珍珠透骨草总黄酮的制备方法及应用的制作方法
珍珠透骨草总黄酮的制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了珍珠透骨草总黄酮的制备方法及应用，属于从中药中提取制备总黄酮的方法领域。包括以下步骤：干燥珍珠透骨草粉碎，乙醇或甲醇回流提取，或浸渍提取，或超声提取，或渗漉提取，提取液减压浓缩，加水沉淀后离心，上清液上大孔树脂或聚酰胺柱，水或稀乙醇洗脱杂质后，乙醇梯度洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩干燥，得总黄酮。本发明中的总黄酮在体外抑制糖苷酶和对脂多糖诱导下RAW264.7细胞炎症模型的抗炎的作用，和用于治疗各种癌症以及适用于人体各系统、器官、组织各种炎性病变的抗炎镇痛以及创伤，手术，骨折，癌症等引起的疼痛。本发明效果显著有着广阔的推广应用前景。
【专利说明】珍珠透骨草总黄酮的制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于从中药中提取制备总黄酮的方法领域，特别是涉及到从珍珠透骨草中 制备总黄酮的方法，以及总黄酮在体外抑制糖苷酶和对脂多糖诱导下RAW264. 7细胞炎症 模型的抗炎的作用，和用于治疗各种癌症以及适用于人体各系统、器官、组织各种炎性病变 的抗炎镇痛以及创伤，手术，骨折，癌症等引起的疼痛。
【背景技术】
[0002] 珍珠透骨草 Speranskiatuberculata (Bunge) Baill.为大戟科 Euphorbiaceae 地 构叶属植物SperanskiaBaill.的干燥全草，是我国特有属。除了东部和西部，全国各省市 区都有野生。珍珠透骨草民间又称"气死大夫草"，具有祛风，除湿，舒筋，活血，止痛的功效， 用于风湿痹痛，筋骨挛缩，寒湿脚气，疮癣肿毒等症。
[0003] 据文献报道珍珠透骨草主要含有生物碱、黄酮、挥发油和留醇类成分，现代药理研 究发现其内的阿魏酸具抗炎作用。
[0004] 随着社会的越来越好的发展，炎症性疾病也越发的增多，因此新开发的抗炎药物 也由此而生，但使现在的抗炎药物仍然存在不良反应较大、安全性比较低等一些问题。所 以，开始寻找一种安全、有效的抗炎药物仍然是一个主要的问题要解决，以及如何选择合适 的模型，初步筛选抗炎作用的消炎药及其作用机制是要成为其中的一个重要课题。
[0005] 糖尿病是危害人类健康的重大疾病之一，在各种类型的糖尿病当中以2型糖尿病 的发病率较高。而阐明内源性低分子抑血糖物的化学本质是这一领域研究的核心问题。首 先，从植物中筛选出的活性化成分可作为化学治疗的补充，其次，小分子抑血糖物作用机理 的研究有助于对降血糖药物本质认识的深入及加强降血糖活性物质筛选的针对性。
[0006] 综上所述，本领域亟需要一种新的技术方案来解决这些问题。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是：提供了一种从珍珠透骨草中提取、制备总黄酮的 方法，以及根据该技术所得总黄酮提取物的体外抑制糖苷酶和对脂多糖诱导下RAW264. 7 细胞炎症模型的抗炎活性功能，和用于治疗各种糖尿病以及适用于人体各系统、器官、组织 各种炎性病变的抗炎镇痛以及创伤，手术，骨折，癌症等引起的疼痛。
[0008] 珍珠透骨草总黄酮的制备方法，其特征在于：
[0009] 包括以下步骤
[0010] 步骤一、将珍珠透骨草于干燥箱中进行干燥脱去水分，将干燥后的珍珠透骨草粉 碎，粉碎的细度为10目?30目；
[0011] 步骤二、继续步骤一的操作采用体积比为10%?90%的提取溶剂乙醇在室温 25°C的温控下浸渍两次，每次2天?15天，合并浸渍液，将浸渍液加热至70°进行回流提取 两次，合并提取液，将提取液在压力为lkpa?2. 67kpa条件下浓缩至相对密度为1. 2的呈 稠膏状的提取物；
[0012] 步骤三、将步骤二中制得的生药加水并搅拌，生药与水的重量比为（1:6)? (1:8)，在室温25°C的温控下冷却沉淀4小时，沉淀后于1200rad/min?1600rad/min的离 心机内沉降离心15分钟?30分钟，离心完毕后取上清液备用；
[0013] 步骤四、纯化的柱材料为大孔吸附树脂，取大孔吸附树脂按照与生药的重量比为 1 : (1?2)的比例装柱，将步骤三备用的上清液上样；
[0014] 步骤五、继续上一步的操作，首先用2倍?4倍柱体积去离子水洗脱，再用4倍? 6倍柱体积乙醇进行梯度洗脱，其中乙醇的体积比20%?80%，收集乙醇洗脱液，在50°? 70°C压力为lkpa?2. 67kpa条件下浓缩至相对密度为1.2呈稠膏状的提取物，在50°? 70°C干燥，粉碎后得珍珠透骨草总黄酮提取物，得率重量比为2. 5%?3. 2%。
[0015] 所述的步骤二中提取溶剂为甲醇。
[0016] 所述的步骤二中提取方式为浸渍提取、超声提取或渗漉提取。
[0017] 所述的步骤四中纯化的柱材料为聚酰胺。
[0018] 所述的步骤五中采用稀乙醇洗脱去杂。
[0019] 所述的步骤五中粉碎后得珍珠透骨草总黄酮提取物，对该提取物采用紫外分光光 度法，以NaN0 2-Al (NO) 3-NaOH显色测定总黄酮含量，以芦丁计，黄酮类化合物的总含量不低 于 50%。
[0020] 珍珠透骨草总黄酮的应用，其特征在于：珍珠透骨草总黄酮在体外抑制糖苷酶，同 时对LPS刺激的脂多糖具有抗炎作用。
[0021] 珍珠透骨草总黄酮的应用，其特征在于：珍珠透骨草总黄酮于抗炎镇痛药物之中 应用。
[0022] 通过上述设计方案，本发明可以带来如下有益效果：本发明针对现有技术当中存 在的不足之处，采用现代药效学研究方法对珍珠透骨草的有效成分进行筛选，确定了具有 体外抑制糖苷酶和对脂多糖诱导下RAW264. 7细胞炎症模型的抗炎活性的有效部位，进而 经过工艺研究确定了珍珠透骨草总黄酮的制备方法。经检索，珍珠透骨草的活性成分制备 方法多为有机溶剂直接冷浸、回流、超临界萃取等，尚未有对珍珠透骨草中黄酮类有效成分 有针对性的应用大孔树脂和聚酰胺等填料进行提取、制备方法的专利公布。
[0023] 珍珠透骨草总黄酮的含量测定方法及其质量要求为：采用紫外分光光度法，以 NaN02-Al (NO) 3-NaOH显色测定总黄酮含量，以芦丁计，黄酮类化合物的总含量不低于50%。
[0024] 本发明提供了一种从珍珠透骨草中提取、制备总黄酮的方法，以及根据该技术所 得总黄酮提取物的体外抑制糖苷酶和对脂多糖诱导下RAW264. 7细胞炎症模型的抗炎活性 功能，和用于治疗各种糖尿病以及适用于人体各系统、器官、组织各种炎性病变的抗炎镇痛 以及创伤，手术，骨折，癌症等引起的疼痛。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 下面结合【专利附图】
【附图说明】和【具体实施方式】对本发明作进一步说明：
[0026] 图1为本发明的珍珠透骨草不同萃取部位抗炎图谱。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合实例对本发明进行详细描述。但是，本发明不局限于所给出的这些实例。
[0028] 实施例1、干燥珍珠透骨草1. 0kg粉碎成粗粉（20目），用80 %乙醇（体积比）冷 浸两次，每次15天，合并浸渍液，减压浓缩呈稠膏（相对密度1. 2, 70°C )，加600-800毫升 水搅拌，冷却沉淀。置离心机（1200-1600rad/min)沉降离心15-30分钟，取上清液备用。
[0029] 取大孔吸附树脂，按与生药重量比1 :2的比例装柱，将上述备用的上清液上样， 先用2-4倍柱体积去离子水洗脱，再用4-6倍柱体积20% -60%乙醇（体积比）进行梯度 洗脱，收集乙醇洗脱液，50-70°C减压浓缩，50-70°C干燥，得珍珠透骨草总黄酮提取物，得率 (重量比）为2. 7%。
[0030] 实施例2、干燥珍珠透骨草1. 0kg粉碎成粗粉（20目），用80%甲醇（体积比）冷 浸两次，每次15天，合并浸渍液，减压浓缩呈稠膏（相对密度1. 2, 70°C )，加600-800毫升 水搅拌，冷却沉淀。置离心机（1200-1600rad/min)沉降离心15-30分钟，取上清液备用。
[0031] 取聚酰胺，按与生药重量比1 :1的比例装柱，将上述备用的上清液上样，先用2-4 倍柱体积去离子水洗脱，再用4-6倍柱体积20% -80%乙醇进行梯度洗脱，收集乙醇洗脱 液，50-70°C减压浓缩，50-70°C干燥，得珍珠透骨草总黄酮提取物，得率为2. 5%。
[0032] 实施例3、干燥珍珠透骨草1. 0kg粉碎成粗粉（20目），用60 %乙醇（体积比）浸 渍48小时后，渗漉提取，渗漉至流出液色浅，黄酮反应不明显为止，减压浓缩呈稠膏（相对 密度1. 2, 70°C )，加600-800毫升水搅拌，冷却沉淀。置离心机（1200-1600rad/min)沉降 离心15-30分钟，取上清液备用。
[0033] 取大孔吸附树脂，按与生药重量比1 :1的比例装柱，将上述各用的上清液上样，先 用2-4倍柱体积去离子水洗脱，再用4-6倍柱体积30% -80%乙醇进行梯度洗脱.收集乙 醇洗脱液。50-70°C减压浓缩，50-70°C干燥，得珍珠透骨草总黄酮提取物，得率为3. 2%。
[0034] 实施例4、干燥珍珠透骨草1. 0kg粉碎成粗粉（20目），用80 %乙醇（体积比）加 热回流提取2次，合并提取液，减压浓缩呈稠膏（相对密度1. 2, 70°C )，加600-800毫升水 搅拌，冷却沉淀。置离心机（1200-1600rad/min)沉降离心15-30分钟，取上清液备用。
[0035] 取大孔吸附树脂，按与生药重量比1 :1的比例装柱，将上述备用的上清液上样，先 用2-4倍柱体积去离子水洗脱，再用4-6倍柱体积20% -70%乙醇进行梯度洗脱，收集乙醇 洗脱液，50-70°C减压浓缩，50-70°C干燥，得珍珠透骨草总黄酮提取物，得率（重量比）为 3. 0%。
[0036] 1、珍珠透骨草总黄酮对α -糖苷酶活性的影响
[0037] 1. 1珍珠透骨草对α -葡萄糖苷酶抑制剂活性测定
[0038] 准确移取5ul底物、5ul样品、5ul的α -葡萄糖苷酶抑制剂依次加入96空板中， 将96空板置振荡器中37°C温育15分钟，取出后向96空板中准确移取葡萄糖测定试剂 180ul，再将96空板置振荡器中37°C温育15分钟，采用葡萄糖氧化酶法，用Benchmark酶标 仪（Bio-Rad)，在490nm波长下测定0D值，以葡萄糖的生成量，计算α -葡萄糖昔酶抑制活 性；阿卡波糖作为本法的阳性对照，同时设定空白对照是不加酶液和抑制剂，分别代之以缓 冲液和二甲基亚砜。由于粗提物本身有颜色，设阴性对照组.以缓冲液代替底物溶液，其余 操作同上。以上每个样品重复3次取平均值。
[0039] 酶活性抑制率（％ )计算：（阴性一样品V(阴性一空白）χ100%。
[0040] 1. 2珍珠透骨草对α -葡萄糖苷酶抑制剂实验结果
[0041] 珍珠透骨草总黄酮提取物不同萃取部位对α-葡萄糖苷酶抑制剂作用，与阿卡波 糖组相比有显著性差异（P〈〇. 001或P〈〇. 05)。结果见表1。
[0042] 表1为珍珠透骨草总黄酮提取物不同萃取部位对α -葡萄糖苷酶抑制剂的作用与 模型组相比 *Ρ〈〇· 05, *#Ρ〈0· 001
[0043]
【权利要求】
1. 珍珠透骨草总黄酮的制备方法，其特征在于： 包括以下步骤 步骤一、将珍珠透骨草于干燥箱中进行干燥脱去水分，将干燥后的珍珠透骨草粉碎，粉 碎的细度为10目?30目； 步骤二、继续步骤一的操作采用体积比为10%?90%的提取溶剂乙醇在室温25°C的 温控下浸渍两次，每次2天?15天，合并浸渍液，将浸渍液加热至70°进行回流提取两次， 合并提取液，将提取液在压力为lkpa?2. 67kpa条件下浓缩至相对密度为1. 2的呈稠膏状 的提取物； 步骤三、将步骤二中制得的生药加水并搅拌，生药与水的重量比为（1:6)?（1:8)，在 室温25°C的温控下冷却沉淀4小时，沉淀后于1200rad/min?1600rad/min的离心机内沉 降离心15分钟?30分钟，离心完毕后取上清液备用； 步骤四、纯化的柱材料为大孔吸附树脂，取大孔吸附树脂按照与生药的重量比为1 : (1?2)的比例装柱，将步骤三备用的上清液上样； 步骤五、继续上一步的操作，首先用2倍?4倍柱体积去离子水洗脱，再用4倍?6倍柱 体积乙醇进行梯度洗脱，其中乙醇的体积比20 %?80%，收集乙醇洗脱液，在50°?70°C 压力为lkpa?2. 67kpa条件下浓缩至相对密度为1. 2呈稠膏状的提取物，在50°?70°C 干燥，粉碎后得珍珠透骨草总黄酮提取物，得率重量比为2. 5%?3. 2%。
2. 根据权利要求1所述的珍珠透骨草总黄酮的制备方法，其特征在于：所述的步骤二 中提取溶剂为甲醇。
3. 根据权利要求1所述的珍珠透骨草总黄酮的制备方法，其特征在于：所述的步骤二 中提取方式为浸渍提取、超声提取或渗漉提取。
4. 根据权利要求1所述的珍珠透骨草总黄酮的制备方法，其特征在于：所述的步骤四 中纯化的柱材料为聚酰胺。
5. 根据权利要求1所述的珍珠透骨草总黄酮的制备方法，其特征在于：所述的步骤五 中采用稀乙醇洗脱去杂。
6. 根据权利要求1所述的珍珠透骨草总黄酮的制备方法，其特征在于：所述的 步骤五中粉碎后得珍珠透骨草总黄酮提取物，对该提取物采用紫外分光光度法，以 NaN02-Al (NO) 3-NaOH显色测定总黄酮含量，以芦丁计，黄酮类化合物的总含量不低于50%。
7. 珍珠透骨草总黄酮的应用，其特征在于：珍珠透骨草总黄酮在体外抑制糖苷酶，同 时对LPS刺激的脂多糖具有抗炎作用。
8. 珍珠透骨草总黄酮的应用，其特征在于：珍珠透骨草总黄酮于抗炎镇痛药物之中应 用。
【文档编号】A61K36/47GK104055830SQ201410323655
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年7月9日 优先权日:2014年7月9日
【发明者】张辉, 吴楠, 孙佳明, 刘冬, 郭晓庆 申请人:吉林鑫水科技开发有限公司
【专利摘要】本发明公开了珍珠透骨草总黄酮的制备方法及应用，属于从中药中提取制备总黄酮的方法领域。包括以下步骤：干燥珍珠透骨草粉碎，乙醇或甲醇回流提取，或浸渍提取，或超声提取，或渗漉提取，提取液减压浓缩，加水沉淀后离心，上清液上大孔树脂或聚酰胺柱，水或稀乙醇洗脱杂质后，乙醇梯度洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩干燥，得总黄酮。本发明中的总黄酮在体外抑制糖苷酶和对脂多糖诱导下RAW264.7细胞炎症模型的抗炎的作用，和用于治疗各种癌症以及适用于人体各系统、器官、组织各种炎性病变的抗炎镇痛以及创伤，手术，骨折，癌症等引起的疼痛。本发明效果显著有着广阔的推广应用前景。
【专利说明】珍珠透骨草总黄酮的制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于从中药中提取制备总黄酮的方法领域，特别是涉及到从珍珠透骨草中 制备总黄酮的方法，以及总黄酮在体外抑制糖苷酶和对脂多糖诱导下RAW264. 7细胞炎症 模型的抗炎的作用，和用于治疗各种癌症以及适用于人体各系统、器官、组织各种炎性病变 的抗炎镇痛以及创伤，手术，骨折，癌症等引起的疼痛。
【背景技术】
[0002] 珍珠透骨草 Speranskiatuberculata (Bunge) Baill.为大戟科 Euphorbiaceae 地 构叶属植物SperanskiaBaill.的干燥全草，是我国特有属。除了东部和西部，全国各省市 区都有野生。珍珠透骨草民间又称"气死大夫草"，具有祛风，除湿，舒筋，活血，止痛的功效， 用于风湿痹痛，筋骨挛缩，寒湿脚气，疮癣肿毒等症。
[0003] 据文献报道珍珠透骨草主要含有生物碱、黄酮、挥发油和留醇类成分，现代药理研 究发现其内的阿魏酸具抗炎作用。
[0004] 随着社会的越来越好的发展，炎症性疾病也越发的增多，因此新开发的抗炎药物 也由此而生，但使现在的抗炎药物仍然存在不良反应较大、安全性比较低等一些问题。所 以，开始寻找一种安全、有效的抗炎药物仍然是一个主要的问题要解决，以及如何选择合适 的模型，初步筛选抗炎作用的消炎药及其作用机制是要成为其中的一个重要课题。
[0005] 糖尿病是危害人类健康的重大疾病之一，在各种类型的糖尿病当中以2型糖尿病 的发病率较高。而阐明内源性低分子抑血糖物的化学本质是这一领域研究的核心问题。首 先，从植物中筛选出的活性化成分可作为化学治疗的补充，其次，小分子抑血糖物作用机理 的研究有助于对降血糖药物本质认识的深入及加强降血糖活性物质筛选的针对性。
[0006] 综上所述，本领域亟需要一种新的技术方案来解决这些问题。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是：提供了一种从珍珠透骨草中提取、制备总黄酮的 方法，以及根据该技术所得总黄酮提取物的体外抑制糖苷酶和对脂多糖诱导下RAW264. 7 细胞炎症模型的抗炎活性功能，和用于治疗各种糖尿病以及适用于人体各系统、器官、组织 各种炎性病变的抗炎镇痛以及创伤，手术，骨折，癌症等引起的疼痛。
[0008] 珍珠透骨草总黄酮的制备方法，其特征在于：
[0009] 包括以下步骤
[0010] 步骤一、将珍珠透骨草于干燥箱中进行干燥脱去水分，将干燥后的珍珠透骨草粉 碎，粉碎的细度为10目?30目；
[0011] 步骤二、继续步骤一的操作采用体积比为10%?90%的提取溶剂乙醇在室温 25°C的温控下浸渍两次，每次2天?15天，合并浸渍液，将浸渍液加热至70°进行回流提取 两次，合并提取液，将提取液在压力为lkpa?2. 67kpa条件下浓缩至相对密度为1. 2的呈 稠膏状的提取物；
[0012] 步骤三、将步骤二中制得的生药加水并搅拌，生药与水的重量比为（1:6)? (1:8)，在室温25°C的温控下冷却沉淀4小时，沉淀后于1200rad/min?1600rad/min的离 心机内沉降离心15分钟?30分钟，离心完毕后取上清液备用；
[0013] 步骤四、纯化的柱材料为大孔吸附树脂，取大孔吸附树脂按照与生药的重量比为 1 : (1?2)的比例装柱，将步骤三备用的上清液上样；
[0014] 步骤五、继续上一步的操作，首先用2倍?4倍柱体积去离子水洗脱，再用4倍? 6倍柱体积乙醇进行梯度洗脱，其中乙醇的体积比20%?80%，收集乙醇洗脱液，在50°? 70°C压力为lkpa?2. 67kpa条件下浓缩至相对密度为1.2呈稠膏状的提取物，在50°? 70°C干燥，粉碎后得珍珠透骨草总黄酮提取物，得率重量比为2. 5%?3. 2%。
[0015] 所述的步骤二中提取溶剂为甲醇。
[0016] 所述的步骤二中提取方式为浸渍提取、超声提取或渗漉提取。
[0017] 所述的步骤四中纯化的柱材料为聚酰胺。
[0018] 所述的步骤五中采用稀乙醇洗脱去杂。
[0019] 所述的步骤五中粉碎后得珍珠透骨草总黄酮提取物，对该提取物采用紫外分光光 度法，以NaN0 2-Al (NO) 3-NaOH显色测定总黄酮含量，以芦丁计，黄酮类化合物的总含量不低 于 50%。
[0020] 珍珠透骨草总黄酮的应用，其特征在于：珍珠透骨草总黄酮在体外抑制糖苷酶，同 时对LPS刺激的脂多糖具有抗炎作用。
[0021] 珍珠透骨草总黄酮的应用，其特征在于：珍珠透骨草总黄酮于抗炎镇痛药物之中 应用。
[0022] 通过上述设计方案，本发明可以带来如下有益效果：本发明针对现有技术当中存 在的不足之处，采用现代药效学研究方法对珍珠透骨草的有效成分进行筛选，确定了具有 体外抑制糖苷酶和对脂多糖诱导下RAW264. 7细胞炎症模型的抗炎活性的有效部位，进而 经过工艺研究确定了珍珠透骨草总黄酮的制备方法。经检索，珍珠透骨草的活性成分制备 方法多为有机溶剂直接冷浸、回流、超临界萃取等，尚未有对珍珠透骨草中黄酮类有效成分 有针对性的应用大孔树脂和聚酰胺等填料进行提取、制备方法的专利公布。
[0023] 珍珠透骨草总黄酮的含量测定方法及其质量要求为：采用紫外分光光度法，以 NaN02-Al (NO) 3-NaOH显色测定总黄酮含量，以芦丁计，黄酮类化合物的总含量不低于50%。
[0024] 本发明提供了一种从珍珠透骨草中提取、制备总黄酮的方法，以及根据该技术所 得总黄酮提取物的体外抑制糖苷酶和对脂多糖诱导下RAW264. 7细胞炎症模型的抗炎活性 功能，和用于治疗各种糖尿病以及适用于人体各系统、器官、组织各种炎性病变的抗炎镇痛 以及创伤，手术，骨折，癌症等引起的疼痛。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 下面结合【专利附图】
【附图说明】和【具体实施方式】对本发明作进一步说明：
[0026] 图1为本发明的珍珠透骨草不同萃取部位抗炎图谱。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合实例对本发明进行详细描述。但是，本发明不局限于所给出的这些实例。
[0028] 实施例1、干燥珍珠透骨草1. 0kg粉碎成粗粉（20目），用80 %乙醇（体积比）冷 浸两次，每次15天，合并浸渍液，减压浓缩呈稠膏（相对密度1. 2, 70°C )，加600-800毫升 水搅拌，冷却沉淀。置离心机（1200-1600rad/min)沉降离心15-30分钟，取上清液备用。
[0029] 取大孔吸附树脂，按与生药重量比1 :2的比例装柱，将上述备用的上清液上样， 先用2-4倍柱体积去离子水洗脱，再用4-6倍柱体积20% -60%乙醇（体积比）进行梯度 洗脱，收集乙醇洗脱液，50-70°C减压浓缩，50-70°C干燥，得珍珠透骨草总黄酮提取物，得率 (重量比）为2. 7%。
[0030] 实施例2、干燥珍珠透骨草1. 0kg粉碎成粗粉（20目），用80%甲醇（体积比）冷 浸两次，每次15天，合并浸渍液，减压浓缩呈稠膏（相对密度1. 2, 70°C )，加600-800毫升 水搅拌，冷却沉淀。置离心机（1200-1600rad/min)沉降离心15-30分钟，取上清液备用。
[0031] 取聚酰胺，按与生药重量比1 :1的比例装柱，将上述备用的上清液上样，先用2-4 倍柱体积去离子水洗脱，再用4-6倍柱体积20% -80%乙醇进行梯度洗脱，收集乙醇洗脱 液，50-70°C减压浓缩，50-70°C干燥，得珍珠透骨草总黄酮提取物，得率为2. 5%。
[0032] 实施例3、干燥珍珠透骨草1. 0kg粉碎成粗粉（20目），用60 %乙醇（体积比）浸 渍48小时后，渗漉提取，渗漉至流出液色浅，黄酮反应不明显为止，减压浓缩呈稠膏（相对 密度1. 2, 70°C )，加600-800毫升水搅拌，冷却沉淀。置离心机（1200-1600rad/min)沉降 离心15-30分钟，取上清液备用。
[0033] 取大孔吸附树脂，按与生药重量比1 :1的比例装柱，将上述各用的上清液上样，先 用2-4倍柱体积去离子水洗脱，再用4-6倍柱体积30% -80%乙醇进行梯度洗脱.收集乙 醇洗脱液。50-70°C减压浓缩，50-70°C干燥，得珍珠透骨草总黄酮提取物，得率为3. 2%。
[0034] 实施例4、干燥珍珠透骨草1. 0kg粉碎成粗粉（20目），用80 %乙醇（体积比）加 热回流提取2次，合并提取液，减压浓缩呈稠膏（相对密度1. 2, 70°C )，加600-800毫升水 搅拌，冷却沉淀。置离心机（1200-1600rad/min)沉降离心15-30分钟，取上清液备用。
[0035] 取大孔吸附树脂，按与生药重量比1 :1的比例装柱，将上述备用的上清液上样，先 用2-4倍柱体积去离子水洗脱，再用4-6倍柱体积20% -70%乙醇进行梯度洗脱，收集乙醇 洗脱液，50-70°C减压浓缩，50-70°C干燥，得珍珠透骨草总黄酮提取物，得率（重量比）为 3. 0%。
[0036] 1、珍珠透骨草总黄酮对α -糖苷酶活性的影响
[0037] 1. 1珍珠透骨草对α -葡萄糖苷酶抑制剂活性测定
[0038] 准确移取5ul底物、5ul样品、5ul的α -葡萄糖苷酶抑制剂依次加入96空板中， 将96空板置振荡器中37°C温育15分钟，取出后向96空板中准确移取葡萄糖测定试剂 180ul，再将96空板置振荡器中37°C温育15分钟，采用葡萄糖氧化酶法，用Benchmark酶标 仪（Bio-Rad)，在490nm波长下测定0D值，以葡萄糖的生成量，计算α -葡萄糖昔酶抑制活 性；阿卡波糖作为本法的阳性对照，同时设定空白对照是不加酶液和抑制剂，分别代之以缓 冲液和二甲基亚砜。由于粗提物本身有颜色，设阴性对照组.以缓冲液代替底物溶液，其余 操作同上。以上每个样品重复3次取平均值。
[0039] 酶活性抑制率（％ )计算：（阴性一样品V(阴性一空白）χ100%。
[0040] 1. 2珍珠透骨草对α -葡萄糖苷酶抑制剂实验结果
[0041] 珍珠透骨草总黄酮提取物不同萃取部位对α-葡萄糖苷酶抑制剂作用，与阿卡波 糖组相比有显著性差异（P〈〇. 001或P〈〇. 05)。结果见表1。
[0042] 表1为珍珠透骨草总黄酮提取物不同萃取部位对α -葡萄糖苷酶抑制剂的作用与 模型组相比 *Ρ〈〇· 05, *#Ρ〈0· 001
[0043]
【权利要求】
1. 珍珠透骨草总黄酮的制备方法，其特征在于： 包括以下步骤 步骤一、将珍珠透骨草于干燥箱中进行干燥脱去水分，将干燥后的珍珠透骨草粉碎，粉 碎的细度为10目?30目； 步骤二、继续步骤一的操作采用体积比为10%?90%的提取溶剂乙醇在室温25°C的 温控下浸渍两次，每次2天?15天，合并浸渍液，将浸渍液加热至70°进行回流提取两次， 合并提取液，将提取液在压力为lkpa?2. 67kpa条件下浓缩至相对密度为1. 2的呈稠膏状 的提取物； 步骤三、将步骤二中制得的生药加水并搅拌，生药与水的重量比为（1:6)?（1:8)，在 室温25°C的温控下冷却沉淀4小时，沉淀后于1200rad/min?1600rad/min的离心机内沉 降离心15分钟?30分钟，离心完毕后取上清液备用； 步骤四、纯化的柱材料为大孔吸附树脂，取大孔吸附树脂按照与生药的重量比为1 : (1?2)的比例装柱，将步骤三备用的上清液上样； 步骤五、继续上一步的操作，首先用2倍?4倍柱体积去离子水洗脱，再用4倍?6倍柱 体积乙醇进行梯度洗脱，其中乙醇的体积比20 %?80%，收集乙醇洗脱液，在50°?70°C 压力为lkpa?2. 67kpa条件下浓缩至相对密度为1. 2呈稠膏状的提取物，在50°?70°C 干燥，粉碎后得珍珠透骨草总黄酮提取物，得率重量比为2. 5%?3. 2%。
2. 根据权利要求1所述的珍珠透骨草总黄酮的制备方法，其特征在于：所述的步骤二 中提取溶剂为甲醇。
3. 根据权利要求1所述的珍珠透骨草总黄酮的制备方法，其特征在于：所述的步骤二 中提取方式为浸渍提取、超声提取或渗漉提取。
4. 根据权利要求1所述的珍珠透骨草总黄酮的制备方法，其特征在于：所述的步骤四 中纯化的柱材料为聚酰胺。
5. 根据权利要求1所述的珍珠透骨草总黄酮的制备方法，其特征在于：所述的步骤五 中采用稀乙醇洗脱去杂。
6. 根据权利要求1所述的珍珠透骨草总黄酮的制备方法，其特征在于：所述的 步骤五中粉碎后得珍珠透骨草总黄酮提取物，对该提取物采用紫外分光光度法，以 NaN02-Al (NO) 3-NaOH显色测定总黄酮含量，以芦丁计，黄酮类化合物的总含量不低于50%。
7. 珍珠透骨草总黄酮的应用，其特征在于：珍珠透骨草总黄酮在体外抑制糖苷酶，同 时对LPS刺激的脂多糖具有抗炎作用。
8. 珍珠透骨草总黄酮的应用，其特征在于：珍珠透骨草总黄酮于抗炎镇痛药物之中应 用。
【文档编号】A61K36/47GK104055830SQ201410323655
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年7月9日 优先权日:2014年7月9日
【发明者】张辉, 吴楠, 孙佳明, 刘冬, 郭晓庆 申请人:吉林鑫水科技开发有限公司
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