连续7个以上氨基酸残基的肽，具体例如，包含序列号429、序列号428、序列号273(在序列号273所示的氨基酸序列中，优选序列号274或序列号275所示的氨基酸序列的区域)、序列号266(在序列号266所示的氨基酸序列中，优选序列号267或序列号268所示的氨基酸序列的区域)、序列号270、序列号272、序列号269、序列号430、序列号431或序列号432所示的氨基酸序列、或与该氨基酸序列具有80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上、例如96％以上、97％以上、98％以上、99％以上等的序列同一性的氨基酸序列中的连续7个以上氨基酸残基的部分肽，本发明中使用的抗体包含与这些肽结合、且显示抗肿瘤活性的全部抗体。
本发明中使用的上述抗CAPRIN-1抗体只要能够发挥抗肿瘤活性就可以是任何种类的抗体，包含例如，单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、例如合成抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体、三特异性抗体等)、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体(scFv)等人抗体，它们的抗体片段、例如Fab、F(ab’)2、Fv等。这些抗体及其片段还可以通过本领域技术人员公知的方法制备。在本发明中，期望是能够与CAPRIN-1蛋白质特异性地结合的抗体，优选是单克隆抗体，但只要能够稳定地生产均质的抗体，则也可以是多克隆抗体。另外，在受试者是人的情况下，为了避免或抑制排斥反应，优选为人抗体或人源化抗体。
这里，“与CAPRIN-1蛋白质特异性地结合”，是指与CAPRIN-1蛋白质特异性地结合，与除了CAPRIN-1蛋白质以外的蛋白质实质上不结合。
可以在本发明中使用的抗体的抗肿瘤活性，如后所述，可以通过在活体内检查对荷癌动物的肿瘤增殖的抑制，或者通过在活体外检查对表达该多肽的肿瘤细胞是否显示介由免疫细胞或补体的细胞毒活性，来进行评价。
进而另外，作为本发明中的胆囊癌的治疗和/或预防的对象的受试者是人、宠物、家畜类、竞技用动物等哺乳动物，优选的受试者是人。
以下，关于本发明所涉及的抗原的制作、抗体的制作、以及药物组合物进行说明。
＜抗体制作用抗原的制作＞
作为用于获取本发明中使用的抗CAPRIN-1抗体的致敏抗原使用的蛋白质或其片段，可以来源于人、狗、牛、马、小鼠、大鼠、鸡等，对成为其来源的动物种类没有限制。但是优选考虑与在细胞融合中使用的母细胞的相容性来选择，一般来说，优选来源于哺乳动物的蛋白质，特别优选来源于人的蛋白质。例如当CAPRIN-1蛋白质是人CAPRIN-1蛋白质时，可以使用人CAPRIN-1蛋白质和/或其部分肽、表达人CAPRIN-1蛋白质的细胞等。
人CAPRIN-1蛋白质及其同源物的碱基序列和氨基酸序列例如可以通过访问GenBank(美国NCBI)，利用BLAST、FASTA等算法(Karlin and Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5873-5877，1993；Altschul et al.，Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997)来得到。
在本发明中，当以人CAPRIN-1基因的碱基序列(序列号1或3)或氨基酸序列(序列号2或4)为基准时，包含与它们的ORF或成熟部分的碱基序列或氨基酸序列具有70％～100％、优选80％～100％、更优选90％～100％、进一步优选95％～100％、例如97％～100％、98％～100％、99％～100％或99.5％～100％的序列同一性的序列的核酸或蛋白质成为靶。这里，“％序列同一性”是将2个序列在导入间隙或不导入间隙的情况下以形成最大的类似度或一致度的方式比对(对齐)时，相同氨基酸(或碱基)相对于氨基酸(或碱基)的总数的百分比(％)。
CAPRIN-1蛋白质的片段具有从作为抗体所识别的最小单位的表位(抗原决定簇)的氨基酸长到小于该蛋白质的全长的长度。表位是指在哺乳动物、优选人中具有抗原性或免疫原性的多肽片段，其最小单位由约7～12个氨基酸、例如8～11个氨基酸组成。作为具体例，可列举序列号273、序列号266或序列号270或序列号272或序列号269所示的氨基酸序列，或与该氨基酸序列具有80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上的序列同一性的氨基酸序列。
上述的人CAPRIN-1蛋白质和/或包含其部分肽的多肽可以按照例如Fmoc法(芴基甲基氧基羰基法)、tBoc法(叔丁基氧基羰基法)等化学合成法来合成(日本生化学会编、生化学实验讲座1、蛋白质的化学(蛋白质的化学)IV、化学修飾と肽合成(化学修饰和肽合成)、东京化学同人(日本)、1981年)。另外，还可以利用各种市售的肽合成仪通过常规方法合成。另外，还可以使用公知的基因工程学方法(Sambrook等，Molecular Cloning，第2版，Current Protocols in Molecular Biology(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press、Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology，第3版，A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology(1995)，John Wiley & Sons等)，制备编码上述多肽的DNA，将该DNA整合到表达载体中并导入宿主细胞，在该宿主细胞中生产肽，从而得到作为目的肽。
编码上述多肽的DNA可以通过公知的基因工程学方法和/或使用了市售的核酸合成仪的常规方法来容易地制备。例如，包含序列号1的碱基序列的DNA可以通过使用人染色体或cDNA文库作为模板，使用以能扩增序列号1所记载的碱基序列的方式设计的一对引物进行PCR，从而制备。PCR的反应条件可以适当设定，可以列举例如，使用耐热性DNA聚合酶(例如Taq聚合酶等)和含有Mg2+的PCR缓冲液，将包含在94℃保持30秒(变性)、在55℃保持30秒～1分钟(退火)、在72℃保持2分钟(延伸)的反应过程作为1个循环，例如进行30个循环后，在72℃反应7分钟的条件等，但不限定于此。对于PCR的方法、条件等，例如记载于Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology，第3版，A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology(1995)，John Wiley & Sons(特别是第15章)中。
另外，可以基于本说明书中的序列表的序列号1～30所示的碱基序列和氨基酸序列的信息，制备适当的探针和/或引物，使用该探针和/或引物来对人等的cDNA文库进行筛选，从而分离所需的DNA。cDNA文库优选由表达序列号2～30中的偶数序列号的蛋白质的细胞、器官或组织来制作。这样的细胞或组织的例子是来源于精巢、白血病、乳癌、淋巴瘤、脑瘤、肺癌、大肠癌、胆囊癌等癌或肿瘤的细胞或组织。上述探针或引物的制备、cDNA文库的构建、cDNA文库的筛选、以及目的基因的克隆等操作对于本领域技术人员而言是已知的，可以按照例如Sambrook等，Molecular Cloning，第2版，Current Protocols in Molecular Biology(1989)、Ausbel等(上述)等所记载的方法来进行。由这样得到的DNA，可以获得编码人CAPRIN-1蛋白质和/或其部分肽的DNA。
作为上述宿主细胞，只要是可表达上述多肽的细胞，就可以是任何细胞，作为原核细胞的例子可以列举大肠杆菌等，作为真核细胞的例子可以列举猴肾脏细胞COS1、中国仓鼠卵巢细胞CHO等哺乳动物细胞、人胎儿肾脏细胞株HEK293、小鼠胚胎皮肤细胞株NIH3T3、芽殖酵母、裂殖酵母等的酵母细胞、蚕细胞、爪蟾卵细胞等，但不限于这些。
当使用原核细胞作为宿主细胞时，作为表达载体，使用具有能在原核细胞中复制的复制起点(Origin)、启动子、核糖体结合部位、多克隆位点、终止子、抗药性基因、营养缺陷型互补基因等的表达载体。作为大肠杆菌用表达载体，可以例示pUC系、pBluescriptII、pET表达系统、pGEX表达系统等。如果将编码上述多肽的DNA整合到这样的表达载体中，用该载体转化原核宿主细胞后，培养所得的转化体，则可以在原核宿主细胞中表达由上述DNA编码的多肽。此时，也可以将该多肽制成与其他蛋白质的融合蛋白质使其表达。
当使用真核细胞作为宿主细胞时，作为表达载体，使用具有启动子、剪接区、多聚(A)添加部位等的真核细胞用表达载体。作为这样的表达载体，可以例示pKA1、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBV载体、pRS、pcDNA3、pYES2等。与上述同样地，如果将编码上述多肽的DNA整合到这样的表达载体中，用该载体转化真核宿主细胞后，培养所得的转化体，则可以在真核宿主细胞中表达由上述DNA编码的多肽。当使用pIND/V5-His、pFLAG-CMV-2、pEGFP-N1、pEGFP-C1等作为表达载体时，可以作为附加了His标签(例如(His)6～(His)10)、FLAG标签、myc标签、HA标签、GFP等各种标签的融合蛋白质，而表达上述多肽。
表达载体向宿主细胞中的导入可以使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法、显微注射、病毒感染、脂质体转染、与细胞膜透过性肽的结合等周知的方法。
为了从宿主细胞中分离纯化目的多肽，可以将公知的分离操作组合来进行。可以列举例如，利用脲等变性剂和/或表面活性剂的处理、超声波处理、酶消化、盐析和/或溶剂分别沉淀法、透析、离心分离、超滤、凝胶过滤、SDS-PAGE、等电点电泳、离子交换层析、疏水层析、亲和层析、反相层析等，但不限于此。
＜抗体的结构＞
抗体通常是至少含有2条重链和2条轻链的杂多聚体糖蛋白质。除了IgM以外，是由2条相同的轻(L)链和2条相同的重(H)链构成的约150kDa的杂四聚体糖蛋白质。典型地，各个轻链通过1个二硫共价键与重链连接，但各种免疫球蛋白同种型的重链之间的二硫键的数有变化。各个重链和轻链还具有链内二硫键。各个重链在一端具有可变区(VH区)，几个恒定区与其连接。各个轻链具有可变区(VL区)，在其相反端具有1个恒定区。轻链的恒定区与重链最初的恒定区对齐，且轻链可变区与重链的可变区对齐。抗体的可变区通过被称为互补性决定区(CDR)的特定区域而表现特定的可变性，从而赋予抗体以结合特异性。可变区中相对保守的部分被称为框架区(FR)。完整的重链和轻链的可变区分别包含通过3个CDR连接的4个FR。3个CDR在重链中从其N末端依次被称为CDRH1、CDRH2、CDRH3，同样在轻链中被称为CDRL1、CDRL2、CDRL3。在抗体对抗原的结合特异性中，CDRH3最为重要。另外，各链的CDR通过FR区以接近的状态被保持在一起，与来自其他链的CDR一同有助于抗体的抗原结合部位的形成。恒定区不直接有助于抗体与抗原结合，但表现各种效应器功能，例如，显示与抗体依赖性细胞性细胞毒活性(ADCC)的相关、介由对Fcγ受体的结合而产生的吞噬作用、介由新生儿Fc受体(FcRn)的半衰期/清除速度、介由补体级联的C1q构成要素的补体依赖性细胞毒(CDC)。
＜抗体的制作＞
本发明中的抗CAPRIN-1抗体是指与CAPRIN-1蛋白质的全长或其片段具有免疫反应性的抗体。
这里，“免疫反应性”是指在生物体内抗体与CAPRIN-1抗原结合的特性，介由这样的结合而对肿瘤发挥毒害(例如，死灭、抑制或衰退)的功能。即，本发明中使用的抗体只要能够与CAPRIN-1蛋白质结合而毒害胆囊癌，则可以是任何种类。
抗体的例子包含单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、抗体片段(例如Fab、F(ab’)2、Fv等)等。另外，抗体是免疫球蛋白分子的任意类例如IgG、IgE、IgM、IgA、IgD和IgY，或任意亚类例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等。
抗体进而除了糖基化以外，也可以通过乙酰化、甲酰化、酰胺化、磷酸化、或聚乙二醇(PEG)化等而被修饰。
以下显示各种抗体的制作例。
当抗体是单克隆抗体时，例如，将CAPRIN-1蛋白质、表达CAPRIN-1蛋白质的胆囊癌细胞或其细胞株(例如TGBC14TKB)等施与小鼠而进行免疫，从该小鼠取出脾脏，将细胞分离，然后使该细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，从所得的融合细胞(杂交瘤)中选择产生具有癌细胞增殖抑制作用的抗体的克隆。分离产生具有癌细胞增殖抑制作用的单克隆抗体的杂交瘤，培养该杂交瘤，从培养上清通过一般的亲和纯化法来纯化抗体，从而可以制备。
产生单克隆抗体的杂交瘤，例如，也可以如下地制作。首先，按照公知的方法，用致敏抗原对动物进行免疫。作为一般的方法，可以通过将致敏抗原向哺乳动物的腹腔内或皮下注射来进行。具体来说，可以将致敏抗原用PBS(磷酸盐缓冲液，Phosphate-Buffered Saline)和/或生理盐水等稀释成适当量、进行悬浮，在所得的产物中根据需要适量混合通常的佐剂、例如弗氏完全佐剂，乳化后，每4～21天对哺乳动物施与，施与数次。另外，致敏抗原免疫时也可以使用合适的载体。
这样将哺乳动物进行免疫，确认在血清中所需的抗体水平升高，然后从哺乳动物采取免疫细胞，进行细胞融合，作为优选的免疫细胞，特别可以列举脾细胞。
作为与上述免疫细胞融合的其他母细胞，使用哺乳动物的骨髓瘤细胞。该骨髓瘤细胞优选使用公知的各种细胞株，例如，P3U1(P3-X63Ag8U1)、P3(P3x63Ag8.653)(J.Immunol.(1979)123，1548-1550)、P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81，1-7)、NS-1(Kohler.G.and Milstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6，511-519)、MPC-11(Margulies.D.H.et al.，Cell(1976)8，405-415)、SP2/0(Shulman，M.et al.，Nature(1978)276，269-270)、FO(deSt.Groth，S.F.et al.，J.Immunol.Methods(1980)35，1-21)、S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148，313-323)、R210(Galfre，G.et al.，Nature(1979)277，131-133)等。
上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合基本上可以按照公知的方法，例如Kohler和Milstein的方法(Kohler，G.and Milstein，C.Methods Enzymol.(1981)73，3-46)等来进行。
更具体地，上述细胞融合，例如可在细胞融合促进剂的存在下、在通常的营养培养液中实施。作为融合促进剂，可以使用例如，聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，进而根据需要为了提高融合效率，还可以添加使用二甲基亚砜等助剂。
免疫细胞与骨髓瘤细胞的使用比例可以任意地设定。例如优选使免疫细胞相对于骨髓瘤细胞为1～10倍。作为在上述细胞融合中使用的培养液，可以使用例如，适合上述骨髓瘤细胞株的增殖的RPMI1640培养液、MEM培养液、其他可以在这种细胞培养中使用的通常的培养液，进一步也可以合并使用胎牛血清(FCS)等血清补液。
在细胞融合中，将规定量的上述免疫细胞和骨髓瘤细胞在上述培养液中充分混合，将预先加温至37℃左右的PEG溶液(例如，平均分子量1000～6000左右)以通常30～60％(w/v)的浓度添加、混合，由此形成作为目的的杂交瘤。接着，将逐次添加适当的培养液、离心除去上清的操作反复进行，由此除去对于杂交瘤的生长不利的细胞融合剂等。
这样得到的杂交瘤可以通过在通常的选择培养液，例如HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶脱氧核苷的培养液)中培养来选择。上述HAT培养液中的培养持续对于除了作为目的的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死灭充分的时间(通常数天～数周)。然后，实施通常的有限稀释法，进行产生目的抗体的杂交瘤的筛选和单克隆化。
另外，除了对除人以外的动物免疫抗原来得到上述杂交瘤以外，还可以将人淋巴细胞、例如感染了EB病毒的人淋巴细胞在体外(in vitro)用蛋白质、蛋白质表达细胞或其溶解物致敏，使致敏淋巴细胞与来源于人的具有永久分裂能力的骨髓瘤细胞、例如U266(注册号TIB196)融合，得到产生具有所希望的活性(例如，细胞增殖抑制活性)的人抗体的杂交瘤。
这样制备的产生单克隆抗体的杂交瘤可以在通常的培养液中传代培养，另外，可在液氮中长期保存。
即，可以使用所需抗原或表达所需抗原的细胞作为致敏抗原，按照通常的免疫方法进行免疫，利用通常的细胞融合法使所得的免疫细胞与公知的母细胞融合，通过通常的筛选法筛选产生单克隆抗体的细胞(杂交瘤)，从而制作。
可以在本发明中使用的抗体的其他例是多克隆抗体。多克隆抗体例如可以如下得到。
将天然的CAPRIN-1蛋白质、或作为与GST等的融合蛋白质而在大肠杆菌等微生物中表达的重组CAPRIN-1蛋白质、或其部分肽免疫小鼠、产生人抗体的小鼠、兔等小动物，获得血清。将该血清通过例如硫酸铵沉淀、蛋白A、蛋白G柱、DEAE离子交换层析、偶联了CAPRIN-1蛋白质和/或合成肽的亲和柱等来纯化，从而制备。在后述的实施例中，制作了针对CAPRIN-1蛋白质的兔多克隆抗体，确认了抗肿瘤效果。
这里，作为产生人抗体的小鼠，已知例如KM小鼠(キリンファーマ/Medarex)和Xeno小鼠(Amgen)(例如，国际公开第WO02/43478号、国际公开第WO02/092812号等)。将这样的小鼠用CAPRIN-1蛋白质或其片段进行免疫时，可以从血液得到完全人多克隆抗体。另外，可以从免疫后的小鼠中取出脾脏细胞，利用与骨髓瘤细胞的融合法来制作人型单克隆抗体。
抗原的制备可以按照例如使用了动物细胞的方法(日本特表2007-530068)和/或使用了杆状病毒的方法(例如，国际公开第WO98/46777号等)等来进行。当抗原的免疫原性低时，使其与白蛋白等具有免疫原性的巨大分子结合而进行免疫即可。
进一步还可以使用将抗体基因由杂交瘤克隆化，整合到适当的载体中，并将其导入宿主，使用基因重组技术而产生的基因重组型抗体(参照例如Carl，A.K.Borrebaeck，James，W.Larrick，THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES，Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD，1990)。具体来说，由杂交瘤的mRNA使用逆转录酶来合成抗体的可变区(V区)的cDNA。如果可得到编码目的抗体的V区的DNA，则将其与编码所希望的抗体恒定区(C区)的DNA连接，将连接产物整合到表达载体中。或者也可以将编码抗体的V区的DNA整合到包含抗体C区的DNA的表达载体中。上述DNA以在表达控制区域、例如增强子、启动子的控制下表达的方式整合到表达载体中。接着可以用该表达载体转化宿主细胞，使抗体表达。
本发明中使用的抗CAPRIN-1抗体优选为单克隆抗体。但是，也可以是多克隆抗体、基因改变抗体(嵌合抗体、人源化抗体等)等。
单克隆抗体包含人单克隆抗体、非人动物单克隆抗体(例如小鼠单克隆抗体、大鼠单克隆抗体、兔单克隆抗体、鸡单克隆抗体等)等。单克隆抗体可以通过培养杂交瘤来制作，所述杂交瘤通过将来自免疫了CAPRIN-1蛋白质的非人哺乳动物(例如，小鼠、产生人抗体的小鼠等)的脾细胞与骨髓瘤细胞的融合而得到。在后述的实施例中，制作了单克隆抗体，确认了抗肿瘤效果。这些单克隆抗体包含具有序列号40、序列号50、序列号60、序列号70、序列号80、序列号90、序列号100、序列号110、序列号120、序列号130、序列号135、序列号145、序列号160、序列号170、序列号200、序列号210、序列号220、序列号230、序列号240、序列号250、序列号279、序列号294、序列号304、序列号314、序列号324、序列号334、序列号344、序列号359、序列号363、序列号368、序列号372、序列号376、序列号386、序列号396、序列号401、序列号411或序列号421的氨基酸序列的重链可变(VH)区、和具有序列号44、序列号54、序列号64、序列号74、序列号84、序列号94、序列号104、序列号114、序列号124、序列号139、序列号149、序列号155、序列号164、序列号174、序列号180、序列号185、序列号190、序列号195、序列号204、序列号214、序列号224、序列号234、序列号244、序列号254、序列号283、序列号289、序列号298、序列号308、序列号318、序列号328、序列号338、序列号348、序列号361、序列号365、序列号370、序列号380、序列号390、序列号405、序列号415或序列号425的氨基酸序列的轻链可变(VL)区，这里，该VH区包含序列号37、序列号47、序列号57、序列号67、序列号77、序列号87、序列号97、序列号107、序列号117、序列号127、序列号132、序列号142、序列号157、序列号167、序列号197、序列号207、序列号217、序列号227、序列号237、序列号247、序列号276、序列号291、序列号301、序列号311、序列号321、序列号331、序列号341、序列号351、序列号373、序列号383、序列号393、序列号398、序列号408或序列号418的氨基酸序列所示的CDR1、序列号38、序列号48、序列号58、序列号68、序列号78、序列号88、序列号98、序列号108、序列号118、序列号128、序列号133、序列号143、序列号158、序列号168、序列号198、序列号208、序列号218、序列号228、序列号238或序列号248、序列号277、序列号292、序列号302、序列号312、序列号322、序列号332、序列号342、序列号352、序列号374、序列号384、序列号394、序列号399、序列号409或序列号419的氨基酸序列所示的CDR2和序列号39、序列号49、序列号59、序列号69、序列号79、序列号89、序列号99、序列号109、序列号119、序列号129、序列号134、序列号144、序列号159、序列号169、序列号199、序列号209、序列号219、序列号229、序列号239、序列号249、序列号278、序列号293、序列号303、序列号313、序列号323、序列号333、序列号343、序列号353、序列号357、序列号375、序列号385、序列号395、序列号400、序列号410、序列号420的氨基酸序列所示的CDR3，该VL区包含序列号41、序列号51、序列号61、序列号71、序列号81、序列号91、序列号101、序列号111、序列号121、序列号136、序列号146、序列号152、序列号161、序列号171、序列号177、序列号182、序列号187、序列号192、序列号201、序列号211、序列号221、序列号231、序列号241、序列号251、序列号280、序列号286、序列号295、序列号305、序列号315、序列号325、序列号335、序列号345、序列号354、序列号377、序列号387、序列号402、序列号412或序列号422的氨基酸序列所示的CDR1、序列号42、序列号52、序列号62、序列号72、序列号82、序列号92、序列号102、序列号112、序列号122、序列号137、序列号147、序列号153、序列号162、序列号172、序列号178、序列号183、序列号188、序列号193、序列号202、序列号212、序列号222、序列号232、序列号242、序列号252、序列号281、序列号287、序列号296、序列号306、序列号316、序列号326、序列号336、序列号346、序列号355、序列号378、序列号388、序列号403、序列号413或序列号423的氨基酸序列所示的CDR2和序列号43、序列号53、序列号63、序列号73、序列号83、序列号93、序列号103、序列号113、序列号123、序列号138、序列号148、序列号154、序列号163、序列号173、序列号179、序列号184、序列号189、序列号194、序列号203、序列号213、序列号223、序列号233、序列号243、序列号253、序列号282、序列号288、序列号297、序列号307、序列号317、序列号327、序列号337、序列号347、序列号356、序列号379、序列号389、序列号404、序列号414或序列号424的氨基酸序列所示的CDR3。
嵌合抗体是将来源于不同动物的序列组合而制作的抗体，例如是包含小鼠抗体的重链、轻链的可变区和人抗体的重链、轻链的恒定区的抗体等。嵌合抗体的制作可以使用公知的方法来进行，例如可以通过将编码抗体V区的DNA与编码人抗体C区的DNA连接，将其整合到表达载体中并导入宿主，而使其产生，从而得到。
多克隆抗体包含对产生人抗体的动物(例如，小鼠)免疫CAPRIN-1蛋白质而得的抗体。
人源化抗体是也称为重构(reshaped)人抗体的改变抗体。人源化抗体通过将来源于免疫动物的抗体的CDR移植到人抗体的互补性决定区中来构建。其一般的基因重组方法也是已知的。
具体来说，通过PCR法，由以末端部具有重叠部分的方式制作的数个寡核苷酸，合成以将小鼠抗体的CDR与人抗体的框架区(framework region；FR；包含FR1～FR4)从N末端侧开始按照FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的顺序连接的方式设计的DNA序列。将所得的DNA与编码人抗体恒定区的DNA连接，接着整合到表达载体中，将其导入宿主而使其产生，从而得到人源化抗体(参照欧洲专利申请公开第EP239400号、国际公开第WO96/02576号)。介由CDR连接的人抗体的FR可以选择形成互补性决定区良好的抗原结合部位的FR。根据需要，也可以替换抗体的可变区中的框架区的氨基酸，以使重构人抗体的互补性决定区形成适当的抗原结合部位(Sato K.et al.，Cancer Research 1993，53：851-856)。另外，可以替换为各种来源于人抗体的框架区(参考国际公开第WO99/51743号)。
制作了嵌合抗体或人源化抗体之后，可以将可变区(例如，FR)和/或恒定区中的氨基酸用其他氨基酸替换等。
氨基酸的替换例如是小于15个、小于10个、8个以下、7个以下、6个以下、5个以下、4个以下、3个以下、或2个以下的氨基酸、优选1～5个氨基酸、更优选1或2个氨基酸的替换，替换抗体应与未替换抗体在功能上等同。期望替换是保守的氨基酸替换，这是电荷、侧链、极性、芳香族性等性质类似的氨基酸之间的替换。性质类似的氨基酸例如可以分类为碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸)、无极性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸)、支链氨基酸(亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸)等。
作为抗体修饰物，可以列举例如与聚乙二醇(PEG)等各种分子结合的抗体。在本发明中使用的抗体修饰物中，对所结合的物质不限定。为了得到这样的抗体修饰物，可以通过对所得的抗体实施化学修饰来得到。这些方法在本领域已经被确立。
这里，“在功能上等同”是指成为对象的抗体与本发明中使用的抗体具有同样的生物学或生物化学活性、具体来说是毒害肿瘤的功能，在对人应用时本质上不发生排斥反应等。作为这样的活性，可以列举例如，细胞增殖抑制活性或结合活性。
作为用于制备与某多肽在功能上等同的多肽的本领域技术人员熟知的方法，已知在多肽中导入突变的方法。例如只要是本领域技术人员，就可以使用定点诱变法(Hashimoto-Gotoh，T.et al.，(1995)Gene 152，271-275、Zoller，MJ.，and Smith，M.(1983)Methods Enzymol.100，468-500、Kramer，W.et al.，(1984)Nucleic Acids Res.12，9441-9456、Kramer，W.and Fritz，HJ.，(1987)Methods Enzymol.154，350-367、Kunkel，TA.，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82，488-492、Kunkel(1988)Methods Enzymol.85，2763-2766)等，在本发明中使用的抗体中导入适当的突变，由此制备与该抗体在功能上等同的抗体。
上述识别由抗CAPRIN-1抗体所识别的CAPRIN-1蛋白质的表位的抗体，可以利用本领域技术人员公知的方法得到。例如，可以通过下述方法等来得到：通过通常的方法(例如表位作图(epitope mapping)等)确定由抗CAPRIN-1抗体所识别的CAPRIN-1蛋白质的表位，以具有该表位中所含的氨基酸序列的多肽作为免疫原来制作抗体的方法；确定通过通常的方法制作的抗体的表位，选择表位与抗CAPRIN-1抗体相同的抗体的方法等。
本发明中使用的抗体的亲和常数Ka(kon/koff)优选至少为107M-1、至少为108M-1、至少为5×108M-1、至少为109M-1、至少为5×109M-1、至少为1010M-1、至少为5×1010M-1、至少为1011M-1、至少为5×1011M-1、至少为1012M-1、或者至少为1013M-1。
本发明中使用的抗体可以与抗肿瘤剂缀合。抗体与抗肿瘤剂的结合可以介由具有与氨基、羧基、羟基、硫醇基等为反应性的基团(例如，琥珀酰亚胺基、甲酰基、2-吡啶基二硫代基、马来酰亚胺基、烷氧基羰基、羟基等)的间隔物来进行。
抗肿瘤剂的例子包含通过文献等而公知的下述抗肿瘤剂，即，紫杉醇、多柔比星、柔红霉素、环磷酰胺、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、噻替哌、白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡、benzodopa、卡波醌、meturedopa、uredopa、六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基三聚氰胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺(triethilenethiophosphoramide)、三羟甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine)、布拉他辛、布拉他辛酮、喜树碱、苔藓虫素、海绵多聚乙酰(callystatin)、cryptophycin1、cryptophycin8、海兔毒素(dolastatin)、倍癌霉素(duocarmycin)、艾榴塞洛素(eleutherobin)、水鬼蕉碱(pancratistatin)、匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)、spongistatin、苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、甲氮芥、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、乌拉莫司汀、卡莫司汀、氯乙链脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、卡奇霉素(calicheamicin)、达内霉素(dynemicin)、氯屈膦酸、埃斯培拉霉素(esperamicin)、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素、更生霉素、detorbicin、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素(ADRIAMYCIN)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素、甲基丝裂霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)、二甲叶酸(denopterin)、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)、氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、安西他滨、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮杂尿苷(azauridine)、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，例如，卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酮(testolactone)、氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦、亚叶酸(frolinic acid)、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶(eniluracil)、安吖啶(amsacrine)、阿莫司汀(bestrabucil)、比生群(bisantrene)、依达曲沙(edatraxate)、defofamine、秋水仙胺(demecolcine)、地吖醌(diaziquone)、依氟鸟氨酸(elfornithine)、依利醋铵(elliptinium)、埃博霉素(epothilone)、依托格鲁(etoglucid)、香茹多糖、氯尼达明(lonidamine)、美登素(maytansine)、安丝菌素(ansamitocine)、米托胍腙(mitoguazone)、米托蒽醌、mopidanmol、二胺硝吖啶nitraerine、喷司他丁、蛋氨氮芥(phenamet)、吡柔比星、洛索蒽醌(losoxantrone)、足叶草酸(podophyllinic acid)、2-乙基酰肼、甲苄肼、雷佐生(razoxane)、根瘤菌素(rhizoxin)、西佐喃、锗螺胺(spirogermanium)、细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)、三乙撑亚胺苯醌(triaziquone)、杆孢菌素(roridine)A、蛇形菌素(anguidine)、聚氨酯、长春地辛、达卡巴嗪、甘露醇氮芥(mannomustine)、二溴甘露醇、二溴卫矛醇(mitolactol)、哌泊溴烷(pipobroman)、gacytosine、多西他赛、瘤可宁、吉西他滨(gemcitabine)、6-硫鸟嘌呤、巯嘌呤、顺铂、奥沙利铂、卡波铂、长春碱、足叶乙甙、异环磷酰胺、米托葸醌、长春新碱、长春瑞滨、诺消灵(novantrone)、替尼泊苷、依达曲沙(edatrexate)、道诺霉素、氨蝶呤、希罗达(xeloda)、伊班膦酸盐(ibandronate)、伊立替康、拓扑异构酶抑制剂、二氟甲基鸟氨酸(DMFO)、视黄酸、卡培他滨(capecitabine)，以及它们的药学上容许的(公知的)盐或(公知的)衍生物。
在抗体是与抗肿瘤剂缀合了的抗体的情况下，作为评价是否发挥抗肿瘤活性的方法，例如，如果是来源于小鼠的抗CAPRIN-1抗体，则可以使在与小鼠抗体结合的二抗上附带了药物的物质同时反应，在生物体外评价对人癌细胞的抗肿瘤效果。例如，可以使用结合了肥皂草素(Saporin)的抗人IgG抗体(Hum-ZAP(Advanced Targeting Systems))进行评价。
另外，通过将本发明中使用的抗体与抗肿瘤剂合并使用施与，可以得到更高的治疗效果。本方法对表达CAPRIN-1蛋白质的癌患者可以适应外科的手术前后的任一阶段。特别地在手术后，对目前用抗肿瘤剂单独处置的表达CAPRIN-1蛋白质的癌，可以得到更好的癌复发防止和/或生存时间的延长。
用于合并使用施与的抗肿瘤剂的例子，也包含通过文献等而公知的上述的抗肿瘤剂、以及它们的药学上容许的(公知的)盐或(公知的)衍生物。上述中，特别优选使用环磷酰胺、紫杉醇、多西他赛、长春瑞滨等。
或者，本发明中使用的抗体也可以结合通过文献等而公知的211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153SM、212Bi、32P、175Lu、176Lu等放射性同位素。放射性同位素期望是能有效地用于治疗或诊断肿瘤的放射性同位素。
本发明中使用的抗体是与CAPRIN-1蛋白质具有免疫反应性的抗体、或者与CAPRIN-1蛋白质特异性地结合的抗体，并且是显示对胆囊癌的细胞毒活性或肿瘤增殖抑制作用的抗体。该抗体应该是具有能够在施与该抗体的对象动物中几乎避免或完全避免产生排斥反应那样的结构的抗体。作为这样的抗体，例如在对象动物为人时，可以列举人抗体、人源化抗体、嵌合抗体(例如人-小鼠嵌合抗体)、单链抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体、三特异性抗体等)等。这些抗体是作为重链和轻链的可变区来源于人抗体的抗体；重链和轻链的可变区由来源于非人动物抗体的互补性决定区(CDR1、CDR2和CDR3)和来源于人抗体的框架区组成的抗体；或重链和轻链的可变区来源于非人动物抗体、且重链和轻链的恒定区来源于人抗体的抗体的重组型抗体。优选的抗体是前2种抗体。
这些重组型抗体可以如下制作。由杂交瘤等产生抗体的细胞克隆化编码抗人CAPRIN-1单克隆抗体(例如，人单克隆抗体、小鼠单克隆抗体、大鼠单克隆抗体、兔单克隆抗体、鸡单克隆抗体等)的DNA，将其作为模板利用RT-PCR法等来制作编码该抗体的轻链可变区和重链可变区的DNA，基于Kabat EU numbering system(Kabat等、Sequences of Proteins of Immunological Interest，5thEd.Public Health Service，National Institute of Health，Bethesda，Md.(1991))来确定轻链和重链的各可变区的序列、或各CDR1、CDR2、CDR3的序列。
进一步地，使用基因重组技术(Sambrook等，Molecular Cloning A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))或DNA合成仪来制作编码这些各可变区的DNA或编码各CDR的DNA。其中，产生上述人单克隆抗体的杂交瘤可以通过在对产生人抗体的动物(例如，小鼠)免疫人CAPRIN-1蛋白质后，使从该免疫动物切除的脾细胞与骨髓瘤细胞融合来制作。与此分别地，根据需要使用基因重组技术或DNA合成仪来制作编码来源于人抗体的轻链或重链的可变区和恒定区的DNA。
在人源化抗体的情况下，可以通过制作将编码来源于人抗体的轻链或重链的可变区的DNA中的CDR编码序列替换成与它们对应的来源于除人以外的动物(例如小鼠、大鼠、鸡等)的抗体的CDR编码序列而得的DNA，将由此而得的DNA分别与编码来源于人抗体的轻链或重链的恒定区的DNA连接，从而制作编码人源化抗体的DNA。
在嵌合抗体的情况下，可以通过将编码来源于除人以外的动物(例如小鼠、大鼠、鸡等)的抗体的轻链或重链的可变区的DNA，分别与编码来源于人抗体的轻链或重链的恒定区的DNA连接，从而制作编码嵌合抗体的DNA。
在单链抗体的情况下，该抗体是将重链可变区和轻链可变区通过连接物以直线状连接而成的抗体，可以通过将编码重链可变区的DNA、编码连接物的DNA、和编码轻链可变区的DNA结合，从而制作编码单链抗体的DNA。这里，重链可变区和轻链可变区都来源于人抗体，或者来源于仅CDR被来源于除人以外的动物(例如小鼠、大鼠、鸡等)的抗体的CDR替换而得的人抗体。另外，连接物包含12～19个氨基酸，可以列举例如15个氨基酸的(G4S)3(G.-B.Kim等，Protein Engineering Design and Selection 2007，20(9)：425-432)。
在双特异性抗体(例如，diabody)的情况下，该抗体是可与2个不同的表位特异性地结合的抗体，例如，可以通过将编码重链可变区A的DNA、编码轻链可变区B的DNA、编码重链可变区B的DNA、和编码轻链可变区A的DNA以该顺序进行结合(其中编码轻链可变区B的DNA与编码重链可变区B的DNA可介由编码如上所述的连接物的DNA来结合)，从而制作编码双特异性抗体的DNA。这里，重链可变区和轻链可变区都来源于人抗体，或者来源于仅CDR被来源于除人以外的动物(例如小鼠、大鼠、鸡等)的抗体的CDR替换而得的人抗体。
可以将如上所述制作的重组DNA整合到1个或多个适当的载体中，将其导入宿主细胞(例如，哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞等)，进行(共)表达，从而制作重组型抗体(P.J.Delves.，ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES.，1997 WILEY、P.Shepherd and C.Dean.，Monoclonal Antibodies.，2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS；J.W.Goding.，Monoclonal Antibodies：principles and practice.，1993ACADEMIC PRESS)。
通过上述的方法制作的本发明的抗体可列举例如以下的(a)～(ao)的抗体。
(a)含有包含由序列号37、38和39所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号41、42和43所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的、WO2011/096528所记载的抗体(例如，包含序列号40的重链可变区和序列号44的轻链可变区的抗体)。
(b)含有包含由序列号47、48和49所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号51、52和53所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的、WO2011/096519所记载的抗体(例如，包含序列号50的重链可变区和序列号54的轻链可变区的抗体)。
(c)含有包含由序列号57、58和59所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号61、62和63所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的、WO2011/096517所记载的抗体(例如，包含序列号60的重链可变区和序列号64的轻链可变区的抗体)。
(d)含有包含由序列号67、68和69所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号71、72和73所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的、WO2011/096528所记载的抗体(例如，包含序列号70的重链可变区和序列号74的轻链可变区的抗体)。
(e)含有包含由序列号77、78和79所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号81、82和83所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的、WO2011/096528所记载的抗体(例如，包含序列号80的重链可变区和序列号84的轻链可变区的抗体)。
(f)含有包含由序列号87、88和89所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号91、92和93所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的、WO2011/096528所记载的抗体(例如，包含序列号90的重链可变区和序列号94的轻链可变区的抗体)。
(g)含有包含由序列号97、98和99所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号101、102和103所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的、WO2011/096528所记载的抗体(例如，包含序列号100的重链可变区和序列号104的轻链可变区的抗体)。
(h)含有包含由序列号107、108和109所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号111、112和113所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的、WO2011/096528所记载的抗体(例如，包含序列号110的重链可变区和序列号114的轻链可变区的抗体)。
(i)含有包含由序列号117、118和119所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号121、122和123所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的、WO2011/096533所记载的抗体(例如，包含序列号120的重链可变区和序列号124的轻链可变区的抗体)。
(j)含有包含由序列号127、128和129所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号121、122和123所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的、WO2011/096533所记载的抗体(例如，包含序列号130的重链可变区和序列号124的轻链可变区的抗体)。
(k)含有包含由序列号132、133和134所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号136、137和138所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的、WO2011/096533所记载的抗体(例如，包含序列号135的重链可变区和序列号139的轻链可变区的抗体)。
(l)含有包含由序列号142、143和144所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号146、147和148所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的、WO2011/096534所记载的抗体(例如，包含序列号145的重链可变区和序列号149的轻链可变区的抗体)。
(m)含有包含由序列号142、143和144所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号152、153和154所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的、WO2011/096534所记载的抗体(例如，包含序列号145的重链可变区和序列号155的轻链可变区的抗体)。
(n)含有包含序列号157、158和159的CDR的重链可变区和包含序列号161、162和163的CDR的轻链可变区的、WO2011/096534所记载的抗体(例如，包含序列号160的重链可变区和序列号164的轻链可变区的抗体)。
(o)含有包含由序列号167、168和169所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号171、172和173所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的、WO2011/096534所记载的抗体(例如，包含序列号170的重链可变区和序列号174的轻链可变区的抗体)。
(p)含有包含由序列号167、168和169所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号177、178和179所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的、WO2010/016526所记载的抗体(例如，包含序列号170的重链可变区和序列号180的轻链可变区的抗体)。
(q)含有包含由序列号167、168和169所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号182、183和184所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的、WO2010/016526所记载的抗体(例如，包含序列号170的重链可变区和序列号185的轻链可变区的抗体)。
(r)含有包含由序列号167、168和169所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号187、188和189所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的、WO2010/016526所记载的抗体(例如，包含序列号170的重链可变区和序列号190的轻链可变区的抗体)。
(s)含有包含由序列号167、168和169所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号192、193和194所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的、WO2010/016526所记载的抗体(例如，包含序列号170的重链可变区和序列号195的轻链可变区的抗体)。
(t)含有包含由序列号197、198和199所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号201、202和203所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的、WO2010/016526所记载的抗体(例如，包含序列号200的重链可变区和序列号204的轻链可变区的抗体)。
(u)含有包含由序列号207、208和209所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号211、212和213所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的、WO2010/016526所记载的抗体(例如，包含序列号210的重链可变区和序列号214的轻链可变区的抗体)。
(v)含有包含由序列号217、218和219所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号221、222和223所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的、WO2010/016526所记载的抗体(例如，包含序列号220的重链可变区和序列号224的轻链可变区的抗体)。
(w)含有包含由序列号227、228和229所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号231、232和233所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的、WO2010/016526所记载的抗体(例如，包含序列号230的重链可变区和序列号234的轻链可变区的抗体)。
(x)含有包含由序列号237、238和239所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号241、242和243所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的、WO2010/016526所记载的抗体(例如，包含序列号240的重链可变区和序列号244的轻链可变区的抗体)。
(y)含有包含由序列号247、248和249所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号251、252和253所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的、WO2010/016526所记载的抗体(例如，包含序列号250的重链可变区和序列号254的轻链可变区的抗体)。
(z)含有包含由序列号276、277和278所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号280、281和282所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的、WO2013/018894所记载的抗体(例如，包含序列号279的重链可变区和序列号283的轻链可变区的抗体)。
(aa)含有包含由序列号276、277和278所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号286、287和288所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的、WO2013/018894所记载的抗体(例如，包含序列号279的重链可变区和序列号289的轻链可变区的抗体)。
(ab)含有包含由序列号291、292和293所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号295、296和297所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的、WO2013/018894所记载的抗体(例如，包含序列号294的重链可变区和序列号298的轻链可变区的抗体)。
(ac)含有包含由序列号301、302和303所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号305、306和307所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的、WO2013/018892所记载的抗体(例如，包含序列号304的重链可变区和序列号308的轻链可变区的抗体)。
(ad)含有包含由序列号311、312和313所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号315、316和317所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的、WO2013/018891所记载的抗体(例如，包含序列号314的重链可变区和序列号318的轻链可变区的抗体)。
(ae)含有包含由序列号321、322和323所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号325、326和327所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的、WO2013/018889所记载的抗体(例如，包含序列号324的重链可变区和序列号328的轻链可变区的抗体)。
(af)含有包含由序列号331、332和333所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号335、336和337所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的、WO2013/018883所记载的抗体(例如，包含序列号334的重链可变区和序列号338的轻链可变区的抗体)。
(ag)含有包含由序列号341、342和343所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号345、346和347所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体或其片段(例如，包含序列号344的重链可变区和序列号348的轻链可变区的抗体)。
(ah)含有包含由序列号351、352和353所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号354、355和356所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体或其片段(例如，包含序列号359的重链可变区和序列号361的轻链可变区的的抗体、包含序列号368的重链可变区和序列号370的轻链可变区的抗体、包含序列号372的重链可变区和序列号370的轻链可变区的抗体)。
(ai)含有包含由序列号351、352和357所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号354、355和356所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体或其片段(例如，包含序列号363的重链可变区和序列号365的轻链可变区的抗体)。
(aj)含有包含序列号373、374和375所示的氨基酸序列的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含序列号377、378和379所示的氨基酸序列的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体(例如，包含序列号376的重链可变区和序列号380的轻链可变区的抗体)。
(ak)含有包含序列号383、384和385所示的氨基酸序列的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含序列号387、388和389所示的氨基酸序列的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体或其片段(例如，包含序列号386的重链可变区和序列号390的轻链可变区的抗体)。
(al)含有包含序列号393、394和395所示的氨基酸序列的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含序列号387、388和389所示的氨基酸序列的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体或其片段(例如，包含序列号396的重链可变区和序列号390的轻链可变区的抗体)。
(am)含有包含由序列号398、399和400所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含由序列号402、403和404所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体或其片段(例如，包含序列号401的重链可变区和序列号405的轻链可变区的抗体)。
(an)含有包含序列号408、409和410的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含序列号412、413和414的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体或其片段(例如，包含序列号411的重链可变区和序列号415的轻链可变区的抗体)。
(ao)含有包含序列号418、419和420的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的重链可变区和包含序列号422、423和424的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的轻链可变区的抗体或其片段(例如，包含序列号421的重链可变区和序列号425的轻链可变区的抗体)。
这里，序列号67、68和69，序列号77、78和79，序列号87、88和89，序列号97、98和99，序列号107、108和109，序列号117、118和119，序列号127、128和129，序列号132、133和134，序列号142、143和144，序列号157、158和159，序列号167、168和169，序列号167、168和169，序列号197、198和199，序列号207、208和209，序列号217、218和219，序列号227、228和229，序列号237、238和239，序列号247、248和249，序列号276、277和278，291、292和293，301、302和303，311、312和313，321、322和323，331、332和333，341、342和343，373、374和375，383、384和385，393、394和395，398、399和400，408、409和410，418、419和420所示的氨基酸序列分别是小鼠抗体重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3，另外，序列号71、72和73，序列号81、82和83，序列号91、92和93，序列号101、102和103，序列号111、112和113，序列号121、122和123，序列号136、137和138，序列号146、147和148，序列号152、153和154，序列号161、162和163，序列号171、172和173，序列号177、178和179，序列号182、183和184，序列号187、188和189，序列号192、193和194，序列号201、202和203，序列号211、212和213，序列号221、222和223，序列号231、232和233，序列号241、242和243，序列号251、252和253，序列号280、281和282，序列号286、287和288，序列号295、296和297，序列号305、306和307，序列号315、316和317，序列号325、326和327，序列号335、336和337，序列号345、346和347，序列号377、378和379，序列号387、388和389，序列号402、403和404，序列号412、413和414，序列号422、423和424所示的氨基酸序列分别是小鼠抗体轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3。
另外，序列号37、38和39，序列号47、48和49，序列号57、58和59所示的氨基酸序列是鸡抗体重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3，进而另外，序列号41、42和43，序列号51、52和53，序列号61、62和63所示的氨基酸序列分别是鸡抗体轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3。
另外，序列号351、352和353所示的氨基酸序列是兔抗体重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3，进而另外，序列号354、355和356所示的氨基酸序列分别是兔抗体轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3。
另外，本发明中使用的人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体或多特异性抗体例如是以下的抗体(在抗体(ah)中例示)。
(i)重链的可变区包含序列号351、352和353的氨基酸序列以及来源于人抗体的框架区的氨基酸序列，且轻链的可变区包含序列号354、355和356的氨基酸序列以及来源于人抗体的框架区的氨基酸序列的抗体。
(ii)重链的可变区包含序列号351、352和353的氨基酸序列以及来源于人抗体的框架区的氨基酸序列，且重链的恒定区包含来源于人抗体的氨基酸序列，而且轻链的可变区包含序列号354、355和356的氨基酸序列以及来源于人抗体的框架区的氨基酸序列，且轻链的恒定区包含来源于人抗体的氨基酸序列的抗体。
(iii)重链的可变区包含序列号368的氨基酸序列，且重链的恒定区包含来源于人抗体的氨基酸序列，而且轻链的可变区包含序列号370的氨基酸序列，且轻链的恒定区包含来源于人抗体的氨基酸序列的抗体。
此外，人抗体重链和轻链的恒定区和可变区的序列，例如，可以由NCBI(美国：GenBank、UniGene等)获得，例如关于人IgG1重链恒定区，可以参照注册号J00228的序列，关于人IgG2重链恒定区，可以参照注册号J00230的序列，关于人IgG3重链恒定区，可以参照注册号X03604的序列，关于人IgG4重链恒定区，可以参照注册号K01316的序列，关于人轻链κ恒定区，可以参照注册号V00557、X64135、X64133等的序列，关于人轻链λ恒定区，可以参照注册号X64132、X64134等的序列。
此外，作为所述抗体(ah)的人源化抗体的具体例，是所述抗体(ai)、包含重链可变区的序列号368的重链可变区和序列号370的轻链可变区的抗体、包含序列号372的重链可变区和序列号370的轻链可变区的抗体。
上述抗体优选具有细胞毒活性，由此能够发挥抗肿瘤效果。
另外，可以明确上述抗体中的重链和轻链的可变区和/或CDR的特定序列仅仅是用于例示，并不限于特定的序列。制作能产生针对人CAPRIN-1蛋白质的其他人抗体或非人动物抗体(例如小鼠抗体)的杂交瘤，回收由杂交瘤产生的单克隆抗体，以与人CAPRIN-1的免疫结合性和细胞毒活性作为指标，来判定是否为目的抗体。由此识别产生目的单克隆抗体的杂交瘤后，如上所述，由该杂交瘤制作编码目的抗体的重链和轻链的可变区的DNA，进行序列确定，将该DNA用于其他抗体的制作。
进一步地，本发明中使用的上述抗体只要具有特异性地识别CAPRIN-1蛋白质这样的特异性，则上述(i)～(iv)的各抗体的特别是框架区的序列和/或恒定区的序列中，可以有1个或数个(优选为1个或2个)的氨基酸的替换、缺失或添加。这里数个是指2～5个、优选2个或3个。
认为本发明中使用的抗CAPRIN-1抗体对表达CAPRIN-1蛋白质的胆囊癌细胞的抗肿瘤效果，是通过以下机制而发生的。
表达CAPRIN-1蛋白质的细胞的效应器细胞抗体依赖的细胞毒性(ADCC)、和表达CAPRIN-1蛋白质的细胞的补体依赖的细胞毒性(CDC)。
因此，本发明中使用的抗CAPRIN-1抗体的活性评价，如以下实施例中具体显示的那样，可以通过在生物体外对表达CAPRIN-1蛋白质的胆囊癌细胞测定上述ADCC活性或CDC活性来进行评价。
认为本发明中使用的抗CAPRIN-1抗体与胆囊癌细胞上的CAPRIN-1蛋白质结合，通过上述活性而显示抗肿瘤作用，因此在胆囊癌的治疗或预防中是有用的。即，本发明提供以抗CAPRIN-1抗体为有效成分的、用于胆囊癌的治疗和/或预防的药物组合物。在将抗CAPRIN-1抗体以施与人体的目的(抗体治疗)而使用时，为了使免疫原性降低，优选制成人抗体和/或人源化抗体。
此外，抗CAPRIN-1抗体与胆囊癌细胞表面上的CAPRIN-1蛋白质的结合亲和性越高，越可以由抗CAPRIN-1抗体得到更强的抗肿瘤活性。因此，如果能够获得与CAPRIN-1蛋白质具有高的结合亲和性的抗CAPRIN-1抗体，则可以期待更强的抗肿瘤效果，可以适应制成以胆囊癌的治疗和/或预防为目的的药物组合物。作为高的结合亲和性，如上所述，期望是结合常数(亲和常数)Ka(kon/koff)优选为至少107M-1、至少108M-1、至少5×108M-1、至少109M-1、至少5×109M-1、至少1010M-1、至少5×1010M-1、至少1011M-1、至少5×1011M-1、至少1012M-1、或至少1013M-1。
＜对表达抗原的细胞的结合＞
抗体与CAPRIN-1蛋白质结合的能力可以利用如实施例中所述那样的使用了例如ELISA、蛋白质印迹法、免疫荧光和流式细胞仪分析等的结合分析来特定。
＜免疫组织化学染色＞
识别CAPRIN-1蛋白质的抗体，可以利用本领域技术人员公知的方法中的免疫组织化学，使用由外科手术期间从患者得到的组织、和/或从担载了接种有自然地或在转染后表达CAPRIN-1蛋白质的细胞系的异种移植组织的动物得到的组织，进行低聚甲醛或丙酮固定而得的冷冻切片，或用低聚甲醛固定并进行石蜡包埋而得的组织切片，关于与CAPRIN-1蛋白质的反应性进行试验。
为了进行免疫组织化学染色，可以用各种方法使对CAPRIN-1蛋白质具有反应性的抗体染色。例如可以通过与辣根过氧化物酶复合山羊抗小鼠抗体和/或山羊抗兔抗体反应，从而进行可视化。
＜药物组合物＞
本发明的用于胆囊癌的治疗和/或预防的药物组合物的靶，只要是表达CAPRIN-1基因的胆囊癌(细胞)就没有特别限定。
本说明书中使用的“肿瘤”和“癌”这样的术语是指恶性新生物，可以互换使用。
作为在本发明中成为对象的胆囊癌，是表达编码序列号2～30中的偶数序列号的氨基酸序列、与该氨基酸序列有80％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为97％以上的序列同一性的氨基酸序列、或包含这些氨基酸序列中连续7个以上、优选为8个以上氨基酸残基的其部分序列的基因的胆囊癌。胆囊癌包含在胆囊部位产生的癌(原发)、和/或转移的癌，但不限于这些。
另外，成为对象的动物是哺乳动物，例如，是包含灵长类、宠物、家畜类、竞技用动物等的哺乳动物，特别优选是人、狗和猫。
当将本发明中使用的抗体制成药物组合物使用时，可以利用本领域技术人员公知的方法进行制剂化。例如，可以以与水或除水以外的药学上容许的液体的无菌性溶液、或悬浮液剂的注射剂的形式非经口地使用。例如，认为可以与药理学上容许的担载体或介质、具体来说为灭菌水和/或生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、香味剂、赋形剂、媒介物(vehicle)、防腐剂、结合剂等适当组合，通过以一般认为的制药实施所要求的单位用量方式混和来进行制剂化。这些制剂中的有效成分量，是可得到所指示的范围的适当的用量那样的量。
用于注射的无菌组合物可以使用注射用蒸馏水这样的媒介物，按照通常的制剂实施来处方。
作为注射用的水溶液，可以列举例如，生理盐水、含有葡萄糖和/或其他辅助剂、例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钠的等渗液，也可以与适当的溶解助剂，例如醇，具体为乙醇、多元醇例如丙二醇、聚乙二醇、非离子性表面活性剂例如聚山梨醇酯80(TM)、HCO-60合并使用。
作为油性液可以列举芝麻油、大豆油，也可以与作为溶解助剂的苯甲酸苄酯、苄醇合并使用。另外，还可以与缓冲剂例如磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液、镇痛剂例如盐酸普鲁卡因、稳定剂例如苄醇、苯酚、抗氧化剂配合。制备的注射液通常填充到适当的安瓿中。
施与为经口或非经口，优选非经口施与，具体来说，可以列举注射剂型、经鼻施与剂型、经肺施与剂型、经皮施与型等。作为注射剂型的例子，可以通过例如，静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等全身或局部性地施与。
另外，可以根据患者的年龄、体重、性别、症状等选择适当的施与方法。作为含有抗体或编码抗体的多核苷酸的药物组合物的施与量，例如可以在一次每1kg体重为0.0001mg至1000mg的范围中选择。或者例如可以在每个患者0.001～100000mg/个体的范围中选择施与量，但未必限于这些数值。施与量、施与方法根据患者的体重、年龄、性别、症状等不同而变化，只要是本领域技术人员就可以适当选择。
通过将本发明的药物组合物施与受试者，可以治疗和/或预防胆囊癌。
进一步地，本发明还包含胆囊癌的治疗和/或预防方法，该方法包括以下步骤：将本发明的药物组合物与如上述所例示的抗肿瘤剂或包含抗肿瘤剂的药物组合物组合，合并使用施与受试者。本发明的抗体或其片段与抗肿瘤剂可以同时施与受试者，或者分别施与受试者。分别施与时，任一药物组合物可以在先也可以在后，它们的施与间隔、施与量、施与途径和施与次数可由专业医师适当选择。同时施与的其他药物剂型还包含例如将本发明的抗体或其片段与抗肿瘤剂在药理学上容许的担载体(或介质)中混合并进行制剂化而得的药物组合物。另外，对于含有抗肿瘤剂的上述药物组合物和剂型的任一者，可以适用对于含有本发明的抗体的药物组合物和剂型的处方、制剂化、施与途径、用量、癌等的说明。因此，本发明还提供包含本发明的药物组合物、和含如以上所例示的抗肿瘤剂的药物组合物的用于胆囊癌的治疗和/或预防的组合药物(也称为“药物试剂盒”)。
另外，本发明还提供包含本发明的抗体或其片段和抗肿瘤剂、以及药理学上容许的担载体的、用于胆囊癌的治疗和/或预防的药物组合物。
或者，抗肿瘤剂也可以缀合于本发明的抗体或其片段。该缀合与上述同样地，可以与药理学上容许的担载体(或介质)混合并制剂化而制成药物组合物。
实施例
以下基于实施例更具体地说明本发明，但本发明的范围不受这些具体例限制。
[实施例1]利用SEREX法的癌抗原蛋白质的鉴定
(1)cDNA文库的制作
通过酸胍-酚-氯仿法(Acid guanidium-Phenol-Chloroform法)从健常狗的精巢组织提取总RNA，并且使用Oligotex-dT30 mRNA纯化试剂盒(宝酒造社制)，按照试剂盒附带的说明书纯化多聚A RNA。
使用如此获得的mRNA(5μg)合成狗精巢cDNA噬菌体文库。在cDNA噬菌体文库的制作中，使用cDNA合成试剂盒、ZAP-cDNA合成试剂盒、ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning试剂盒(STRATAGENE社制)，按照试剂盒中附带说明书制作文库。制作的cDNA噬菌体文库的大小是7.73×105pfu/ml。
(2)利用血清的cDNA文库的筛选
使用上述制作的狗精巢cDNA噬菌体文库进行免疫筛选。具体地，感染宿主大肠杆菌(XL1-Blue MRF’)使得Φ90×15mm的NZY琼脂糖平板上形成2210个克隆，在42℃培养3～4小时，形成溶菌斑(噬斑)，用渗透了IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的硝酸纤维素膜(Hybond C Extra：GE Healthcare Bio-Scinece社制)在37℃覆盖该平板4小时，由此使蛋白质诱导、表达，在该膜上转印蛋白质。然后回收该膜，并浸入到含有0.5％脱脂奶粉的TBS(10mM Tris-HCl，150mM NaCl pH值7.5)中，在4℃振摇过夜，由此抑制非特异性反应。使该滤膜与稀释了500倍的患病狗血清在室温下反应2～3小时。
作为上述患病狗的血清，使用由患有乳癌的狗中收集的血清。这些血清在-80℃保存，在即将使用前进行前处理。血清的前处理方法利用以下的方法。即，使宿主大肠杆菌(XL1-Blure MRF’)感染没有插入外来基因的λZAP表达噬菌体后，在NZY平板培养基上于37℃培养过夜。接着在平板中加入含有0.5M NaCl的0.2M NaHCO3 pH值8.3的缓冲液，在4℃静置15小时后，将上清液作为大肠杆菌/噬菌体提取液回收。接着，使回收的大肠杆菌/噬菌体提取液流经NHS-柱(GE Healthcare Bio-Science社制)，将源于大肠杆菌·噬菌体的蛋白质固定化。使患病狗的血清流经固定了该蛋白质的柱进行反应，将吸附在大肠杆菌和噬菌体上的抗体从血清中除去。将直接流过该柱的血清级分用含有0.5％脱脂奶粉的TBS稀释500倍。将所得物作为免疫筛选材料。
将该处理血清和印迹了上述融合蛋白的膜用TBS-T(0.05％Tween20/TBS)洗涤4次，然后与作为二抗的已经用含有0.5％脱脂奶粉的TBS稀释5000倍的山羊抗狗IgG(Goat anti Dog IgG-h+I HRP conjugated：BETHYL Laboratories社制)在室温反应1小时，通过使用了NBT/BCIP反应液(Roche社制)的酶显色反应来检测，从Φ90x15mm的NZY琼脂糖平板上收集与显色反应阳性部位相对应的菌落，并将其溶解于500μl的SM缓冲液(100mM NaCl，10mM MgClSO4，50mM Tris-HCl，0.01％明胶，pH值7.5)中。以与上述同样的方法重复二次、三次筛选，直至显色反应阳性菌落单一化，从而筛选出30940个与血清中的IgG反应的噬菌体克隆，并分离了5个阳性克隆。
(3)分离的抗原基因的同源性检索
为了对通过上述方法分离的5个阳性克隆进行碱基序列分析，进行将噬菌体载体转换成质粒载体的操作。具体地，将宿主大肠杆菌(XL1-Blue MRF’)调制成吸光度OD600为1.0的溶液，将该溶液200μl与250μl纯化的噬菌体溶液、以及1μl ExAssist辅助噬菌体(STRATAGENE社制)混合，随后在37℃反应15分钟，然后添加3ml LB培养基，在37℃培养2.5～3小时，立即用70℃的水浴保温20分钟，然后进行4℃、1000×g、15分钟的离心分离，收集上清液作为噬菌粒溶液。随后，将噬菌粒宿主大肠杆菌(SOLR)调制成吸光度OD600为1.0的溶液，将该溶液200μl与10μl纯化的噬菌体溶液混合，随后在37℃反应15分钟。将50μl接种于含有氨苄青霉素(终浓度：50μg/ml)的LB琼脂培养基，并且在37℃培养过夜。收集转化的SOLR单菌落，在含有氨苄青霉素(终浓度：50μg/ml)的LB培养基中在37℃培养后，使用QIAGEN plasmid Miniprep Kit(キアゲン社制)纯化具有目的插入物的质粒DNA。
使用序列号31记载的T3引物和序列号32记载的T7引物，通过引物步移法，对纯化的质粒进行插入物全长序列的分析。通过该序列分析，获得了序列号5、7、9、11、13所记载的基因序列。使用该基因的碱基序列和氨基酸序列(序列号6、8、10、12、14)来进行同源性检索程序BLAST检索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，从而进行与已知基因的同源性检索，结果判明获得的5个基因均是编码CAPRIN-1蛋白质的基因。就被翻译为蛋白质的区域而言，这五个基因之间的序列同一性为：100％的碱基序列同一性、99％的氨基酸序列同一性。就被翻译为蛋白质的区域而言，与编码该基因的人同源因子的基因的序列同一性为：94％的碱基序列同一性、98％的氨基酸序列同一性。人同源因子的碱基序列示于序列号1、3，氨基酸序列示于序列号2、4。此外，就被翻译为蛋白质的区域而言，与编码所获得的狗基因的牛同源因子的基因的序列同一性为：94％的碱基序列同一性、97％的氨基酸序列同一性。牛同源因子的碱基序列示于序列号15，氨基酸序列显示于序列号16。另外，就被翻译为蛋白质的区域而言，编码人同源因子的基因与编码牛同源因子的基因之间的序列同一性为：94％的碱基序列同一性、93％～97％的氨基酸序列同一性。此外，就被翻译为蛋白质的区域而言，与编码所获得的狗基因的马同源因子的基因的序列同一性为：93％的碱基序列同一性、97％的氨基酸序列同一性。马同源因子的碱基序列示于序列号17，氨基酸序列示于序列号18。另外，就被翻译为蛋白质的区域而言，编码人同源因子的基因与编码马同源因子的基因之间的序列同一性为：93％的碱基序列同一性、96％的氨基酸序列同一性。此外，就被翻译为蛋白质的区域而言，与编码所获得的狗基因的小鼠同源因子的基因的序列同一性为：87％～89％的碱基序列同一性、95％～97％的氨基酸序列同一性。小鼠同源因子的碱基序列示于序列号19、21、23、25、27，氨基酸序列示于序列号20、22、24、26、28。另外，就被翻译为蛋白质的区域而言，编码人同源因子的基因与编码小鼠同源因子的基因之间的序列同一性为：89％～91％的碱基序列同一性、95％～96％的氨基酸序列同一性。此外，就被翻译为蛋白质的区域而言，与编码所获得的狗基因的鸡同源因子的基因的序列同一性为：82％的碱基序列同一性、87％的氨基酸序列同一性。鸡同源因子的碱基序列示于序列号29，氨基酸序列示于序列号30。另外，就被翻译为蛋白质的区域而言，编码人同源因子的基因与编码鸡同源因子的基因之间的序列同一性为：81％～82％的核苷酸序列同一性、86％的氨基酸序列同一性。
(4)人胆囊癌细胞的CAPRIN-1基因表达分析
对由上述方法得到的基因，利用RT-PCR法研究在人的胆囊癌细胞株TGBC14TKB(从独立行政法人理化学研究所获得)中的表达。逆转录反应如下进行。即，使用TRIZOL试剂(invitrogen社制)并按照附带的说明书从各组织50～100mg和各细胞株5～10×106个细胞中提取总RNA。使用该总RNA，利用Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(invitrogen社制)按照附带的说明书合成cDNA。PCR反应使用获得的基因特异性引物(在序列号33和34中记载)如下进行。即，以使通过逆转录反应制备的样品为0.25μl，上述引物为各2μM，各dNTP为0.2mM、ExTaq聚合酶(宝酒造社制)为0.65U的方式添加各试剂和附带的缓冲液，调节至总量25μl，使用热循环仪(BIO RAD社制)，将94℃-30秒、60℃-30秒、72℃-30秒的循环重复30次。此外，上述基因特异性引物是扩增序列号1的碱基序列(人CAPRIN-1基因)中的第698～1124位碱基的区域的引物。为了进行比较对照，同时使用GAPDH特异性引物(在序列号35和36中记载)。其结果在本细胞株TGBC14TKB中确认了表达。
[实施例2]抗人CAPRIN-1多克隆抗体的制作
将按照WO2010/016526的实施例3制作的人CAPRIN-1重组蛋白质1mg与等体积的弗氏不完全佐剂(IFA)溶液混合，将其每2周在兔的皮下施与，施与4次。然后采取血液，得到包含各多克隆抗体的抗血清。进一步将这些抗血清使用蛋白G担载体(GEヘルスケアバイオサイエンス社制)进行纯化，得到抗CAPRIN-1多克隆抗体。另外，将未施与抗原的兔的血清与上述同样地使用蛋白G担载体进行纯化而得的作为对照抗体。
[实施例3]人胆囊癌的CAPRIN-1蛋白质的表达分析
(1)人胆囊癌细胞上的CAPRIN-1蛋白质的表达分析
对于确认了CAPRIN-1基因表达的人胆囊癌细胞株TGBC14TKB，检查其细胞表面上是否表达CAPRIN-1蛋白质。在1.5ml的微量离心管中离心分离在上述确认了基因表达的TGBC14TKB 106细胞。在其中添加实施例2中制备的抗CAPRIN-1多克隆抗体2μg(5μl)，进一步用含95μl的0.1％胎牛血清的PBS悬浮后，在冰上静置1小时。用PBS洗涤后，用5μl的FITC标记山羊抗兔IgG抗体(サンタクルズ社制)和95μl的含0.1％胎牛血清(FBS)的PBS悬浮，在冰上静置1小时。用PBS洗涤后，用ベクトンディッキンソン株式会社的FACSCalibur测定荧光强度。另一方面，使用实施例2所制备的对照抗体代替抗CAPRIN-1多克隆抗体进行与上述同样的操作，作为对照。其结果确认了，添加了抗人CAPRIN-1多克隆抗体的TGBC14TKB与对照相比，荧光强度均强20％以上。由此确认，CAPRIN-1蛋白质在上述人胆囊癌细胞株的细胞膜表面上表达。此外，上述荧光强度的增强率用各细胞中的平均荧光强度(MFI值)的增加率表示，通过以下的计算式计算出。
平均荧光强度的增加率(荧光强度的增强率)(％)＝((与抗人CAPRIN-1抗体反应的细胞的MFI值)-(对照MFI值))÷(对照MFI值)×100。
(2)人胆囊癌组织中的CAPRIN-1蛋白质的表达分析
使用石蜡包埋的人胆囊癌组织阵列(BIOMAX社制)的26个胆囊癌组织样本进行免疫组织化学染色。将人胆囊癌组织阵列在60℃处理3小时后，放入装满了二甲苯的染色瓶中，将每隔5分钟替换二甲苯的操作进行3次。接着用乙醇和PBS-T代替二甲苯进行同样的操作。在装满了含有0.05％Tween20的10mM柠檬酸缓冲液(pH值6.0)的染色瓶中加入人胆囊癌组织阵列，在125℃处理5分钟后，在室温下静置40分钟以上。将切片周围的多余水分用Kimwipes擦去，用DAKOPEN包围，适量滴加Peroxidase Block(DAKO社制)。在室温下静置5分钟后，加入到装满了PBS-T的染色瓶中，将每隔5分钟替换PBS-T的操作进行3次。作为封闭液，加入含有10％FBS的PBS-T溶液，在保湿室内、在室温下静置1小时。加入将实施例2中制备的抗CAPRIN-1多克隆抗体用含5％FBS的PBS-T溶液调制成10μg/ml而得的溶液，在保湿室内、在4℃静置过夜，用PBS-T洗涤3次，每次10分钟后，滴加适量的Peroxidase Labelled Polymer Conjugated(DAKO社制)，在保湿室内、在室温下静置30分钟。利用PBS-T洗涤3次每次10分钟后，加入DAB显色液(DAKO社制)，在室温下静置10分钟左右后，丢弃显色液，用PBS-T洗涤3次每次10分钟后，用蒸馏水冲洗，每隔1分钟依次加入到70％、80％、90％、95％、100％的各乙醇溶液中，然后在二甲苯中静置过夜。取出载玻片，用Glycergel Mounting Medium(DAKO社制)封片后，进行观察。其结果是，CAPRIN-1蛋白质在全部26个胆囊癌组织样本的内的19个样本(73％)中确认了强表达。
[实施例4]抗CAPRIN-1多克隆抗体对胆囊癌细胞的抗肿瘤效果(ADCC活性)
研究抗CAPRIN-1抗体能否毒害表达CAPRIN-1蛋白质的胆囊癌细胞。使用实施例2中获得的抗人CAPRIN-1多克隆抗体进行评价。将确认了CAPRIN-1蛋白质表达的人胆囊癌细胞TGBC14TKB 106个收集在50ml容量的离心管中，加入100μCi的铬51，在37℃孵育2小时。然后用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基洗涤3次，在96孔V底板的每1孔中分别添加103个。在其中添加上述抗人CAPRIN-1多克隆抗体1μg，进一步分别添加从人的末梢血分离出的淋巴细胞各2×105个，在37℃、5％CO2的条件下培养4小时。培养后，测定从受到毒害的肿瘤细胞中释放的培养上清中的铬(Cr)51的量，计算出抗人CAPRIN-1多克隆抗体对胆囊癌细胞的ADCC活性。其结果是，在使用从未免疫抗原的兔的末梢血制备的对照抗体进行同样的操作的情况下，对TGBC14TKB小于5％，在未添加抗体的情况下也小于5％，与此相对，在加入了抗人CAPRIN-1多克隆抗体的情况下，确认了14％以上的ADCC活性。因此，明确了通过使用了抗CAPRIN-1抗体的ADCC活性，可以毒害表达CAPRIN-1蛋白质的胆囊癌细胞。此外，细胞毒活性如上所述，是显示将本发明中使用的抗CAPRIN-1抗体、淋巴细胞和摄入了铬51的103个肿瘤细胞混合并培养4小时，测定培养后释放到培养基中的铬51的量，通过以下计算式*算出的对肿瘤细胞的细胞毒活性的结果。
*式：细胞毒活性(％)＝从加入了抗CAPRIN-1抗体和淋巴细胞时的肿瘤细胞游离的铬51游离量÷从加入了1N盐酸的肿瘤细胞游离的铬51游离量×100。
[实施例5]抗CAPRIN-1小鼠和鸡单克隆抗体的制作
将实施例2中制作的人CAPRIN-1重组蛋白质100μg与等量的MPL+TDM佐剂(シグマ社制)混合，将所得的混合物作为每1只小鼠的抗原溶液。将抗原溶液施与至6周龄的Balb/cc小鼠(日本SLC社制)的腹腔内后，每1周施与，进一步施与3次和24次，从而完成免疫。将从最后的免疫起3天后摘出的各个脾脏夹在灭菌后的2片载玻片中磨碎，将使用PBS(-)(日水社制)洗涤、以1500转/分钟离心10分钟并除去上清的操作重复3次，从而得到脾脏细胞。将所得的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(从ATCC购入)以10:1的比率混和，在其中加入加温至37℃的将包含10％FBS的RPMI1640培养基200μl和PEG1500(ベーリンガー社制)800μl混合而制备的PEG溶液，并静置5分钟，从而进行细胞融合。以1700转/分钟离心5分钟，除去上清，然后用加入了2％当量的Gibco社制的HAT溶液的含15％FBS的RPMI1640培养基(HAT选择培养基)150ml悬浮细胞，以96孔板(ヌンク社制)的每1孔各100μl接种于15块板中。以7天、37℃、5％CO2的条件培养，从而得到脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合而成的杂交瘤。
以由制作的杂交瘤所产生的抗体的对CAPRIN-1蛋白质的结合亲和性为指标筛选杂交瘤。将实施例2中制备的CAPRIN-1蛋白溶液1μg/ml在96孔板每1孔中添加100μl，在4℃静置18小时。将各孔用PBS-T洗涤3次后，在每1孔中添加0.5％牛血清白蛋白(BSA)溶液(シグマ社制)400μl，在室温静置3小时。除去溶液，对每1孔用400μl的PBS-T洗涤孔3次后，在每1孔中添加上述所得的杂交瘤的各培养上清100μl，在室温静置2小时。用PBS-T洗涤各孔3次后，在每1孔中添加用PBS稀释至5000倍的HRP标记抗小鼠IgG(H+L)抗体(life technologies社制)100μl，在室温静置1小时。用PBS-T洗涤孔3次后，在每1孔中添加TMB底物溶液(Thermo社制)100μl，并静置15～30分钟，从而进行显色反应。显色后，在每1孔中添加1N硫酸100μl使反应停止，使用吸光度计测定450nm和595nm的吸光度值。其结果是，筛选出了多个产生吸光度值高的抗体的杂交瘤。
将筛选出的杂交瘤以96孔板每1孔0.5个的方式添加到板中进行培养。1周后，观察到在孔中形成单个集落的杂交瘤。将这些孔的细胞进行进一步培养，以由克隆化的杂交瘤产生的抗体对CAPRIN-1蛋白质的结合亲和性为指标筛选杂交瘤。将实施例2中制备的CAPRIN-1蛋白质溶液1μg/ml在96孔板的每1孔中添加100μl，在4℃静置18小时。用PBS-T洗涤各孔3次后，在每1孔中添加0.5％BSA溶液400μl，并在室温静置3小时。除去溶液，对每1孔用400μl的PBS-T洗涤孔3次后，在每1孔中添加上述所得的杂交瘤的各培养上清100μl，在室温静置2小时。用PBS-T洗涤各孔3次后，在每1孔中添加用PBS稀释至5000倍的HRP标记抗小鼠IgG(H+L)抗体(life technologies社制)100μl并在室温静置1小时。用PBS-T洗涤孔3次后，在每1孔中添加TMB底物溶液(Thermo社制)100μl，并静置15～30分钟，从而显色反应。显色后，在每1孔中添加1N硫酸100μl使反应停止，使用吸光度计测定450nm和595nm的吸光度值。其结果是，得到了150个产生对CAPRIN-1蛋白质显示反应性的小鼠单克隆抗体的杂交瘤株。
接着在这些小鼠单克隆抗体中，筛选对表达CAPRIN-1蛋白质的癌细胞的细胞表面显示反应性的单克隆抗体。具体地，在1.5ml容量的微量离心管中离心分离106个人乳癌细胞株MDA-MB-231V，在其中添加上述各杂交瘤的培养上清100μl，在冰上静置1小时。用PBS洗涤后，添加用含0.1％FBS的PBS稀释了500倍的FITC标记山羊抗小鼠IgG抗体(life technologies社制)，在冰上静置1小时。用PBS洗涤后，用ベクトンディッキンソン株式会社的FACSCalibur测定荧光强度。另一方面，使用以杂交瘤培养用培养基稀释了500倍的未经过任何处理6周龄的Balb/c小鼠的血清代替抗体进行与上述同样的操作，作为对照。其结果是，筛选出了22个与对照相比荧光强度强、即与乳癌细胞的细胞表面反应的小鼠单克隆抗体(小鼠单克隆抗体#1～#22)。
另外，为了制作鸡单克隆抗体，将实施例2中制备的序列号2所示抗原蛋白(人CAPRIN-1蛋白质)300μg与等量的弗氏完全佐剂混合，将该混合物作为1只鸡的抗原溶液。将抗原溶液施与7周龄的鸡的腹腔内，每4周施与，施与7次，从而完成免疫。从最后免疫起4天后分别取出脾脏，然后将其在两片无菌的载玻片之间磨碎，将用PBS(-)(日水社制)洗涤并以1500转/分钟离心10分钟移除上清液的操作重复3次，获得脾脏细胞。将获得的脾脏细胞与使用鸟类网状内皮组织增殖病病毒通过转化法由鸡建立的缺少轻链的鸡骨髓瘤细胞以5:1的比例混合，向其中添加加温至37℃的将含有10％FBS的IMDM培养基200μl与PEG1500(ベーリンガー社制)800μl混合而制得的PEG溶液，静置5分钟以进行细胞融合。以1700转/分钟离心5分钟，除去上清液后，将细胞用300ml添加了2％当量的Gibco社制的HAT溶液的含有10％FBS的IMDM培养基(HAT选择培养基)悬浮，并且以每孔各100μl接种于30块96孔板(Nunc社制)中。在37℃、5％CO2的条件下培养7天，获得由脾脏细胞与鸡骨髓瘤细胞的融合而产生的杂交瘤。
以由制备的杂交瘤产生的抗体对CAPRIN-1蛋白质的结合亲和力作为指标来筛选杂交瘤。将实施例2中制备的CAPRIN-1蛋白质溶液(1μg/ml)以每孔100μl的量添加至96孔板，在4℃静置18小时。将各孔用PBS-T洗涤3次后，以每孔400μl的量添加0.5％牛血清白蛋白(BSA)溶液(SIGMA社制)，在室温静置3小时。移除溶液，用每孔400μl的PBS-T洗涤各孔3次后，以每孔100μl的量添加上述获得的杂交瘤的各培养上清液，在室温静置2小时。用PBS-T洗涤各孔3次，然后以每孔100μl的量添加用PBS稀释5000倍的HRP标记抗鸡IgY抗体(SIGMA社制)，并且在室温静置1小时。用PBS-T洗涤孔3次后，以每孔100μl的量添加TMB底物溶液(Thermo社制)，并且静置15～30分钟，进行显色反应。在显色后，以每孔100μl的量添加1N硫酸以终止反应，使用吸光度计测定在450nm的吸光度值和在595nm的吸光度值。其结果是，选出了多个产生吸光度值高的抗体的杂交瘤。
将选出的杂交瘤以每孔0.5个的量添加至96孔板并培养。1周后，观察到在孔中形成单个集落杂交瘤。进一步培养这些孔中的细胞，以由克隆的杂交瘤产生的抗体对CAPRIN-1蛋白质的结合亲和力作为指标，选择杂交瘤。将人CAPRIN-1蛋白质溶液1μg/ml以每孔100μl的量添加至96孔板，并在4℃静置18小时。将各孔用PBS-T洗涤3次，然后以每孔400μl的量添加0.5％BSA溶液，并在室温静置3小时。移除溶液，用每孔400μl的PBS-T洗涤孔3次后，以每孔100μl的量添加上述获得的杂交瘤的各培养上清液，并在室温静置2小时。用PBS-T洗涤各孔3次后，以每孔100μl的量添加用PBS稀释5000倍的HRP标记抗鸡IgY抗体(SIGMA社制)，并且在室温静置1小时。用PBS-T洗涤孔3次后，以每孔100μl的量添加TMB底物溶液(Thermo社制)，并且静置15～30分钟，进行显色反应。在显色后，以每孔100μl的量添加1N硫酸以终止反应，使用吸光度计测定450nm和595nm的吸光度值。其结果是，获得了多个产生与CAPRIN-1蛋白显示反应性的单克隆抗体的杂交瘤株。
接下来，在这些单克隆抗体当中选出与表达CAPRIN-1蛋白质的癌细胞的细胞表面显示反应性的单克隆抗体。具体地，在1.5ml容量的微量离心管中离心分离5×105个人乳癌细胞株MDA-MB-231V，向其中添加上述各杂交瘤的培养上清液100μl，在冰上静置1小时。在用PBS洗涤后，添加用含有0.1％FBS的PBS稀释30倍的FITC标记山羊抗鸡IgG(H+L)抗体(SouthernBiotech社制)，并在冰上静置1小时。在用PBS洗涤后，使用ベクトンディッキンソン株式会社的FACSCalibur测定荧光强度。另一方面，使用杂交瘤培养用培养基进行与上述同样的操作，制备对照的样品。其结果是，选出了3个与对照相比荧光强度强、即与表达CAPRIN-1蛋白质的乳癌细胞的细胞表面反应的单克隆抗体(鸡单克隆抗体#1、#2、#3)。
[实施例6]筛选出的抗体的所具有的特征
(1)抗CAPRIN-1单克隆抗体的可变区基因的克隆
从分别产生实施例5所筛选出的22个小鼠单克隆抗体以及3个鸡单克隆抗体的各杂交瘤株中提取mRNA，对于产生小鼠单克隆抗体的杂交瘤使用对来源于小鼠FR1的序列和来源于小鼠FR4的序列为特异性的引物，对于产生鸡单克隆抗体的杂交瘤使用对来源于鸡FR1的序列和来源于鸡FR4的序列为特异性的引物，通过RT-PCR法，获得全部抗CAPRIN-1单克隆抗体的重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区的基因。为了确定序列，将这些基因克隆到pCR2.1载体(life technologies社制)中。
(1)-1 RT-PCR
从106个产生小鼠单克隆抗体的各杂交瘤株中，使用mRNA micro purification kit(GEヘルスケア社制)制备mRNA，使用SuperScriptII 1st strand synthesis kit(life technologies社制)，将所得的mRNA逆转录而合成cDNA。这些操作按照各试剂盒的附带方案进行。使用所得的cDNA，通过PCR法进行抗体基因的扩增。为了获得VH区的基因，使用对小鼠重链FR1序列为特异性的引物(序列号257)和对小鼠重链FR4序列为特异性的引物(序列号258)。另外为了获得VL区的基因，使用对小鼠轻链FR1序列为特异性的引物(序列号259)和对小鼠轻链FR4为特异性的引物(序列号260)。这些引物参考Jones，S.T.and Bending，M.M.Bio/Technology9，88-89(1991)来设计。PCR使用Ex-taq(タカラバイオ社制)。在10×EX Taq Buffer 5μl、dNTP Mixture(2.5mM)4μl、引物(1.0μM)各2μl、Ex Taq(5U/μl)0.25μl中加入cDNA样品，用灭菌水制成总量50μl。在94℃处理2分钟后，以变性94℃1分钟、退火58℃30秒、延伸反应72℃1分钟的组合30个循环的条件进行。
另外，从106个产生鸡单克隆抗体的各杂交瘤株中，使用High Pure RNA Isolation Kit(Roche社制)提取总RNA后，使用PrimeScriptII 1st strand cDNA Synthesis Kit(Takara社制)合成cDNA。这些操作按照各试剂盒所附带的方案来进行。以合成的cDNA作为模板，使用KOD-Plus-DNA聚合酶(TOYOBO社制)，按照常规方法利用PCR法分别扩增鸡抗体重链基因可变区和鸡抗体轻链基因可变区。为了获得鸡抗体的VH区的基因，使用对鸡重链FR1序列为特异性的引物和对鸡重链FR4序列为特异性的引物。另外为了获得VL区的基因，使用对鸡轻链FR1序列为特异性的引物和对鸡轻链FR4为特异性的引物。
(1)-2克隆
使用上述得到的各PCR产物，利用琼脂糖凝胶进行电泳，切出VH区和VL区各自的DNA带。DNA片段使用QIAquick Gel purification kit(キアゲン社制)并按照附带方案来进行。纯化的各DNA使用TA克隆试剂盒(life technologies社制)克隆到pCR2.1载体中。将连接的载体按照常规方法转化到DH5感受态细胞(TOYOBO社制)中。将各个转化体的各10个克隆在培养基(100μg/ml氨苄青霉素)中、在37℃培养过夜后，将各质粒DNA使用Qiaspin Miniprep kit(キアゲン社制)进行纯化。
(1)-3序列决定
上述得到的各质粒中的VH区和VL区的基因序列分析，使用M13正向引物(序列号261)和M13反向引物(序列号262)，利用荧光测序仪(ABI社制DNA测序仪3130XL)，使用ABI社制的BigDye Terminator Ver3.1循环测序试剂盒，按照其附带方案来进行。其结果确定了各基因序列和氨基酸序列。
即，这些单克隆抗体包含具有序列号40(序列号45)、序列号50(序列号55)、序列号60(序列号65)、序列号70(序列号75)、序列号80(序列号85)、序列号90(序列号95)、序列号100(序列号105)、序列号110(序列号115)、序列号120(序列号125)、序列号130(序列号131)、序列号135(序列号140)、序列号145(序列号150)、序列号160(序列号165)、序列号170(序列号175)、序列号200(序列号205)、序列号210(序列号215)、序列号220(序列号225)、序列号230(序列号235)、序列号240(序列号245)或序列号250(序列号255)的氨基酸序列的重链可变(VH)区(括号内为基因序列的序列号)、和具有序列号44(序列号46)、序列号54(序列号56)、序列号64(序列号66)、序列号74(序列号76)、序列号84(序列号86)、序列号94(序列号96)、序列号104(序列号106)、序列号114(序列号116)、序列号124(序列号126)、序列号139(序列号141)、序列号149(序列号151)、序列号155(序列号156)、序列号164(序列号166)、序列号174(序列号176)、序列号180(序列号181)、序列号185(序列号186)、序列号190(序列号191)、序列号195(序列号196)、序列号204(序列号206)、序列号214(序列号216)、序列号224(序列号226)、序列号234(序列号236)、序列号244(序列号246)或序列号254(序列号256)的氨基酸序列的轻链可变(VL)区(括号内为基因序列的序列号)，这里，该VH区包含序列号37、序列号47、序列号57、序列号67、序列号77、序列号87、序列号97、序列号107、序列号117、序列号127、序列号132、序列号142、序列号157、序列号167、序列号197、序列号207、序列号217、序列号227、序列号237或序列号247的氨基酸序列所示的CDR1、序列号38、序列号48、序列号58、序列号68、序列号78、序列号88、序列号98、序列号108、序列号118、序列号128、序列号133、序列号143、序列号158、序列号168、序列号198、序列号208、序列号218、序列号228、序列号238或序列号248的氨基酸序列所示的CDR2和序列号39、序列号49、序列号59、序列号69、序列号79、序列号89、序列号99、序列号109、序列号119、序列号129、序列号134、序列号144、序列号159、序列号169、序列号199、序列号209、序列号219、序列号229、序列号239或序列号249的氨基酸序列所示的CDR3，该VL区包含序列号41、序列号51、序列号61、序列号71、序列号81、序列号91、序列号101、序列号111、序列号121、序列号136、序列号146、序列号152、序列号161、序列号171、序列号177、序列号182、序列号187、序列号192、序列号201、序列号211、序列号221、序列号231、序列号241或序列号251的氨基酸序列所示的CDR1、序列号42、序列号52、序列号62、序列号72、序列号82、序列号92、序列号102、序列号112、序列号122、序列号137、序列号147、序列号153、序列号162、序列号172、序列号178、序列号183、序列号188、序列号193、序列号202、序列号212、序列号222、序列号232、序列号242或序列号252的氨基酸序列所示的CDR2和序列号43、序列号53、序列号63、序列号73、序列号83、序列号93、序列号103、序列号113、序列号123、序列号138、序列号148、序列号154、序列号163、序列号173、序列号179、序列号184、序列号189、序列号194、序列号203、序列号213、序列号223、序列号233、序列号243或序列号253的氨基酸序列所示的CDR3。
所得的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列示于序列号40、序列号50、序列号60、序列号70、序列号80、序列号90、序列号100、序列号110、序列号120、序列号130、序列号135、序列号145、序列号160、序列号170、序列号200、序列号210、序列号220、序列号230、序列号240和序列号250，轻链可变区的氨基酸序列示于序列号44、序列号54、序列号64、序列号74、序列号84、序列号94、序列号104、序列号114、序列号124、序列号139、序列号149、序列号155、序列号164、序列号174、序列号180、序列号185、序列号190、序列号195、序列号204、序列号214、序列号224、序列号234、序列号244和序列号254。
即小鼠单克隆抗体#1包含序列号70的重链可变区和序列号74的轻链可变区，#2包含序列号80的重链可变区和序列号84的轻链可变区，#3包含序列号90的重链可变区和序列号94的轻链可变区，#4包含序列号100的重链可变区和序列号104的轻链可变区，#5包含序列号110的重链可变区和序列号114的轻链可变区，#6包含序列号120的重链可变区和序列号124的轻链可变区，#7包含序列号130的重链可变区和序列号124的轻链可变区，#8包含序列号135的重链可变区和序列号139的轻链可变区，#9包含序列号145的重链可变区和序列号149的轻链可变区，#10包含序列号145的重链可变区和序列号155的轻链可变区，#11包含序列号160的重链可变区和序列号164的轻链可变区，#12包含序列号170的重链可变区和序列号174的轻链可变区，#13包含序列号170的重链可变区和序列号180的轻链可变区，#14包含序列号170的重链可变区和序列号185的轻链可变区，#15包含序列号170的重链可变区和序列号190的轻链可变区，#16包含序列号170的重链可变区和序列号195的轻链可变区，#17包含序列号200的重链可变区和序列号204的轻链可变区，#18包含序列号210的重链可变区和序列号214的轻链可变区，#19包含序列号220的重链可变区和序列号224的轻链可变区，#20包含序列号230的重链可变区和序列号234的轻链可变区，#21包含序列号240的重链可变区和序列号244的轻链可变区，#22包含序列号250的重链可变区和序列号254的轻链可变区。
所得的鸡单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列示于序列号40、序列号50、序列号60，轻链可变区的氨基酸序列示于序列号44、序列号54、序列号64。
即，鸡单克隆抗体#1包含序列号40的重链可变区和序列号44的轻链可变区，其中，重链可变区中的CDR1～3分别由序列号37、序列号38、序列号39的氨基酸序列组成，轻链可变区中的CDR1～3分别由序列号41、序列号42、序列号43的氨基酸序列组成，鸡单克隆抗体#2包含序列号50的重链可变区和序列号54的轻链可变区，其中，重链可变区中的CDR1～3分别由序列号47、序列号48、序列号49的氨基酸序列组成，轻链可变区中的CDR1～3分别由序列号51、序列号52、序列号53的氨基酸序列组成，鸡单克隆抗体#3包含序列号60的重链可变区和序列号64的轻链可变区，其中，重链可变区中的CDR1～3分别由序列号57、序列号58、序列号59的氨基酸序列组成，轻链可变区中的CDR1～3分别由序列号61、序列号62、序列号63的氨基酸序列组成。
(2)人-鸡嵌合重组抗体和小鼠-鸡嵌合抗体的制作
将上述(1)中得到的、序列号40所示的鸡单克隆抗体#1的重链可变区的基因扩增片段的两端进行限制性酶处理后，进行纯化，按照常规方法插入到已经插入了包含序列号263的来源于鸡抗体的前导序列和包含序列号264的人IgG1的H链恒定区的pcDNA4/myc-His(life technologies社制)载体中。另外，将序列号44所示的鸡单克隆抗体#1的轻链可变区的基因扩增片段的两端进行限制性酶处理后，进行纯化，按照常规方法插入到已经插入了包含序列号263的来源于鸡抗体的前导序列和包含序列号265的人IgG1的L链恒定区的pcDNA3.1/myc-His(life technologies社制)载体中。
接着，将插入了序列号40所示的鸡单克隆抗体#1的重链可变区的上述重组载体、和插入了序列号44所示的鸡单克隆抗体#1的轻链可变区的上述重组载体导入到CHO-K1细胞(由理研セルバンク获得)中。具体地，将在12孔培养板的每1孔中用1ml含有10％FBS的Ham’sF12培养基(life technologies社制)培养的2×105个CHO-K1细胞用PBS(-)洗涤后，以每孔1ml的量重新加入含有10％FBS的Ham’sF12培养基，在加入后的孔中添加将溶解在30μl的OptiMEM(life technologies社制)中的上述各载体250ng与Polyfect transfection reagent(QIAGEN社制)30μl混合而成的混合物。将导入了上述重组载体的CHO-K1细胞在添加了200μg/ml Zeocin(life technologies社制)和200μg/ml Geneticin(ロシュ社制)的含有10％FBS的Ham’sF12培养基中培养后，向96孔板中以每孔0.5个的方式接种导入了上述重组载体的CHO-K1细胞，制备稳定地产生具有鸡单克隆抗体#1的可变区的人-鸡嵌合抗体#1(#1)的细胞株。与上述方法同样地，对于鸡单克隆抗体#2以及#3也制备稳定地产生人-鸡嵌合抗体#2(#2)以及人-鸡嵌合抗体#3(#3)的细胞株。
将制备的细胞株使用150cm2烧瓶、以5×105个/ml使用不含血清的OptiCHO培养基(life technologies社制)30ml培养5天，得到包含#1、#2或#3的培养上清。
同样地，将序列号40所示的鸡单克隆抗体#1的重链可变区的基因扩增片段的两端进行限制性酶处理后，进行纯化，按照常规方法插入到已经插入了来源于鸡抗体的前导序列和小鼠IgG1的H链恒定区的pcDNA4/myc-His(life technologies社制)载体中。另外，将序列号44所示的鸡单克隆抗体#1的轻链可变区的基因扩增片段的两端进行限制性酶处理后，进行纯化，按照常规方法插入到已经插入了来源于鸡抗体的前导序列和小鼠IgG1的L链恒定区的pcDNA3.1/myc-His(life technologies社制)载体中。将它们与上述同样地导入CHO-K1细胞中而制作稳定地产生具有鸡单克隆抗体#1的可变区的小鼠-鸡嵌合抗体#1的细胞株。与上述方法同样地，对于鸡单克隆抗体#2以及#3也制作稳定地产生小鼠-鸡嵌合抗体#2(#2)以及小鼠-鸡嵌合抗体#3(#3)的细胞株。
将制备的细胞株使用150cm2烧瓶、以5×105个/ml使用不含血清的OptiCHO培养基(life technologies社制)30ml培养5天，得到包含小鼠-鸡嵌合抗体#1、小鼠-鸡嵌合抗体#2以及小鼠-鸡嵌合抗体#3的培养上清。
(3)使用了获得的单克隆抗体的胆囊癌细胞表面的CAPRIN-1蛋白质的表达
接着对于确认了CAPRIN-1基因表达的胆囊癌细胞株TGBC14TKB，检查CAPRIN-1蛋白质是否在其细胞表面上表达。在1.5ml容量的微量离心管中离心分离TGBC14TKB 106细胞。向其中添加包含实施例4中制作的与癌细胞表面反应的#1～#22的抗CAPRIN-1小鼠单克隆抗体以及上述(2)中制作的抗CAPRIN-1小鼠-鸡嵌合抗体#1、小鼠-鸡嵌合抗体#2、小鼠-鸡嵌合抗体#3的培养上清(100μl)，在冰上静置1小时。在用PBS洗涤后，用以包含0.1％FBS的PBS稀释了500倍的FITC标记山羊抗小鼠IgG抗体(life technologies社制)悬浮，在冰上静置1小时。在用PBS洗涤后，使用ベクトンディッキンソン株式会社的FACSCalibur测定荧光强度。另一方面，使用同种型对照抗体代替包含#1～#22的抗CAPRIN-1小鼠单克隆抗体以及小鼠-鸡嵌合抗体#1、小鼠-鸡嵌合抗体#2、小鼠-鸡嵌合抗体#3的培养上清进行与上述同样的操作，作为对照。其结果是，添加了#1～#22的单克隆抗体、小鼠-鸡嵌合抗体#1、小鼠-鸡嵌合抗体#2、小鼠-鸡嵌合抗体#3的细胞，与对照相比，荧光强度均强20％以上。如果列举具体例，则使用小鼠-鸡嵌合抗体#1的情况下，显示200％以上的荧光强度的增强。由此确认了，CAPRIN-1蛋白质在上述人胆囊癌细胞株的细胞膜表面上表达。此外，上述荧光强度的增强率用各细胞中的平均荧光强度(MFI值)的增加率表示，通过以下的计算式算出。
平均荧光强度的增加率(荧光强度的增强率)(％)＝((与抗人CAPRIN-1抗体反应的细胞的MFI值)-(对照MFI值))÷(对照MFI值)×100
(4)抗CAPRIN-1抗体对人胆囊癌细胞的抗肿瘤效果(ADCC活性)
使用上述所得的抗体中的、人-鸡嵌合抗体#1来评价对人胆囊癌细胞的细胞毒活性(ADCC活性)。将包含上述(2)中得到的人-鸡嵌合抗体#1的培养上清用Hitrap ProteinA SepharoseFF(GEヘルスケア社制)纯化，置换为PBS(-)，用0.22μm的过滤器(ミリポア社制)过滤后，作为活性测定用的抗体使用。将106个人胆囊癌细胞株TGBC14TKB收集到50ml容量的离心管中，加入100μCi的铬51，在37℃孵育2小时。然后用含有10％FBS的RPMI1640培养基洗涤3次，向96孔V底板中每孔添加各2×103个，作为靶细胞。在其中添加上述纯化抗体每1孔1.2μg。进而，从人末梢血淋巴细胞使用以下方法分离包含人NK细胞的细胞基团。即，使人末梢血单核细胞与FITC荧光色素标记的抗体(抗人CD3抗体、抗人CD20抗体、抗人CD19抗体、抗人CD11c抗体、抗HLA-DR抗体(ベクトンアンドディッキンソン社))反应，使用细胞分选仪(FACS Vantage SE(ベクトンアンドディッキンソン社))，分离包含不被上述抗体染色的NK细胞的细胞基团，或使用人NK细胞分离试剂盒(NK细胞分离试剂盒(ミルテニー社制))进行分离，从而得到。将所得的包含NK细胞的细胞在每1孔中添加2×105个，在37℃、5％、CO2的条件下培养4小时。培养后，测定从受到毒害的肿瘤细胞释放出的培养上清中的铬51的量，计算出抗CAPRIN-1抗体对胆囊癌细胞的ADCC活性。其结果是，对TGBC14TKB，与CAPRIN-1蛋白质自身反应但不与癌细胞的细胞表面反应的单克隆抗体以及未添加抗体时的细胞毒活性均小于5％，与此相对，人-鸡嵌合抗体#1分别得到了20％的细胞毒活性。此外，对于#1～#22的抗CAPRIN-1小鼠单克隆抗体、人-鸡嵌合抗体#2以及人-鸡嵌合抗体#3也与上述同样地检查了对TGBC14TKB的细胞毒活性，结果与CAPRIN-1蛋白质自身反应但不与癌细胞的细胞表面的单克隆抗体以及未添加抗体时的细胞毒活性小于5％，与此相对，#1～#22的抗CAPRIN-1小鼠单克隆抗体、人-鸡嵌合抗体#2以及人-鸡嵌合抗体#3发现了15％以上的细胞毒活性。由以上的结果显示，获得的抗CAPRIN-1单克隆抗体通过ADCC活性而毒害表达CAPRIN-1蛋白质的癌细胞。此外，细胞毒活性如上所述，是显示将本发明中使用的抗CAPRIN-1抗体、包含人NK细胞的细胞基团和摄入了铬51的2×103个肿瘤细胞混合而培养4小时，测定培养后释放到培养基中的铬51的量，通过以下计算式*算出的对肿瘤细胞的细胞毒活性的结果。
*式：细胞毒活性(％)＝从加入了抗CAPRIN-1抗体和包含人NK细胞的细胞基团时的肿瘤细胞游离的铬51游离量÷从加入了1N盐酸的肿瘤细胞游离的铬51游离量×100。
[实施例7]由与癌细胞的细胞表面反应的抗CAPRIN-1抗体所结合的CAPRIN-1蛋白质中的肽的鉴定
使用上述获得的、与癌细胞的细胞表面反应的#12～#22的抗CAPRIN-1单克隆抗体，进行由它们所识别的CAPRIN-1蛋白质中的部分序列的鉴定。
首先，在用PBS溶解为1μg/μl的浓度的重组CAPRIN-1蛋白质溶液100μl中添加DTT(Fluka社制)使得终浓度为10mM，在95℃使其反应5分钟反应，进行CAPRIN-1蛋白质内的二硫键的还原，接下来添加终浓度20mM的碘代乙酰胺(和光纯药社制)，在37℃、遮光条件下进行30分钟硫醇基的烷基化反应。在所得的还原烷基化CAPRIN-1蛋白质40μg中分别添加#12～#22的抗CAPRIN-1单克隆抗体50μg，混合到20mM磷酸缓冲液(pH7.0)1ml中，一边搅拌混合一边在4℃使其反应一夜。
接下来，添加胰蛋白酶(プロメガ社制)使得终浓度为0.2μg，在37℃使其反应1小时、2小时、4小时、12小时后，在预先用含1％BSA(シグマ社制)的PBS封闭、用PBS洗涤后的蛋白A-玻璃珠(GE社制)与1mM碳酸钙、NP-40缓冲液(20mM磷酸缓冲液(pH7.4)、5mM EDTA、150mM NaCl、1％NP-40)中混合，分别使其反应30分钟。
将反应液用25mM碳酸铵缓冲液(pH8.0)洗涤后，使用0.1％甲酸100μl使抗原抗体复合物溶出，对于溶出液使用Q-TOF Premier(Waters-MicroMass社制)进行LC-MS分析。分析按照仪器所附带的方案。
其结果作为#12～#22的抗CAPRIN-1单克隆抗体均识别的CAPRIN-1蛋白质的部分序列，鉴定了序列号273的多肽。进而作为由单克隆抗体#13～#16、#17～#19和#21所识别的、上述序列号273的多肽中的部分序列，鉴定了序列号274的肽，进而判定单克隆抗体#13～#16识别作为其部分序列肽的序列号275的肽。
另外，使用人-鸡嵌合单克隆抗体#1、人-鸡嵌合单克隆抗体#3、小鼠单克隆抗体#1、#2、#3、#4、#5、#6、#7、#8、#9、#10、#11，进行由它们所识别的CAPRIN-1蛋白质中的表位肽的鉴定。合成包含人CAPRIN-1蛋白质的氨基酸序列中的12～16个氨基酸的93个候选肽，分别用DMSO溶解成1mg/ml的浓度。
将各肽以30μg/ml的浓度溶解在0.1M碳酸钠缓冲液(pH9.6)中，在96孔板(Nunc社制、制品号：436006)的每1孔中添加各100μl，在4℃静置一夜。丢掉液体，在每1孔中添加10mM乙醇胺/0.1M碳酸钠缓冲液(PH值9.6)各200μl，在室温静置1小时后，丢掉液体，用包含0.5％Tween20的PBS(PBST)洗涤2次，制作固相化了各肽的板。
在该板中，在每1孔中添加包含人-鸡嵌合单克隆抗体#1(#1)、人-鸡嵌合单克隆抗体#3(#3)和小鼠单克隆抗体(#1、#2、#3、#4、#5、#6、#7、#8、#9、#10、#11)的细胞培养上清50μl，在室温振荡1小时后，除去液体，用PBST洗涤3次。接下来，在人-鸡嵌合单克隆抗体孔中添加将被HRP标记的抗人IgG(life technologies社制)抗体用PBST稀释3000～4000倍而得的2次抗体溶液50μl，在小鼠单克隆抗体中添加将被HRP标记的抗小鼠IgG(life technologies社制)抗体用PBST稀释3000～4000倍而得的2次抗体溶液50μl，然后除去液体，用PBST进行6次洗涤。
在每1孔中TMB底物溶液(Thermo社制)100μl，静置15～30分钟进行显色反应。显色后，在每1孔中添加1N硫酸100μl使反应停止，使用吸光度计测定450nm和595nm的吸光度值。其结果作为抗CAPRIN-1抗体的人-鸡嵌合单克隆抗体#1、抗体#1～#5的抗CAPRIN-1单克隆抗体均识别的CAPRIN-1的部分序列，鉴定了序列号266的多肽。进而，作为人-鸡嵌合单克隆抗体#1、小鼠单克隆抗体#3和#4所识别的、上述序列号266的多肽中的部分序列，鉴定了序列号267的肽，作为小鼠单克隆抗体#1、#2和#5所识别的、上述序列号266的多肽中的部分序列，鉴定了序列号268的肽。因此判断，序列号266的多肽包含作为抗CAPRIN-1抗体的人-鸡嵌合单克隆抗体#1、小鼠单克隆抗体#1、#2、#3、#4和#5的表位区域。另外，作为抗CAPRIN-1单克隆抗体#6、#7和#8均识别的CAPRIN-1蛋白质的部分序列，鉴定了包含序列号270的氨基酸序列的多肽。因此判断序列号270的多肽包含抗CAPRIN-1抗体#6、#7以及#8的表位区域。进而另外，作为抗CAPRIN-1单克隆抗体#9、#10和#11均识别的CAPRIN-1蛋白质的部分序列，鉴定了包含序列号272的氨基酸序列的多肽。因此判断序列号272的多肽包含抗CAPRIN-1抗体#9、#10以及#11的表位区域。进而另外，作为人-鸡嵌合单克隆抗体#3所识别的CAPRIN-1蛋白质的部分序列，鉴定了包含序列号269的氨基酸序列的多肽。因此判断序列号269的多肽包含人-鸡嵌合单克隆抗体#3的表位区域。
[实施例8]针对CAPRIN-1蛋白质的小鼠单克隆抗体#30、#34～36的制作
(1)小鼠抗CAPRIN-1单克隆抗体#30、#34～36的制作
将WO2010/016526的实施例3中制备的具有序列号2的氨基酸序列的人CAPRIN-1蛋白质100μg与等量的MPL+TDM佐剂(シグマ社制)混合，将所得的混合物作为每1只小鼠的抗原溶液。将抗原溶液施与至6周龄的Balb/cc小鼠(日本SLC社制)的腹腔内后，每1周施与，施与7次，从而完成免疫。将从最后的免疫起3天后摘出的各个脾脏夹在灭菌后的2片载玻片中磨碎，将使用PBS(-)(日水社制)洗涤、以1500转/分钟离心10分钟并除去上清的操作重复3次，从而得到脾脏细胞。将所得的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(从ATCC购入)以10:1的比率混和，在其中加入加温至37℃的将包含10％FBS的RPMI1640培养基200μl和PEG1500(ベーリンガー社制)800μl混合而制备的PEG溶液，并静置5分钟，从而进行细胞融合。以1700转/分钟离心5分钟，除去上清，然后用加入了2％当量的Gibco社制的HAT溶液的含15％FBS的RPMI1640培养基(HAT选择培养基)150ml悬浮细胞，以96孔板(ヌンク社制)的每1孔各100μl接种于15块板中。以7天、37℃、5％CO2的条件进行培养，从而得到脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合而成的杂交瘤。
以由制作的杂交瘤所产生的抗体的对CAPRIN-1蛋白质的结合亲和性为指标筛选杂交瘤。将用WO2010/016526的实施例3所记载的方法制备的CAPRIN-1蛋白溶液1μg/ml在96孔板每1孔中添加100μl，在4℃静置18小时。将各孔用PBS-T洗涤3次后，在每1孔中添加0.5％牛血清白蛋白(BSA)溶液(シグマ社制)400μl，在室温静置3小时。除去溶液，对每1孔用400μl的PBS-T洗涤孔3次后，在每1孔中添加上述所得的杂交瘤的各培养上清100μl，在室温静置2小时。用PBS-T洗涤各孔3次后，在每1孔中添加用PBS稀释5000倍的HRP标记抗小鼠IgG(H+L)抗体(life technologies社制)100μl，在室温静置1小时。用PBS-T洗涤孔3次后，在每1孔中添加TMB底物溶液(Thermo社制)100μl，并静置15～30分钟，从而进行显色反应。显色后，在每1孔中添加1N硫酸100μl使反应停止，使用吸光度计测定450nm和595nm的吸光度值。其结果是，筛选出了多个产生吸光度值高的抗体的杂交瘤。
将筛选出的杂交瘤以96孔板每1孔0.5个的方式添加到板中进行培养。1周后，观察到在孔中形成单个集落的杂交瘤。将这些孔的细胞进行进一步培养，以由克隆化的杂交瘤产生的抗体的对CAPRIN-1蛋白的结合亲和性为指标筛选杂交瘤。将用WO2010/016526的实施例3的方法制备的CAPRIN-1蛋白溶液1μg/ml在96孔板的每1孔中添加100μl，在4℃静置18小时。用PBS-T洗涤各孔3次后，在每1孔中添加0.5％BSA溶液400μl，并在室温静置3小时。除去溶液，对每1孔用400μl的PBS-T洗涤孔3次后，在每1孔中添加上述所得的杂交瘤的各培养上清100μl，在室温静置2小时。用PBS-T洗涤各孔3次后，在每1孔中添加用PBS稀释5000倍的HRP标记抗小鼠IgG(H+L)抗体(life technologies社制)100μl并在室温静置1小时。用PBS-T洗涤孔3次后，在每1孔中添加TMB底物溶液(Thermo社制)100μl，并静置15～30分钟，从而进行显色反应。显色后，在每1孔中添加1N硫酸100μl使反应停止，使用吸光度计测定450nm和595nm的吸光度值。其结果是，得到了多个产生对CAPRIN-1蛋白显示反应性的单克隆抗体的杂交瘤株。
接下来在这些单克隆抗体的中，筛选对表达CAPRIN-1的乳癌细胞的细胞表面显示反应性的单克隆抗体。具体地，在1.5ml容量的微量离心管中离心分离106个人乳癌细胞株MDA-MB-231V，在其中添加上述各杂交瘤的培养上清100μl，在冰上静置1小时。用PBS洗涤后，添加用含0.1％FBS的PBS稀释了500倍的FITC标记山羊抗小鼠IgG抗体(life technologies社制)，在冰上静置1小时。用PBS洗涤后，用ベクトンディッキンソン株式会社的FACSCalibur测定荧光强度。另一方面，以用杂交瘤培养用培养基稀释了500倍的未经过任何处理6周龄的Balb/c小鼠的血清代替抗体进行与上述同样的操作，作为对照。其结果是，筛选出了与对照相比荧光强度强、即与乳癌细胞的细胞表面反应的单克隆抗体4个(小鼠抗CAPRIN-1抗体#30、#34～36)。
(2)各小鼠抗CAPRIN-1单克隆抗体所识别的CAPRIN-1表位的鉴定
进行获得的4个单克隆抗体分别识别的CAPRIN-1表位区域的鉴定。合成包含人CAPRIN-1蛋白质的氨基酸序列中的12～16个氨基酸的93个候选肽，分别用DMSO溶解成1mg/ml的浓度。
将各肽在0.1M碳酸钠缓冲液(pH9.6)中溶解至30μg/ml的浓度，在96孔板(Nunc社制、制品号：436006)的每1孔中各添加100μl并在4℃静置一夜。丢弃液体，将10mM乙醇胺/0.1M碳酸钠缓冲液(PH9.6)在每1孔中各添加200μl，在室温静置1小时后，丢弃液体，用含0.5％Tween20的PBS(PBST)洗涤2次，从而制作固相化了各肽的板。
在其中将含抗CAPRIN-1抗体#1的细胞培养上清在每1孔中添加50μl，在室温振荡1小时后，除去液体，用PBST洗涤3次。接着，将被HRP标记的抗小鼠IgG(life technologies社制)抗体用PBST稀释至3000～4000倍而得的二抗溶液在孔中各添加50μl后，除去液体，用PBST洗涤6次。
在每1孔中添加TMB底物溶液(Thermo社制)100μl，静置15～30分钟，从而进行显色反应。显色后，在每1孔中添加1N硫酸100μl使反应停止，使用吸光度计测定450nm和595nm的吸光度值。
其结果是，作为小鼠抗CAPRIN-1抗体#30所识别的CAPRIN-1的部分序列，鉴定了序列号429的多肽，作为小鼠抗CAPRIN-1抗体#34所识别的CAPRIN-1的部分序列，鉴定了序列号431的多肽，作为小鼠抗CAPRIN-1抗体#35和36所识别的CAPRIN-1的部分序列，鉴定了序列号432的多肽。
(3)各小鼠抗CAPRIN-1单克隆抗体的可变区基因的克隆
对于获得的单克隆抗体，按照WO2010/016526的实施例5所记载的方法分析编码可变区的基因序列及其氨基酸序列。
其结果是，小鼠抗CAPRN-1抗体#30包含由序列号344所示的氨基酸序列组成的重链可变区和由序列号348所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。编码重链可变区的基因序列示于序列号349，编码轻链可变区的基因序列示于序列号350。进而显示，重链可变区中的CDR1～3分别由序列号341、序列号342、序列号343所示的氨基酸序列组成，轻链可变区中的CDR1～3分别由序列号345、序列号346、序列号347所示的氨基酸序列组成。
另外，小鼠抗CAPRN-1抗体#34包含由序列号401所示的氨基酸序列组成的重链可变区和由序列号405所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。编码重链可变区的基因序列示于序列号406，编码轻链可变区的基因序列示于序列号407。进而显示，重链可变区中的CDR1～3分别由序列号398、序列号399、序列号400所示的氨基酸序列组成，轻链可变区中的CDR1～3分别由序列号402、序列号403、序列号404所示的氨基酸序列组成。
小鼠抗CAPRN-1抗体#35包含由序列号411所示的氨基酸序列组成的重链可变区和由序列号415所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。编码重链可变区的基因序列示于序列号416，编码轻链可变区的基因序列示于序列号417。进而显示，重链可变区中的CDR1～3分别由序列号408、序列号409、序列号410所示的氨基酸序列组成，轻链可变区中的CDR1～3分别由序列号412、序列号413、序列号414所示的氨基酸序列组成。
小鼠抗CAPRN-1单克隆抗体#36包含由序列号421所示的氨基酸序列组成的重链可变区和由序列号425所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。编码重链可变区的基因序列示于序列号426，编码轻链可变区的基因序列示于序列号427。进而，重链可变区中的CDR1～3分别由序列号418、序列号419、序列号420所示的氨基酸序列组成，轻链可变区中的CDR1～3分别由序列号422、序列号423、序列号424所示的氨基酸序列组成。
(4)使用各小鼠抗CAPRIN-1单克隆抗体的胆囊癌细胞膜面上的CAPRIN-1蛋白质的表达分析
对于人的胆囊癌细胞株TGBC14TKB，检查CAPRIN-1蛋白质是否在其细胞表面上表达。在1.5ml的微量离心管中离心分离上述胆囊癌细胞株5×105细胞。使各小鼠抗CAPRIN-1抗体以最终浓度为20μg/ml与其反应，在冰上静置1小时。用PBS洗涤后，与稀释了100倍的Alexa488标记山羊抗小鼠IgG抗体(life technologies社制)反应，在冰上静置30小时。用PBS洗涤后，用ベクトンディッキンソン株式会社的FACSCalibur测定荧光强度。作为阴性对照，以仅与二次抗体反应的产物作为阴性对照。其结果是，添加了抗CAPRIN-1抗体的细胞与对照相比，胆囊癌细胞均荧光强度强35％以上。由此确认，CAPRIN-1蛋白在胆囊癌细胞株的细胞膜表面上表达。
[实施例9]针对CAPRIN-1蛋白质的小鼠单克隆抗体#31～33的制作
(1)小鼠抗CAPRIN-1抗体#31的制作
将WO2010/016526的实施例3中制备的具有序列号2的氨基酸序列的人CAPRIN-1蛋白质100μg与等量的MPL+TDM佐剂(シグマ社制)混合，将所得的混合物作为每1只小鼠的抗原溶液。将抗原溶液施与至6周龄的Balb/cc小鼠(日本SLC社制)的腹腔内后，每1周施与，施与7次，从而完成免疫。将从最后的免疫起3天后摘出的各个脾脏夹在灭菌后的2片载玻片中磨碎，将使用PBS(-)(日水社制)洗涤、以1500转/分钟离心10分钟并除去上清的操作重复3次，从而得到脾脏细胞。将所得的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(从ATCC购入)以10:1的比率混和，在其中加入加温至37℃的将包含10％FBS的RPMI1640培养基200μl和PEG1500(ベーリンガー社制)800μl混合而制备的PEG溶液，并静置5分钟，从而进行细胞融合。以1700转/分钟离心5分钟，除去上清，然后用加入了2％当量的Gibco社制的HAT溶液的含15％FBS的RPMI1640培养基(HAT选择培养基)150ml悬浮细胞，以96孔板(ヌンク社制)的每1孔各100μl接种于15块板中。以7天、37℃、5％CO2的条件培养，从而得到脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合而成的杂交瘤。
以由制作的杂交瘤所产生的抗体对CAPRIN-1蛋白的结合亲和性为指标筛选杂交瘤。将用WO2010/016526的实施例3所记载的方法制备的CAPRIN-1蛋白溶液1μg/ml在96孔板每1孔中添加100μl，在4℃静置18小时。将各孔用PBS-T洗涤3次后，在每1孔中添加0.5％牛血清白蛋白(BSA)溶液(シグマ社制)400μl，在室温静置3小时。除去溶液，对每1孔用400μl的PBS-T洗涤孔3次后，在每1孔中添加上述所得的杂交瘤的各培养上清100μl，在室温静置2小时。用PBS-T洗涤各孔3次后，在每1孔中添加用PBS稀释至5000倍的HRP标记抗小鼠IgG(H+L)抗体(life technologies社制)100μl，在室温静置1小时。用PBS-T洗涤孔3次后，在每1孔中添加TMB底物溶液(Thermo社制)100μl，并静置15～30分钟，从而进行显色反应。显色后，在每1孔中添加1N硫酸100μl使反应停止，使用吸光度计测定450nm和595nm的吸光度值。其结果是，筛选出了多个产生吸光度值高的抗体的杂交瘤。
将筛选出的杂交瘤以96孔板每1孔0.5个的方式添加到板中进行培养。1周后，观察到在孔中形成单个集落的杂交瘤。将这些孔的细胞进行进一步培养，以由克隆化的杂交瘤产生的抗体对CAPRIN-1蛋白的结合亲和性为指标筛选杂交瘤。将用WO2010/016526的实施例3的方法制备的CAPRIN-1蛋白溶液1μg/ml在96孔板的每1孔中添加100μl，在4℃静置18小时。用PBS-T洗涤各孔3次后，在每1孔中添加0.5％BSA溶液400μl，并在室温静置3小时。除去溶液，对每1孔用400μl的PBS-T洗涤孔3次后，在每1孔中添加上述所得的杂交瘤的各培养上清100μl，在室温静置2小时。用PBS-T洗涤各孔3次后，在每1孔中添加用PBS稀释至5000倍的HRP标记抗小鼠IgG(H+L)抗体(life technologies社制)100μl并在室温静置1小时。用PBS-T洗涤孔3次后，在每1孔中添加TMB底物溶液(Thermo社制)100μl，并静置15～30分钟，从而显色反应。显色后，在每1孔中添加1N硫酸100μl使反应停止，使用吸光度计测定450nm和595nm的吸光度值。其结果是，得到了61个产生对CAPRIN-1蛋白显示反应性的单克隆抗体的杂交瘤株。
接着在这些单克隆抗体中，筛选对表达CAPRIN-1的乳癌细胞的细胞表面显示反应性的单克隆抗体。具体地，在1.5ml容量的微量离心管中离心分离106个人乳癌细胞株MDA-MB-231V，在其中添加上述各杂交瘤的培养上清100μl，在冰上静置1小时。用PBS洗涤后，添加用含0.1％FBS的PBS稀释了500倍的FITC标记山羊抗小鼠IgG抗体(life technologies社制)，在冰上静置1小时。用PBS洗涤后，用ベクトンディッキンソン株式会社的FACSCalibur测定荧光强度。另一方面，对使用了以杂交瘤培养用培养基稀释了500倍的未经过任何处理6周龄的Balb/c小鼠的血清代替抗体的样品进行与上述同样的操作，作为对照。其结果是，筛选出了1个与对照相比荧光强度强、即与乳癌细胞的细胞表面反应的小鼠单克隆抗体(小鼠抗CAPRIN-1抗体#31)。
(2)小鼠抗CAPRIN-1抗体#31所识别的CAPRIN-1表位的鉴定
使用上述(1)中获得的、与癌细胞的细胞表面反应的针对CAPRIN-1的单克隆抗体(小鼠抗CAPRIN-1抗体#31)进行所识别的CAPRIN-1表位区域的鉴定。合成包含人CAPRIN-1蛋白质的氨基酸序列中的12～16个氨基酸的93个候选肽，分别用DMSO溶解至1mg/ml的浓度。
将各肽在0.1M碳酸钠缓冲液(pH9.6)中溶解至30μg/ml的浓度，在96孔板(Nunc社制、制品号：436006)的每1孔中各添加100μl并在4℃静置一夜。丢弃液体，将10mM乙醇胺/0.1M碳酸钠缓冲液(PH9.6)在每1孔中各添加200μl，在室温静置1小时后，丢弃液体，用含0.5％Tween20的PBS(PBST)洗涤2次，从而制作固相化了各肽的板。
在其中将含抗CAPRIN-1抗体#1的细胞培养上清在每1孔中添加50μl，在室温振荡1小时后，除去液体，用PBST洗涤3次。接着，将被HRP标记的抗小鼠IgG(life technologies社制)抗体用PBST稀释至3000～4000倍而得的二抗溶液在孔中各添加50μl后，除去液体，用PBST洗涤6次。
在每1孔中添加TMB底物溶液(Thermo社制)100μl，静置15～30分钟，从而进行显色反应。显色后，在每1孔中添加1N硫酸100μl使反应停止，使用吸光度计测定450nm和595nm的吸光度值。
其结果是，作为(1)所得的小鼠抗CAPRIN-1抗体#31所识别的CAPRIN-1的部分序列，鉴定了序列号430的多肽。
(3)小鼠抗CAPRIN-1抗体#32和33的制作
通过与上述(1)同样的方法，将(2)所鉴定出的具有序列号430的氨基酸序列的多肽与载体蛋白质钥孔戚血蓝蛋白(KLH，Keyhole limpet haemocyanin)的融合蛋白质作为免疫原，与等量的佐剂TiterMax Gold(注册商标)(CytRx社)混合，每隔7天在小鼠的腹腔施与1次，每次100μg。合计进行4次施与后，从最终免疫起3天后的小鼠获得脾脏细胞，通过与上述(1)同样的方法与小鼠骨髓瘤细胞融合而制作杂交瘤。然后，以所制作的杂交瘤的培养上清中所含的各抗体、与WO2010/016526的实施例3中制备的CAPRIN-1蛋白溶液1μg/ml以及作为免疫原使用的序列号5的氨基酸序列与载体蛋白质BSA的融合蛋白质的反应性作为指标筛选抗体。将WO2010/016526的实施例3中制备的CAPRIN-1蛋白溶液1μg/ml和序列号5的氨基酸序列与载体蛋白质BSA的融合蛋白质30μg/ml分别在96孔板的每1孔中添加100μl，在4℃静置18小时。将各孔用PBS-T洗涤后，在每1孔中添加BLOCKACE(DSファーマバイオメディカル社)溶液400μl，在室温静置3小时。除去溶液，用PBS-T洗涤孔后，在每1孔中添加上述所得的杂交瘤的各培养上清100μl，在室温静置2小时。用PBS-T洗涤各孔后，在每1孔中添加用PBS稀释了5000倍的HRP标记抗小鼠IgG(H+L)抗体(life technologies社制)100μl，在室温静置1小时。用PBS-T洗涤孔后，在每1孔中添加TMB底物溶液(Thermo社制)100μl，静置5～30分钟，从而进行显色反应。显色后，在每1孔中添加1N硫酸100μl添加使反应停止，使用吸光度计测定450nm和595nm的吸光度值。其结果是，筛选出产生吸光度值高的抗体的杂交瘤。
将筛选的杂交瘤以96孔板的每1孔中为0.3个的方式添加到板中进行培养。1周后，观察到在孔中形成单个集落的杂交瘤。将这些孔的细胞进一步培养，以克隆化的杂交瘤所产生的抗体对CAPRIN-1的部分序列即序列号430的氨基酸序列的结合亲和性为指标，使用与上述同样的方法，得到产生针对序列号430的氨基酸的抗体的杂交瘤。
筛选由所得的杂交瘤所产生的单克隆抗体的内的对表达CAPRIN-1的乳癌细胞的细胞表面显示反应性的单克隆抗体。具体地，在1.5ml容量的微量离心管中离心分离106个人乳癌细胞株MDA-MB-231V，在其中添加上述各杂交瘤的培养上清100μl，在冰上静置1小时。用PBS洗涤后，添加用含0.1％FBS的PBS稀释了500倍的FITC标记山羊抗小鼠IgG抗体(life technologies社制)，在冰上静置1小时。用PBS洗涤后，用ベクトンディッキンソン株式会社的FACSCalibur测定荧光强度。另一方面，对使用了以杂交瘤培养用培养基稀释了500倍的未经过任何处理6周龄的Balb/c小鼠的血清代替抗体的样品、和仅与二抗反应了的样品，进行与上述同样的操作，作为阴性对照。其结果是，得到了2个与阴性对照相比荧光强度强、即与乳癌细胞的细胞表面反应的小鼠单克隆抗体(小鼠抗CAPRIN-1抗体#32、小鼠抗CAPRIN-1抗体#33)。
检查了所得的小鼠抗CAPRIN-1抗体#32以及#33是否与作为免疫原的CAPRIN-1的部分序列即具有序列号430的氨基酸序列的多肽特异性地反应。将用0.1M的碳酸钠水溶液调制成30μg/ml的含序列号430的氨基酸序列的溶液和不含序列号430的氨基酸序列的CAPRIN-1的部分序列分别在ELISA用96孔板氨基酶标板(ヌンク社)中各添加100μg/ml，在4℃反应一昼夜而使肽与孔结合。在结合了肽的孔中添加含10mM乙醇胺的0.1M碳酸钠水溶液，在室温静置1小时。除去孔内的溶液后，用PBS-T洗涤，然后在每1孔中添加BLOCKACE溶液400μl，在室温静置3小时。除去孔内的溶液，用PBS-T洗涤后，分别在每1孔中添加包含小鼠抗CAPRIN-1 31#32以及#33的培养上清各50μL，在室温使其反应1小时。然后用PBS-T洗涤，在每1孔中添加用BLOCKACE溶液稀释至5000倍的HRP标记抗小鼠IgG(H+L)抗体(life technologies社制)50μl，在室温静置1小时。用PBS-T将孔充分洗涤后，在每1孔中添加TMB底物溶液(Thermo社制)100μl，静置5～30分钟，从而进行显色反应。显色后，在每1孔中添加1N硫酸100μl使反应停止，使用吸光度计测定450nm和595nm的吸光度值，结果小鼠抗CAPRIN-1抗体#32以及#33与不包含序列号序列号430的氨基酸序列CAPRIN-1的部分序列完全不反应，仅与具有序列号430的氨基酸序列的多肽特异性地反应。因此，确认了序列号430的多肽包含小鼠单克隆抗体#32和#33的表位区域。
(4)小鼠抗CAPRIN-1抗体#31～33的特征
对于(1)和(3)所得的小鼠抗CAPRIN-1抗体#31～33，按照WO2010/016526的实施例5所记载的方法获得编码可变区的基因的扩增片段，分析基因序列及其氨基酸序列。其结果得到的编码小鼠抗CAPRIN-1抗体#31的重链可变区的基因序列示于序列号381，以及氨基酸序列示于序列号376，编码轻链可变区的基因序列示于序列号382，以及氨基酸序列示于序列号380。另外，得到的编码小鼠抗CAPRIN-1抗体#32的重链可变区的基因序列示于序列号391，以及氨基酸序列示于序列号386，编码轻链可变区的基因序列示于序列号392，以及氨基酸序列示于序列号390。进行另外，得到的编码小鼠抗CAPRIN-1抗体#33的重链可变区的基因序列示于序列号397，以及氨基酸序列示于序列号396，编码轻链可变区的基因序列示于序列号392，以及氨基酸序列示于序列号390。
另外确认了，小鼠抗CAPRIN-1抗体#31的重链可变区中的CDR1～3分别由序列号373、序列号374、序列号375的氨基酸序列组成，轻链可变区中的CDR1～3分别由序列号377、序列号378、序列号379的氨基酸序列组成。另外确认了，小鼠抗CAPRIN-1抗体#32的重链可变区中的CDR1～3分别由序列号383、序列号384、序列号385的氨基酸序列组成，轻链可变区中的CDR1～3分别由序列号387、序列号388、序列号389的氨基酸序列组成。进行另外确认了，小鼠抗CAPRIN-1抗体#33的重链可变区中的CDR1～3分别由序列号393、序列号394、序列号395的氨基酸序列组成，轻链可变区中的CDR1～3分别由序列号387、序列号388、序列号389的氨基酸序列组成。
[实施例10]使用小鼠抗CAPRIN-1单克隆抗体#30～36的胆囊癌细胞膜面上的CAPRIN-1蛋白质的表达分析
对于人的胆囊癌细胞株TGBC14TKB，使用小鼠抗CAPRIN-1单克隆抗体#30～36检查CAPRIN-1蛋白质是否在其细胞表面上表达。在1.5ml的微量离心管中离心分离TGBC14TKB 5×105细胞。使小鼠抗CAPRIN-1单克隆抗体#30～36以最终浓度为20μg/ml分别与其反应，在冰上静置1小时。用PBS洗涤后，与稀释了100倍的Alexa488标记山羊抗小鼠IgG抗体(life technologies社制)反应，在冰上静置30小时。用PBS洗涤后，用ベクトンディッキンソン株式会社的FACSCalibur测定荧光强度。作为阴性对照，以仅与二次抗体反应的产物作为阴性对照。其结果是，添加了小鼠抗CAPRIN-1单克隆抗体#30～36的TGBC14TKB与对照相比，荧光强度强35％以上。由此确认，CAPRIN-1蛋白质在上述胆囊癌细胞株的细胞膜表面上表达。
[实施例11]人-小鼠嵌合抗CAPRIN-1抗体的制作
将包含小鼠抗CAPRIN-1抗体#30～36各自的重链可变区的基因扩增片段的两端进行限制酶处理后纯化，按照常规方法插入已经插入了来源于小鼠抗体的前导序列和包含序列号264的氨基酸序列的人IgG1的H链恒定区的pcDNA4/myc-His(life technologies社制)载体中。另外，将包含小鼠抗CAPRIN-1抗体#30～36各自的轻链可变区的基因扩增片段的两端进行限制酶处理后纯化，按照常规方法插入已经插入了来源于小鼠抗体的前导序列和包含序列号265的氨基酸序列的人IgG1的L链恒定区的pcDNA3.1/myc-His(life technologies社制)载体中。
接着，将插入了上述的小鼠抗CAPRIN-1抗体#30～36各自的重链可变区的上述重组载体、和插入了轻链可变区的上述重组载体导入到CHO-K1细胞(从理研セルバンク获得)中。具体地，将在12孔培养板的每1孔中用1ml含有10％FBS的Ham’sF12培养基(life technologies社制)培养而得的2×105个CHO-K1细胞用PBS(-)洗涤后，以每1孔1ml的量重新加入含有10％FBS的Ham’sF12培养基，在加入后的孔中添加将溶解在30μl的OptiMEM(life technologies社制)中的上述各载体250ng与Polyfect transfection reagent(QIAGEN社制)30μl混合而成的混合物。将导入了上述重组载体的CHO-K1细胞在添加了200μg/ml Zeocin(life technologies社制)和200μg/ml Geneticin(ロシュ社制)的含有10％FBS的Ham’sF12培养基中培养后，向96孔板中以每孔0.5个的方式接种导入了上述重组载体的CHO-K1细胞，从而制作分别稳定地产生具有小鼠抗CAPRIN-1抗体#30～36各自的可变区的人-小鼠嵌合抗CAPRIN-1抗体#30～36的细胞株。
将制作的细胞株，使用150cm2烧瓶以5×105个/ml使用不含血清的OptiCHO培养基(life technologies社制)30ml培养5天，得到分别包含人-小鼠嵌合抗CAPRIN-1抗体#30～36的培养上清。
[实施例12]抗CAPRIN-1抗体对胆囊癌细胞的抗肿瘤活性(ADCC活性)
为了评价针对序列号429～432所示的来源于CAPRIN-1的肽的抗体对表达CAPRIN-1的胆囊癌细胞的细胞毒害性强弱，使用人-小鼠嵌合抗CAPRIN-1抗体#30～36测定ADCC活性。将胆囊癌细胞株TGBC14TKB106个收集到50ml容量的离心管中，加入100μCi的铬51，在37℃孵育2小时。然后用含有10％FBS的RPMI1640培养基洗涤3次，向96孔V底板各孔中分别在各个孔添加人-小鼠嵌合抗CAPRIN-1抗体#30～36使得最终浓度为5μg/ml，进而作为效应器细胞在每1孔中添加从人末梢血淋巴细胞使用常规方法分离的人NK细胞2×105个。在其中以每1孔2×103个混合摄入了铬51的所述胆囊癌细胞，培养4小时，测定培养后释放到培养基中的铬51的量，通过以下计算式*算出对胆囊癌细胞株的细胞毒活性。
*式：细胞毒活性(％)＝从加入了针对CAPRIN-1的抗体和淋巴细胞时的靶细胞游离的铬51游离量÷从加入了1N盐酸的靶细胞游离的铬51游离量×100。
其结果是，任一人-小鼠嵌合抗CAPRIN-1抗体均对胆囊癌细胞显示20％以上的活性，与此相对，作为阴性对照使用的人IgG1抗体对胆囊癌细胞活性均小于7％。
[实施例13]使用了兔的抗CAPRIN-1单克隆抗体的制作
(1)兔抗CAPRIN-1单克隆抗体#1的制作
将抗原蛋白质(人CAPRIN-1)300μg与等量的弗氏完全佐剂混合，将此作为每1只兔的抗原溶液。第2次以后的免疫使用与弗氏不完全佐剂的混合物。将抗原溶液施与至7周龄的兔的腹腔内后，每4周施与，施与7次，从而完成免疫。将从最后的免疫起4天后摘出的各个脾脏夹在灭菌后的2片载玻片中磨碎，将使用PBS(-)(日水社制)洗涤、以1500转/分钟离心10分钟并除去上清的操作重复3次，从而得到脾脏细胞。将所得的脾脏细胞与兔的骨髓瘤细胞以5:1的比率混和，在其中加入加温至37℃的将包含10％FBS的IMDM培养基200μl和PEG1500(ベーリンガー社制)800μl混合而制备的PEG溶液，并静置5分钟，从而进行细胞融合。以1700转/分钟离心5分钟，除去上清，然后用加入了2％当量的Gibco社制的HAT溶液的含10％FBS的IMDM培养基(HAT选择培养基)300ml悬浮细胞，以96孔板(ヌンク社制)的每1孔各100μl接种于30块板中。以7天、37℃、5％CO2的条件培养，从而得到脾脏细胞与兔骨髓瘤细胞融合而成的杂交瘤。
以由制作的杂交瘤所产生的抗体对CAPRIN-1蛋白质的反应性为指标筛选杂交瘤。将CAPRIN-1蛋白质溶液1μg/ml在96孔板每1孔中添加100μl，在4℃静置18小时。将各孔用PBS-T洗涤3次后，在每1孔中添加0.5％牛血清白蛋白(BSA)溶液(シグマ社制)400μl，在室温静置3小时。除去溶液，对每1孔用400μl的PBS-T洗涤孔3次后，在每1孔中添加上述所得的杂交瘤的各培养上清100μl，在室温静置2小时。用PBS-T洗涤各孔3次后，在每1孔中添加用PBS稀释至5000倍的HRP标记抗兔抗体100μl，在室温静置1小时。用PBS-T洗涤孔3次后，在每1孔中添加TMB底物溶液(Thermo社制)100μl，并静置15～30分钟，从而进行显色反应。显色后，在每1孔中添加1N硫酸100μl使反应停止，使用吸光度计测定450nm和595nm的吸光度值。其结果是，筛选出了多个产生吸光度值高的抗体的杂交瘤。
将筛选出的杂交瘤以96孔板每1孔0.5个的方式添加到板中进行培养。1周后，观察到在孔中形成单个集落的杂交瘤。将这些孔的细胞进行进一步培养，以由克隆化的杂交瘤产生的抗体对CAPRIN-1蛋白的反应性为指标筛选杂交瘤。将CAPRIN-1蛋白溶液1μg/ml在96孔板的每1孔中添加100μl，在4℃静置18小时。用PBS-T洗涤各孔3次后，在每1孔中添加0.5％BSA溶液400μl，并在室温静置3小时。除去溶液，对每1孔用400μl的PBS-T洗涤孔3次后，在每1孔中添加上述所得的杂交瘤的各培养上清100μl，在室温静置2小时。用PBS-T洗涤各孔3次后，在每1孔中添加用PBS稀释至5000倍的HRP标记抗兔IgG抗体100μl并在室温静置1小时。用PBS-T洗涤孔3次后，在每1孔中添加TMB底物溶液(Thermo社制)100μl，并静置15～30分钟，从而进行显色反应。显色后，在每1孔中添加1N硫酸100μl使反应停止，使用吸光度计测定450nm和595nm的吸光度值。其结果是，得到了多个产生对CAPRIN-1蛋白质显示反应性的兔单克隆抗体的杂交瘤株。
接着从这些对CAPRIN-1蛋白质显示反应性的兔单克隆抗体中筛选对CAPRIN-1表达的癌细胞表面显示反应性的兔单克隆抗体。具体地，在1.5ml容量的微量离心管中分别离心分离2×105个人乳癌细胞株MDA-MB-231V以及人肺癌细胞株QG56，在其中添加上述各杂交瘤的培养上清100μl，在冰上静置1小时。用PBS洗涤后，添加用含0.05％FBS的PBS(-)稀释了100倍的FITC标记抗兔IgG(H+L)抗体或者Alexa488标记抗兔IgG(H+L)，在冰上静置1小时。用PBS洗涤后，用ベクトンディッキンソン株式会社的FACSCalibur测定荧光强度。另一方面，使用杂交瘤培养用培养基进行与上述同样的操作，作为阴性对照的样品。其结果是，筛选出了1个与阴性对照相比荧光强度强、即与CAPRIN-1表达的癌细胞MDA-MB-231以及QG56的细胞表面反应的兔抗CAPRIN-1单克隆抗体(兔抗CAPRIN-1单克隆抗体#1)。
接着，鉴定由筛选出的兔抗CAPRIN-1单克隆抗体#1所识别的CAPRIN-1表位。合成包含人CAPRIN-1蛋白质的氨基酸序列中的12～16个氨基酸的93个候选肽，分别用DMSO溶解至1mg/ml的浓度。将各肽在0.1M碳酸钠缓冲液(pH9.6)中溶解至30μg/ml的浓度，在96孔板(Nunc社制、制品号：436006)的每1孔中各添加100μl并在4℃静置一夜。丢弃液体，将10mM乙醇胺/0.1M碳酸钠缓冲液(PH9.6)在每1孔中各添加200μL，在室温静置1小时后，丢弃液体，用含0.5％Tween20的PBS(PBST)洗涤2次，从而制作固相化了各肽的板。为了确认，在本板中也按照上述方法准备固相化了CAPRIN-1蛋白的孔。在其中将按照常规方法纯化后的兔抗CAPRIN-1单克隆抗体#1在每1孔中以0.1ug/mL的浓度添加50μL，在室温振荡1小时后，除去液体，用PBST洗涤3次。接着，将被HRP标记的抗兔IgG抗体用PBST稀释至3000～4000倍而得的二抗溶液在孔中各添加50μL后，除去液体，用PBST洗涤6次。在每1孔中添加TMB底物溶液(Thermo社制)100μL，静置15～30分钟，从而进行显色反应。显色后，在每1孔中添加1N硫酸100μL使反应停止，使用吸光度计测定450nm和595nm的吸光度值。其结果是，兔抗CAPRIN-1单克隆抗体兔抗CAPRIN-1单克隆抗体#1仅对作为CAPRIN-1的部分序列合成的93个肽中具有序列号430所示的氨基酸序列的多肽显示反应性，对其他多肽不显示反应性。另外，兔抗CAPRIN-1单克隆抗体#1对CAPRIN-1蛋白特异性地显示反应性。由该结果判断，兔抗CAPRIN-1单克隆抗体#1的表位包含在序列号430的多肽中。
接着，对于上述所得的兔抗CAPRIN-1单克隆抗体#1，按照WO2010/016526的实施例5所记载的方法获得编码可变区的基因的扩增片段，分析基因序列及其氨基酸序列。具体地，从产生兔抗CAPRIN-1单克隆抗体#1的杂交瘤中提取mRNA，通过使用了对兔可变区序列特异的引物的RT-PCR法来获得本抗体的重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区的基因。为了序列确定，将这些基因克隆化至pCR2.1载体(life technologies社制)中。克隆化而得的各质粒中的VH区和VL区的基因序列使用M13正向引物和M13反向引物通过荧光测序仪来分别确定。
其结果确认了，所得的兔抗CAPRIN-1单克隆抗体#1具有序列号359所示的重链可变区，以及重链可变区中的CDR1～3分别由序列号351、序列号352、序列号353的氨基酸序列组成，具有序列号361所示的轻链可变区，以及轻链可变区中的CDR1～3分别由序列号354、序列号355、序列号356的氨基酸序列组成。
(2)人-兔嵌合抗CAPRIN-1抗体#1的制作
人-兔嵌合抗CAPRIN-1抗体#1的制作
将用于表达上述获得的兔抗CAPRIN-1单克隆抗体#1的重链可变区的序列号358所示的基因、和用于表达轻链可变区的序列号360所示的基因分别插入到：插入有人IgG1的重链恒定区的哺乳类细胞表达用载体和插入有人IgG1的轻链恒定区的哺乳类细胞表达用载体中。将所制作的2个重组表达载体按照常规方法导入哺乳类细胞中，获得包含被人源化了的人-兔嵌合抗CAPRIN-1抗体#1的培养上清。
(3)人-兔嵌合抗CAPRIN-1抗体#1的抗原特异性、对癌细胞的反应性和抗肿瘤活性
将(2)中得到的人-兔嵌合抗CAPRIN-1抗体#1的培养上清按照常规方法使用Hitrap ProteinA SepharoseFF(GEヘルスケア社制)进行纯化，置换成PBS(-)，用0.22μm的过滤器(ミリポア社制)进行过滤，使用过滤所得的物质检查抗原特异性和对癌细胞的反应性以及抗肿瘤效果。
首先，与(1)同样地检查人-兔嵌合抗CAPRIN-1抗体#1对CAPRIN-1蛋白质和具有作为兔抗CAPRIN-1单克隆抗体#1的表位的序列号430的氨基酸序列的多肽的反应特异性，结果确认了，人-兔嵌合抗CAPRIN-1抗体#1与兔抗CAPRIN-1单克隆抗体#1同样地具有对CAPRIN-1蛋白质和具有序列号430的氨基酸序列的多肽的反应特异性。
接下来，对于胆囊癌细胞株TGBC14TKB，检查人-兔嵌合抗CAPRIN-1抗体#1对各细胞的细胞表面上的CAPRIN-1蛋白质的反应性。在1.5ml容量的微量离心管中离心分离各细胞株各106细胞。添加包含上述抗体的各细胞培养上清(100μl)，在冰上静置1小时。用PBS洗涤后，添加用含0.1％FBS的PBS稀释了100倍的Alexa488标记山羊抗人IgG(H+L)抗体(life technologies社制)，在4℃静置60分钟。用PBS(-)洗涤后，用ベクトンディッキンソン株式会社的FACSCalibur测定荧光强度。阴性对照使用仅与二抗反应了的物质。其结果是人-兔嵌合抗CAPRIN-1抗体#1显示与阴性对照相比荧光强度强30％以上的反应性。由此确认，序列号430所示的CAPRIN-1蛋白质的一部分在上述人癌细胞株的细胞膜表面上表达。此外，上述荧光强度的增强率用各细胞中的平均荧光强度(MFI值)的增加率来表示，通过以下的计算式算出。平均荧光强度的增加率(荧光强度的增强率)(％)＝((与抗CAPRIN-1抗体反应的细胞的MFI值)-(对照MFI值))÷(对照MFI值)×100。
再接着，评价人-兔嵌合抗CAPRIN-1抗体#1对胆囊癌细胞株TGBC14TKB的抗肿瘤活性。在50ml容量的离心管中收集106个胆囊癌细胞株，加入100μCi的铬51，在37℃孵育2小时。然后用含10％FBS的RPMI1640培养基洗涤3次，准备靶细胞。将纯化后的人-兔嵌合抗CAPRIN-1抗体#1分别添加到96孔V底板中至最终浓度为5μg/ml。接着，从按照常规方法制备的人末梢血淋巴细胞中分离人NK细胞，在每1孔中添加2×105个。在添加了靶和抗体的96孔V底板中每1孔混合2×103个，在37℃、5％CO2的条件下培养4小时。培养后，测定从受到毒害的肿瘤细胞中释放的培养上清中的铬51的量，计算出抗CAPRIN-1抗体对胆囊癌细胞的细胞毒活性。阴性对照使用添加了同种型对照抗体的物质。其结果显示，使用了同种型对照抗体的情况的细胞毒活性，对胆囊癌细胞均小于5％，与此相对，人-兔嵌合抗CAPRIN-1抗体#1对胆囊癌细胞均显示25％以上的抗肿瘤活性。由以上的结果明确了，针对序列号430所示的来源于CAPRIN-1的肽的抗体人-兔嵌合抗CAPRIN-1抗体#1，通过ADCC活性而对表达CAPRIN-1的胆囊癌细胞发挥抗肿瘤活性。
[实施例14]人源化抗CAPRIN-1抗体#1～3的制作
接着，制作兔抗CAPRIN-1抗体#1的人源化抗体。以兔抗CAPRIN-1单克隆抗体#1的重链可变区的氨基酸序列信息为基础，以能够表达重链可变区中的CDR1～3由序列号351、序列号352和序列号357的氨基酸序列组成、框架区包含人抗体的序列的重链可变区(序列号363)的方式，设计序列号362的碱基序列，将其插入到插入有人IgG1的重链恒定区的哺乳类细胞表达用载体。同样地，以能够表达轻链可变区中的CDR1～3由序列号354、序列号355和序列号356的氨基酸序列组成、框架区包含人抗体的序列的轻链可变区(序列号365)的方式，设计序列号364的碱基序列，将其插入到插入有人IgG1的轻链恒定区的哺乳类细胞表达用载体中。将上述2个重组表达载体按照常规方法导入哺乳类细胞中，得到包含人源化抗CAPRIN-1抗体#1的培养上清。
另外，以兔抗CAPRIN-1单克隆抗体#1的重链可变区中的氨基酸序列信息为基础，以能够表达CDR1～3由序列号351、序列号352和序列号353的氨基酸序列组成、框架区包含人抗体的序列的重链可变区(序列号368)的方式，设计序列号367的碱基序列，将其插入到插入有人IgG1的重链恒定区的哺乳类细胞表达用载体中。同样地，以能够表达轻链可变区中的CDR1～3由序列号354、序列号355和序列号356的氨基酸序列组成、框架区包含人抗体的序列的轻链可变区(序列号370)的方式，设计序列号369的碱基序列，将其插入到插入有人IgG1的轻链恒定区的哺乳类细胞表达用载体中。将上述2个重组表达载体按照常规方法导入哺乳类细胞中，得到包含人源化抗CAPRIN-1抗体#2的培养上清。
进而，以兔抗CAPRIN-1单克隆抗体#1的重链可变区中的氨基酸序列信息为基础，以能够表达CDR1～3由序列号351、序列号352和序列号353的氨基酸序列组成、框架区包含人抗体的序列的重链可变区(序列号372)的方式，设计序列号371的碱基序列，将其插入到插入有人IgG1的重链恒定区的哺乳类细胞表达用载体中。同样地，以能够表达轻链可变区中的CDR1～3由序列号354、序列号355和序列号356的氨基酸序列组成、框架区包含人抗体的序列的轻链可变区(序列号370)的方式，设计序列号369的碱基序列，将其插入到插入有人IgG1的轻链恒定区的哺乳类细胞表达用载体中。将上述2个重组表达载体按照常规方法导入哺乳类细胞中，得到包含人源化抗CAPRIN-1抗体#3的培养上清。
人源化抗CAPRIN-1抗体的抗原特异性、对癌细胞的反应性和抗肿瘤活性
评价上述得到的3种人源化抗CAPRIN-1抗体#1～#3对CAPRIN-1的反应性，结果，对CAPRIN-1蛋白质、序列号430所示的表位肽和胆囊癌细胞株的反应性与人-兔嵌合抗CAPRIN-1单克隆抗体#1为同水平。进而，评价这3种人源化抗CAPRIN-1抗体对胆囊癌细胞株的抗肿瘤活性，结果任一抗体均显示与人-兔嵌合抗CAPRIN-1单克隆抗体#1同水平的抗肿瘤活性。
[实施例15]使用小鼠抗CAPRIN-1单克隆抗体#23～29的胆囊癌细胞膜面上的CAPRIN-1蛋白质的表达分析
接着，使用包含WO/2013/018894中得到的含有包含由序列号276、277和278所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的序列号279所示的重链可变区和包含由序列号280、281和282所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的序列号283所示的轻链可变区的抗CAPRIN-1单克隆抗体#23，含有包含由序列号276、277和278所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的序列号279所示的重链可变区和包含由序列号286、287和288所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的序列号289所示的轻链可变区的抗CAPRIN-1单克隆抗体#24，含有包含由序列号291、292和293所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的序列号294所示的重链可变区和包含由序列号295、296和297所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的序列号298所示的轻链可变区的抗CAPRIN-1单克隆抗体#25，WO/2013/018894中得到的含有包含由序列号301、302和303所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的序列号304所示的重链可变区和包含由序列号305、306和307所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的序列号308所示的轻链可变区的抗CAPRIN-1单克隆抗体#26，WO/2013/018891中得到的含有包含由序列号311、312和313所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的序列号314所示的重链可变区和包含由序列号315、316和317所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的序列号318所示的轻链可变区的抗CAPRIN-1单克隆抗体#27，WO/2013/018889中得到的含有包含由序列号321、322和323所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的序列号324所示的重链可变区和包含由序列号325、326和327所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的序列号328所示的轻链可变区的抗CAPRIN-1单克隆抗体#28，和WO/2013/018883中得到的含有包含由序列号331、332和333所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的序列号334所示的重链可变区和包含由序列号335、336和337所示的氨基酸序列组成的互补决定区(分别为CDR1、CDR2、CDR3)的序列号338所示的轻链可变区的抗CAPRIN-1单克隆抗体#29，与实施例10同样地对于胆囊癌细胞株TGBC14TKB，检查CAPRIN-1蛋白质是否在其细胞表面上表达，结果得到了与实施例10的小鼠抗CAPRIN-1单克隆抗体#30～36同等的对胆囊癌细胞株的反应性。
[实施例16]人-小鼠嵌合抗CAPRIN-1抗体#23～29对胆囊癌细胞的抗肿瘤活性
通过与实施例11同样的方法，制作分别稳定地产生具有实施例15所记载的小鼠抗CAPRIN-1抗体#23～29各自的可变区的人-小鼠嵌合抗CAPRIN-1抗体#23～29的细胞株，得到分别包含人-小鼠嵌合抗CAPRIN-1抗体#23～29的培养上清。使用将该上清通过常规方法纯化而得的物质，检查对胆囊癌细胞的抗肿瘤活性。为了评价对表达CAPRIN-1的胆囊癌细胞的细胞毒害性的强弱，使用人-小鼠嵌合抗CAPRIN-1抗体#23～29来测定ADCC活性。通过与实施例12同样的方法，评价对胆囊癌细胞株TGBC14TKB的ADCC活性，结果是，任一人-小鼠嵌合抗CAPRIN-1抗体均对胆囊癌细胞株TGBC14TKB显示20％以上的活性，与此相对，作为阴性对照使用的人IgG1抗体对胆囊癌细胞活性小于5％。
产业可利用性
本发明的抗体在胆囊癌的治疗和/或预防中有用。
此外，将本说明书中引用的所有刊物、专利和专利申请直接作为参考引入本说明书中。