具有超声造影功能的空心介孔普鲁士蓝纳米光热诊疗剂及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种具有超声造影功能的空心介孔普鲁士蓝纳米光热诊疗剂及其制备方法，所述空心介孔普鲁士蓝纳米光热诊疗剂包括表面具有介孔、内部空心的普鲁士蓝纳米颗粒，以及装载于所述普鲁士蓝纳米颗粒中的温敏型相变材料，其中，所述温敏型相变材料包括氟碳化合物和/或薄荷醇。
【专利说明】具有超声造影功能的空心介孔普鲁士蓝纳米光热诊疗剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及纳米材料【技术领域】和生物医学材料领域，具体涉及一种具有超声造影功能和肿瘤光热治疗的空心介孔普鲁士蓝纳米诊疗剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002]肿瘤的早期诊断与治疗一直是医学界的难题和研宄热点，特别是兼诊断和监控、治疗等功能为一体的关键科学技术研宄更是科学界关注的热点。超声成像(US)具有通透性强，非侵入性，易于操作和实时成像等特点，在医学影像上具有广泛应用。临床上使用的第三代超声造影剂是以含氟气体为内核的微泡造影剂，提高了微泡造影剂对超声信号的敏感性，增强了超声造影效果。但由于微泡较大的尺寸以及在血液循环中较差的稳定性，因此临床上急需寻找性能优异并且更稳定的超声造影剂。目前一类液态氟烷纳米粒/乳剂纳米造影剂以其分子小、穿透力强的突出特性，引起了极大关注。
[0003]长期以来，医学界一直没有停止过尝试使用热能来治疗癌症的研宄。热疗是一种借助仪器(例超声、微波、射频等)，将人体某个部位或器官的温度升高而局部杀死肿瘤的治疗方法。但这种方式存在的“热传递的非专属性”容易造成肿瘤周围正常的组织器官损伤。因此，目前癌症临床治疗中，热疗更多的是作为一种辅助治疗手段，与化放疗联合使用，以增强癌细胞对放化疗的敏感性，提升癌症治疗效果。
[0004]纳米技术的快速发展为“专属性的热传递”提供了可能。例如，近年来一种基于纳米载体的新颖的光热治疗技术引起了广泛的关注。在光热治疗中，将具有近红外光热转换功能的纳米材料运输到肿瘤部位，然后仅对肿瘤区域局部实施近红外光照，使肿瘤处产生局部超高温度，从而轻易地将肿瘤细胞杀死。这种近红外光介导的热量肿瘤靶向传递，保证了治疗中不会对正常组织造成损伤，显著提高了热疗的安全性与有效性。光热治疗最大特点是从理论上实现了对几乎所有实体肿瘤的有效治疗，包括对放化疗失败和产生耐药性肿瘤的高效治疗。同时，光热治疗不会产生放化疗伴随的毒副作用而导致患者生存质量的下降。这种治疗技术的一个重要前提就是研发一种在近红外区域具有超强吸收以及高的光热转化效率、良好生物相容性和安全性的光热转换材料。
[0005]目前所研宄的光热转换材料主要有金纳米棒、碳基材料(碳纳米管和石墨烯)、铜的氧族化物、过渡金属氧族化合物以及一些有机化合物。这些光热材料在体外及动物体内光热治疗中都具有独特的优势，人们也做了大量工作评价其生物安全性。但由于缺少人体临床试验，这些材料在复杂的人体环境中的安全性仍待考宄。因此在临床上，它们的生物安全性依然是难以逾越的瓶颈。普鲁士蓝(PB)是一种古老的的蓝色染料，并且是临床上的解毒剂。PB在近红外区具有较强的吸收，其摩尔消光系数与纳米金处于同一个数量级，比碳纳米管、硫化铜等光热转换剂要高2?3个数量级。但纳米金棒在近红外光循环照射下，容易发生聚集等，使其吸收峰发生变化，光热稳定性差，而PB具有良好的光热转换稳定性。因此，基于普鲁士蓝纳米材料的光热转换剂具有巨大的应用前景。目前基于普鲁士蓝纳米材料同时实现超声造影和光热治疗的纳米诊疗剂的研宄还未见报道，有待进一步研宄。
【发明内容】
[0006]本发明旨在进一步拓展现有光热诊疗剂的功能，本发明提供了一种具有超声造影功能和肿瘤光热治疗的空心介孔普鲁士蓝纳米诊疗剂(HMPB)及其制备方法。
[0007]本发明提供了一种空心介孔普鲁士蓝纳米光热诊疗剂，所述空心介孔普鲁士蓝纳米光热诊疗剂包括表面具有介孔、内部空心的普鲁士蓝纳米颗粒，以及装载于所述普鲁士蓝纳米颗粒中的温敏型相变材料，其中，所述温敏型相变材料包括氟碳化合物(全氟戊烷和/或全氟己烷)和/或薄荷醇等。
[0008]较佳地，所述空心介孔普鲁士蓝纳米光热诊疗剂的表面带负电荷，普鲁士蓝纳米颗粒粒径范围为100?lOOOnm，普鲁士蓝纳米颗粒外壳的厚度范围为10?lOOnm，普鲁士蓝纳米颗粒表面具有微孔和介孔，其中微孔的大小为0.5?2nm，介孔的大小为3.2?30nmo
[0009]较佳地，在所述空心介孔普鲁士蓝纳米光热诊疗剂中，空心普鲁士蓝纳米颗粒的质量分数为97% -99.0%，氟碳化合物温敏型相变材料和/或薄荷醇的质量分数为1.0% -3%。
[0010]较佳地，所述空心介孔普鲁士蓝纳米光热诊疗剂在近红外光区域λ =650-970nm,实现光热转换。
[0011]又，本发明还提供了一种上述空心介孔普鲁士蓝纳米光热诊疗剂的制备方法，所述制备方法包括:
1)将0.132?0.396份铁氰化钾和2?10份聚乙烯吡咯烷酮加入到酸中，磁搅拌至得到澄清混合液，然后将澄清混合液转至烘箱中，在60-100°C陈化，冷却后分离、洗涤，得到所述具有介孔的普鲁士蓝纳米颗粒；
2)将表面具有介孔的普鲁士蓝纳米颗粒分散于酸中，在120?140°C陈化后，分离得到表面具有介孔、内部空心的普鲁士蓝纳米颗粒；
3)采用真空灌注法将氟碳化合物温敏型相变材料和/或薄荷醇注入步骤2)制备的表面具有介孔、内部空心的普鲁士蓝纳米颗粒中，制备得到所述空心介孔普鲁士蓝纳米光热诊疗剂。
[0012]较佳地，步骤I)中，酸的量为30-100份，酸为0.01-2M的盐酸，陈化时间为12-20小时。
[0013]较佳地，步骤2)中，使用的酸为浓度1-2M的盐酸，陈化时间为2-4小时。
[0014]较佳地，步骤3)中，真空灌注法为在真空度为500— 5000Pa下进行冰水浴、超声。
[0015]本发明的有益效果:
本发明的基于HMPB的纳米诊疗剂具有优异的光热转换性能，产生显著的超声成像信号以实时监控肿瘤状态。因此，它解决了传统肿瘤光热治疗中热量在肿瘤内部分布不均对肿瘤消融不完全，导致肿瘤易于复发、化疗毒副作用大等临床应用难题，同时实现了肿瘤治疗的实时监控，为肿瘤的安全与高效治疗提供了新技术和新的理论基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1示出了本发明中HMPB-PCM纳米诊疗剂的一个制备流程图；
图2分别示出了本发明的实施例一中制备的MPB的透射电镜图(a)、HMPB的透射电镜图(b)、HMPB的电子衍射图(c)以及HMPB的扫描电镜图⑷；
图3a示出了实施例五中不同浓度的HMPB在近红外光区域附近的紫外?可见吸收曲线；
图3b示出了实施例6中在波长808nm、功率密度为5W/cm2的激光照射下，不同浓度的HMPB的PBS溶液时间与温度关系曲线；
图3c示出了实施例七中Hela细胞在不同浓度的HMPB的培养基中培养后，经过波长808nm、功率密度为5W/cm2的激光照射5min后的热疗效果；
图3d分别示出了实施例八中激光共聚焦显微镜(CLSM)观察到的细胞状态(dl钙黄绿素染色的荧光成像结果，d2是碘化吡啶染色的荧光成像结果)、实施例九中CLSM结果(d3显示妈黄绿素染色后的细胞的荧光，d4为碘化吡啶染色后的细胞的荧光)、实施例十中CLSM结果(d5显示钙黄绿素染色后的细胞的荧光，d6为碘化吡啶染色后的细胞的荧光)；图4示出了实施例^^一中ΗΜΡΒ-ΡΠ1在20°C体外超声成像实验效果(a)和在42.5°C体外超声成像实验效果(b);
图5分别示出了实施例十三中体外超声成像实验，单纯PBS溶液在塑料滴管中的超声成像效果(a)、实施例十四中HMPB-PFP在20°C体外超声成像实验效果图(b)、实施例十五中HMPB-PFP在42.5°C体外超声成像实验效果图(c)、实施例十六中HMPB-PFP体内超声成像实验，未做任何处理的肿瘤处超声成像结果(d)、实施例十六中HMPB-PFP体内超声成像实验，注射实施例三中制备的HMPB纳米诊疗剂之后的肿瘤处超声成像结果(e)、以及实施例十六中HMPB-PFP体内超声成像实验，注射实施例三中制备的HMPB-PFP纳米诊疗剂之后，用波长808nm，功率密度为2W/cm2的激光照射后的肿瘤处超声成像结果；
图6示出了本发明的一个实施方式中制备的MPB的HMPB的透射电镜图。
【具体实施方式】
[0017]以下结合附图和下述实施方式进一步说明本发明，应理解，附图及下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。
[0018]本发明针对现有光热转换材料及超声造影剂在临床应用上的瓶颈，利用具有良好生物相容性和生物安全性的HMPB装载温敏型PCM，形成一种具有超声造影功能和光热治疗肿瘤的新型诊疗系统。
[0019]本发明涉及一种基于空心介孔纳米颗粒在超声成像及光热治疗肿瘤方面应用的超声纳米诊疗剂及其制备方法。所述的纳米诊疗剂由具有优异光热转换性能的单一组分形成的空心介孔纳米粒子作为载体，装载温敏型PCM。本发明的纳米诊疗剂基于HMPB，通过真空灌注方法装入疏水性氟碳化合物等温敏型PCM。
[0020]本发明的HMPB是由单一组分的普鲁士蓝组成，具有优异的光热转换性能(近红外区域具有强的吸收，高的光热转换效率以及光热稳定性)。高分散，尺寸均一可控的HMPB纳米粒子制备方法简便，原料价格低廉，具有良好的光热转换性能以及良好的生物相容性以及生物安全性。HMPB外壳在近红外光区域具有强的吸收，高的光热转换效率。在近红外光的照射下，使病变组织处温度达到42.5°C以上，从而杀死肿瘤细胞。同时，PCM在该温度下发生液-气相变产生大量气泡，并从HMPB外壳层的介孔孔道中持续释放，稳定有效地增强超声成像造影，可用于肿瘤的治疗以及实时监测。
[0021]所述的纳米诊疗剂其表面带有负电荷，HMPB (外壳)粒径范围为100?100nm可控，外壳壳层的厚度范围为10?10nm可控，孔径大小范围为微孔:0.5?2nm可控；介孔大小为3.2?30nm可控。本发明的空心介孔纳米材料由于具有大的空腔结构(空心立方体)，可以装载大量的客体分子有望用于超声造影。其空心介孔结构可以作为药物载体，实现对肿瘤化疗和热疗协同治疗，最终形成超声造影和治疗的诊疗系统。
[0022]氟碳化合物包括疏水性的全氟戊烷(PFP)、全氟己烷(PFH)等。本发明的超声造影的客体分子为温敏型PCM，包括全氟己烷(PFH)和全氟戊烷(PFP)。采用真空灌注法将客体分子装载进入HMPB的空腔，该方法简便、易行。
[0023]所述的纳米诊疗剂在近红外光区域(λ = 650-970nm)具有强的吸收，高的光热转换效率。
[0024]本发明的纳米诊疗剂基于HMPB，内装有疏水性的PFP、PFH等温敏型PCM。本发明的纳米诊疗剂在近红外区域具有优异的光热转化性能，通过吸收近红外光，并高效地转换成热能，使肿瘤部位温度升高，足够有效杀死肿瘤细胞。同时，内部氟碳化合物等温敏型PCM吸热发生液-气相变，产生的气泡具有良好的超声造影诊断功能以及空化效应。本发明实现了肿瘤的诊疗一体化，大大提高了肿瘤的治疗效果，为临床化应用建立了基础，得到一种集超声成像诊断和光热治疗为一体的纳米诊疗剂。解决了传统肿瘤光热治疗中热量在肿瘤内部分布不均导致的肿瘤易于复发、化疗毒副作用大等临床应用难题，为肿瘤的安全与高效治疗提供了新技术和新的理论基础。
[0025]本发明的基于HMPB的纳米诊疗剂还包括装载抗肿瘤药物和基因等。空心介孔结构可以实现对抗肿瘤药物和基因的包覆和传输，达到化疗和热疗协同作用效果，同时具有超声造影功能。所述抗肿瘤药物和基因包括但不限于盐酸阿霉素、紫杉醇、伊立替康、阿柔比星、奥沙利铂、米托蒽醌、长春新碱等纳米药物中的一种或者两种及两种以上的混合物。
[0026]本发明提供了一种原料价格低廉易得、制备方法简单、易于批量生产的方法制备出具有良好分散性和稳定性、良好生物相容性、粒径和孔径可控、优异光热转换性能、明显的超声造影性能以及对肿瘤进行光热治疗的多功能纳米诊疗剂。
[0027]本发明的基于HMPB的纳米诊疗剂具有优异的光热转换性能，产生显著的超声成像信号以实时监控肿瘤状态。因此，它解决了传统肿瘤光热治疗中热量在肿瘤内部分布不均导致的肿瘤易于复发、化疗毒副作用大等临床应用难题，同时实现了肿瘤治疗的实时监控，为肿瘤的安全与高效治疗提供了新技术和新的理论基础；
本发明的基于HMPB的纳米诊疗剂的制备原料价格低廉易得，制备方法简单，易于批量生产。
[0028]本发明还提供了一种制备所述诊疗剂的方法，包括:以铁氰化钾为原料制备空心介孔普鲁士蓝纳米立方体(HMPB)壳层，用真空灌注法装载氟碳化合物液滴等温敏型相变材料(PCM)。
[0029]具体为:
步骤A)将132?396mg的铁氰化钾和2?1g的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)加入到30?10mL浓度为的0.01?2M盐酸中，磁搅拌至得到澄清混合溶液； 步骤B)将混合液转至80°C的烘箱中，陈化12?20h取出，冷却至室温，离心分离，去离子水洗数次，溶于20?50mL浓度为I?2M的盐酸中待用；
步骤C)将20mL上述溶液转移至水热釜，置于电炉中，120?140°C陈化2?4h，取出冷却至室温，离心分离，去离子水洗数次，冷冻干燥；
步骤D)将制备的20?50mg HMPB于5mL胶塞小瓶中，密封抽真空并保持一定真空度。用注射器注入100?150 μ L温敏型PCM，冰水浴中超声2min使PCM充分装入HMPB立方体的空腔中，得到纳米诊疗剂HMPB-PCM。
[0030]参见图1，其示出本发明的具有超声造影功能的空心介孔普鲁士蓝纳米光热诊疗剂的制备流程。
[0031]首先，采用水热法一步合成介孔普鲁士蓝纳米粒子，可通过调节其pH以及原料的量对其尺寸，孔道结构进行调整。
[0032]运用表面保护，内部刻蚀的方法，制备空心介孔普鲁士蓝纳米载体:以具有良好生物相容性的PVP作为保护剂，通过与介孔普鲁士蓝纳米粒子混合搅拌，在其表面形成一层保护层。在水热的条件下，H+可以通过保护层进入介孔普鲁士蓝纳米粒子内部，对其进行刻蚀。将产物收集后充分洗涤，真空干燥，最终得到空心介孔普鲁士蓝纳米载体。
[0033]然后在步骤D，采用真空灌注法装载温敏型PCM，得到具有超声造影功能的空心介孔普鲁士蓝纳米光热诊疗剂HMPB-PCM。大致过程可如下所示:将制备的HMPB经过一定的预处理(例如溶解，脱气)，于5mL胶塞小瓶中，密封抽真空并保持一定真空度。用注射器注入一定量(例如100?150 μ L)的温敏型PCM，冰水浴中超声分散一定时间(例如2min)，使PCM充分装入HMPB立方体的空腔中，得到纳米诊疗剂HMPB-PCM。选择生物相容性良好的温敏型PCM(PFP，PFH)作为客体分子。在近红外光的照射下，HMPB吸收近红外光，将其高效地转换为热量，使温度达到一定温度(> 42.50C )，对肿瘤进行光热治疗。同时，温敏型PCM发生相变，由超疏水性的液相转变为高弹性的氟碳气泡，并从载体的介孔孔道中缓慢、持续地释放，稳定有效地增强超声成像。应理解，示出的温敏型PCM不仅仅局限于PFP，PHL
[0034]此外还可以对纳米诊疗剂进行PBS溶液的封装，可以配制成不同浓度的溶液。制备HMPB后，装载不同相变温度、超声敏感特性的良好生物相容性的温敏型PCM(PFP，PFH)，优赋予具优异的光热转换性能以及热稳定性的空心介孔普鲁士蓝纳米载体材料优良的超声敏感特性。
[0035]本发明中，普鲁士蓝外壳能有效吸收近红外光，具有较高的光热转化效率。HMPB外壳产生的热能有效杀死肿瘤细胞并使壳层内部温敏型PCM发生液-气相变。PCM产生的气泡具有良好的超声造影效果以及空化效应。本发明制备过程简单，原料成本低廉，诊疗剂具有良好的生物相容性和生物安全性，在生物医药领域具有潜在的临床应用前景。
[0036]下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
[0037]实施例一
称量132mg铁(III)氰化钾和3g聚乙烯基吡咯烷酮K?30 (PVP)于40mL0.0lM的盐酸中，搅拌30min使充分溶解形成黄色透明溶液，置于80°C烘箱中反应20h。11000r/min离心lOmin，水洗一次，得到介孔普鲁士蓝纳米粒子(MPB)。MPB溶于20mLlM的盐酸中分散均匀，140°C水热刻蚀4h，11000r/min离心lOmin，水洗一次，得到空心介孔普鲁士蓝(HMPB)干燥备用。制备的HMPB刻蚀前后透射电镜图及HMPB扫描电镜图如图2所示；
由图2中(a)可见，制备的介孔普鲁士蓝纳米立方体具有良好的分散性，粒径较均匀，在100?500nm。用IM的盐酸刻蚀后，形成空心结构，其粒径基本保持不变，分散性良好，空心结构的壳层壁厚为10?lOOnm。图2中(c)显示空心介孔普鲁士蓝纳米立方体为单晶结构。由扫描电镜图可看出，HMPB表面有一些大小不等的介孔。
[0038]实施例二
称量132mg铁(III)氰化钾和3g PVP于40mL0.1M的盐酸中，搅拌30min使充分溶解形成黄色透明溶液，置于80°C烘箱中反应20h。11000r/min离心lOmin，水洗一次，得到介孔普鲁士蓝纳米粒子，溶于20mLlM的盐酸中分散均匀，140°C水热刻蚀4h，11000r/min离心lOmin，水洗一次，得到空心介孔普鲁士蓝。
[0039]实施例三
称取实施例一中制备的HMPB50mg于5mL胶塞小瓶中，密封抽真空并保持一定真空度。用注射器注入150 μ L PFP，冰水浴中超声2min使PFP充分装入HMPB的空腔中，得到纳米诊疗剂HMPB-PFP。将HMPB-PFP分散于1mL PBS中，冰水浴中保存备用。
[0040]实施例四
称取实施例一中制备的HMPB50mg于5mL胶塞小瓶中，密封抽真空并保持一定真空度。用注射器注入150 μ L PFH,冰水浴中超声2min使Ρ--充分装入HMPB的空腔中，得到纳米诊疗剂HMPB-PHL将HMPB-Pi7H分散于1mL PBS中，冰水浴中保存备用。
[0041]实施例五
把实施例一中得到的HMPB分散于PBS中，浓度分别为，12.5ppm、25ppm、50ppm、lOOpprn、200ppm，用紫外可见分光光度计测其在近红外光处的吸收峰，如图3 (a)所示。可以看出，所制备的材料在近红外光区域有较强较宽的吸收峰，在710nm左右最强，并且随浓度增加吸收越来越强。
[0042]实施例六
取实施例三中得到的多份HMPB-PFP分别散于PBS中，25ppm、50ppm、100ppm、200ppm的溶液各ImL于石英比色皿中，功率密度为5W/cm2，波长为808nm激光辐照lOmin，记录溶液在不同时间点的温度如图3(b)所示，随辐照时间的增加，溶液温度逐渐升高，而且浓度越高，升温速率越快，200ppm时，辐照十分钟可以升到35°C，说明HMPB具有优异的光热转换性能。
[0043]实施例七
将实施例一中制备的HMPB在紫外灯光下辐照过夜进行灭菌，用含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液配制成0ppm、12.5ppm、25ppm、50ppm、10ppm浓度，用噻挫蓝(MTT)法评价不同浓度材料对细胞的热疗效果。人宫颈癌(Hela)细胞以IXlO4接种到96孔板中，在37°C、含5% 0)2的培养箱中培养12小时使细胞贴壁。以每孔10uL的量加入不同浓度HMPB的细胞培养液到96孔板中培养4小时后，用808nm激光5W/cm2下辐照5min继续培养20h，倒掉上层培养液，每孔加入MTT的DMEM培养液(0.5?lmg/mL)各100 μ L培养4h。最后除去MTT的培养液加入100 μ L DMSO,轻轻摇晃后在酶标仪上测其在490nm吸光度。热疗效果用Oppm细胞活力的百分比表示，如图3(c)。可以看出随HMPB浓度增大，激光辐照后，细胞存活率逐渐变低，即对细胞的杀伤力越来越强。
[0044]实施例八
将Hela细胞以5X 15的数量接种到共聚焦皿中，在37°C、含5% CO 2的培养箱中培养12小时使细胞贴壁。倒掉共聚焦皿中的培养基，继续加入ImL DMEM细胞培养液培养4h，作为对照组，用钙黄绿素和碘化吡啶染色，激光共聚焦显微镜(CLSM)进行观察。钙黄绿素用来染活细胞，CLSM观察为绿色，碘化吡啶用来染凋亡和坏死的细胞，CLSM观察呈现红色。如图3d中(dl)、图3d中(d2)所示，未做任何处理的细胞只有极少数凋亡和坏死。
[0045]实施例九
将Hela细胞以5 X 15分别接种到共聚焦皿中，在37°C、含5% CO 2的培养箱中培养12小时使细胞贴壁。培养基，加入ImL浓度为50ppm的HMPB的DMEM细胞培养液培养4h，用808nm激光5W/cm2下福照5min后，用1?黄绿素和碘化卩比啶染色，CLSM进行观察。如图3d中(d3)-(d4)所示，有部分细胞凋亡和坏死。
[0046]实施例十
将Hela细胞以5 X 15分别接种到共聚焦皿中，在37°C、含5% CO 2的培养箱中培养12小时使细胞贴壁。共聚焦皿中的培养基，加入ImL浓度为50ppm的HMPB的DMEM细胞培养液培养4h，用808nm激光5W/cm2下分别福照1min后，用1?黄绿素和碘化卩比啶染色，CLSM进行观察。如图3d中(d5)-(d6)所示，随激光辐照时间增加，越来越多细胞出现凋亡和坏死。
[0047]实施例^^一
将实施例三中制备的HMPB-Pra的配成2mg/mL的PBS溶液3mL置于塑料滴管中在20°C脱气水中，B模式，机械指数为0.8时观察超声成像效果，如图4中(a)，装有PHl的HMPB在室温(20°C )能产生少量气泡，具有微弱超声成像功能。
[0048]实施例十二
将实施例三中制备的HMPB-Pra的配成2mg/mL的PBS溶液3mL置于塑料滴管中在42.5°C脱气水中，B模式，机械指数为0.8时观察超声成像效果，如图4中(b)，在42.5°C时可以产生大量气泡，图像变亮，具有显著的超声造影效果。
[0049]实施例十三
将PBS3mL置于塑料滴管中，在脱气水中，B模式，机械指数为0.8时观察超声成像效果，如图5中(a)所示，单纯PBS溶液几乎观察不到超声成像信号。
[0050]实施例十四
将实施例三中制备的HMPB-PFP的配成2mg/mL的PBS溶液3mL置于塑料滴管中在20°C脱气水中，B模式，机械指数为0.8时观察超声成像效果，如图5中(b)，装有PFP的材料HMPB在室温(20°C )能产生少量气泡，具有一定超声造影功能。
[0051]实施例十五
将实施例三中制备的HMPB-PFP的配成2mg/mL的PBS溶液3mL置于塑料滴管中在42.5°C脱气水中，B模式，机械指数为0.8时观察超声成像效果，如图5中(C)，在42.5°C时可以产生大量气泡，具有显著的超声造影效果。
[0052]实施例十六
将种有Hela肿瘤的的裸鼠进行麻醉，B模式机械指数为0.8观察未注射HMPB-PFP的PBS溶液肿瘤的状态如图5中(d)。注射实施例三中制备的HMPB-PFP的2mg/mL的PBS溶液30uL后用B模式下机械指数为0.8观察肿瘤处成像效果如图5中(e)。然后注射HMPB-PFP的肿瘤处用808nm激光2W/cm2福照5min，在B模式机械指数为0.8观察肿瘤的状态如图5中(f)所示。如图5所示，体内实验中，注射HMPB-PFP之前肿瘤区域观察不到成像效果，注入HMPB-PFP之后有微弱超声成像，当用808nm激光照射后有显著超声信号增强，说明制备的纳米诊疗剂具有显著的超声造影功能。
【权利要求】
1.一种空心介孔普鲁士蓝纳米光热诊疗剂，其特征在于，所述空心介孔普鲁士蓝纳米光热诊疗剂包括表面具有介孔、内部空心的普鲁士蓝纳米颗粒，以及装载于所述普鲁士蓝纳米颗粒中的温敏型相变材料，其中，所述温敏型相变材料包括氟碳化合物和/或薄荷醇。
2.根据权利要求1所述的空心介孔普鲁士蓝纳米光热诊疗剂，其特征在于，所述氟碳化合物包括全氟戊烷和/或全氟己烷。
3.根据权利要求1或2所述的空心介孔普鲁士蓝纳米光热诊疗剂，其特征在于，所述空心介孔普鲁士蓝纳米光热诊疗剂的表面带负电荷，普鲁士蓝纳米颗粒粒径范围为100-1000nm，普鲁士蓝纳米颗粒外壳的厚度范围为10-100 nm，普鲁士蓝纳米颗粒表面具有微孔和介孔，其中微孔的大小为0.5-2 nm，介孔的大小为3.2-30 nm。
4.根据权利要求1-3中任一所述的空心介孔普鲁士蓝纳米光热诊疗剂，其特征在于，在所述空心介孔普鲁士蓝纳米光热诊疗剂中，空心普鲁士蓝纳米颗粒的质量分数为97%-99.0%，氟碳化合物温敏型相变材料和/或薄荷醇的质量分数为1.0%-3%。
5.根据权利要求1一4中任一所述的空心介孔普鲁士蓝纳米光热诊疗剂，其特征在于，所述空心介孔普鲁士蓝纳米光热诊疗剂在近红外光区域λ = 650-970 nm，实现光热转换。
6.—种权利要求1-5中所述空心介孔普鲁士蓝纳米光热诊疗剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括: 1)将0.132-0.396份铁氰化钾和2_10份聚乙烯吡咯烷酮加入到酸中，磁搅拌至得到澄清混合液，然后将澄清混合液转至烘箱中，在60-100°C陈化，冷却后分离、洗涤，得到所述具有介孔的普鲁士蓝纳米颗粒； 2)将表面具有介孔的普鲁士蓝纳米颗粒分散于酸中，在120-140°C陈化后，分离得到表面具有介孔、内部空心的普鲁士蓝纳米颗粒； 3)采用真空灌注法将氟碳化合物温敏型相变材料和/或薄荷醇注入步骤2)制备的表面具有介孔、内部空心的普鲁士蓝纳米颗粒中，制备得到所述空心介孔普鲁士蓝纳米光热诊疗剂。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤I)中，酸的量为30-100份，酸为0.01-2M的盐酸，陈化时间为12-20小时。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，使用的酸为浓度1-2M的盐酸，陈化时间为2-4小时。
9.根据权利要求6-8中任一所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中，真空灌注法为在真空度为500— 5000Pa下进行冰水浴、超声。
【文档编号】A61K9/14GK104474559SQ201410712157
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月1日 优先权日:2014年12月1日
【发明者】蔡晓军, 贾晓庆, 陈航榕, 施剑林 申请人:中国科学院上海硅酸盐研究所