Hippo通路在调控癌细胞S100A7、S100A8和S100A9表达中的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及Hippo通路在调控癌细胞S100A7、S100A8和S100A9表达中的应用，特别涉及YAP蛋白的活性在调控癌细胞S100A7、S100A8和S100A9表达中的应用。

背景技术：

Hippo通路最早在果蝇里被发现，在生理状态下Hippo通路主要是调控细胞的增殖和凋亡而限定组织器官生长的大小，并参与干细胞的自我更新。近期发现，Hippo信号途径是一种新的抑制肿瘤发生的信号通路，而且YAP/TAZ是Hippo信号途径的核心蛋白。在哺乳动物中，Hippo通路由4个主要的激酶调控YAP的活性。当Hippo信号通路激活后引起Mst1/2活化，Mst1/2激酶与支架蛋白Sav1组成复合物使Lat1/2(Large tumor suppressor；LATS)激酶磷酸化并被激活，磷酸化的Lat1/2激酶又与另一支架蛋白Mob1组成复合物。Lat1/2直接使YAP蛋白上S127被磷酸化后产生一个14-3-3的结合基序，从而可与胞浆中的14-3-3蛋白结合滞留在胞浆中，导致YAP入核减少，或者进一步被磷酸化后通过蛋白酶体途径被降解。由于YAP不具有DNA结合活性。因此，进入核的非磷酸化状态的YAP与其他转录因子结合才能发挥其生物学作用。目前公认的是TEAD和p73。核内YAP与转录因子TEAD(TEA-domain；TEAD)结合，促进或抑制TEAD靶基因的表达，如CTGF和Cyr61，从而调节多种生物学功能，如细胞生长、细胞接触抑制、控制组织器官的大小和干细胞的自我更新等。TAZ是YAP的同源蛋白，与YAP有相同或类似的生物学作用，如也可被LATS1/2磷酸化，入核的TAZ也可与TEAD结合促进CTGF和CYR61的表达。此外YAP也可与p73结合调控与细胞凋亡相关基因的表达，如Bax和DR5等。此外也有报道，在多种肿瘤组织中发现核内YAP的表达增高，这就提示YAP的活性与肿瘤的发生和发展密切相关。YAP的活性除了受Hippo通路调节外，近几年也陆续报道了其他激酶也可调节YAP磷酸化活性。如胞浆中YAP S127磷酸化后可进一步被CK1δ/ε磷酸化，并通过蛋白酶体使其降解。尽管这一领域正迅速发展，但有关YAP调控与癌症相关的蛋白的研究，如S100A7、S100A8和S100A9蛋白的研究未见任何报道。

S100A7又名银屑素(psoriasin)，最初牛皮癣中增生的表皮角质细胞中分离得到。其基因位于人染色体1q21的EDC区域上，由三个外显子与两个内含子构成。研究认为，S100A7在皮肤细胞中表达并分泌，能起到杀灭细菌的抗菌肽(antimicrobial peptide)作用，帮助皮肤细胞抵御大肠杆菌等病菌入侵，并作为免疫趋化因子，吸引CD4⁺淋巴细胞和中性粒细胞等参与炎症反应。S100A7在牛皮癣中大量表达，故S100A7又名psoriasin。此外，S100A7在包括异位性皮炎、蕈样肉芽肿、硬化萎缩性苔藓等多种皮肤疾病中异常高表达，显示其在皮肤分化中可能发挥作用。目前研究发现，S100A7可以被多种因素诱导表达。在正常上皮组织中S100A7表达较低，但可被多种可被皮肤损伤及实验性屏障破坏实验(experimental barrier disruption)所诱导。而体外培养的角质形成细胞(keratinocytes)中，大肠杆菌裂解物、LPS(大肠杆菌脂多糖)、白细胞介素(Interleukin)、紫外照射等促炎因素、2mM钙离子、维甲酸、confluence培养条件、悬浮培养、血清饥渴、TPA等促分化因素皆可诱导S100A7表达。在乳腺上皮细胞系MCF10A中，S100A7除能被confluence与悬浮培养等促分化因素诱导外，还可被活性氧(reactive oxygen species)诱导，并被抗氧化剂如NAC所抑制，表明S100A7可能与细胞氧爆发有关。在癌细胞中，S100A7诱导表达的研究仍然较少，但有研究表明，在乳腺癌细胞系MB-231中，能被DNA损伤化疗药物诱导，而在人口腔鳞癌细胞系中，S100A7可被confluence及悬浮培养所诱导。研究发现，S100A7在多种癌症中表达异常，并可能在癌症发生发展中发挥重要作用。在乳腺癌中，S100A7在原位癌中表达升高，并与患者预后呈现相关性。Emberley ED等人的研究发现，在乳腺癌细胞系内，S100A7可与Jab1(c-jun activation-domain binding protein 1)直接相互作用、促进Jab1入核，激活AP-1活性最终降低p27(一种细胞周期阻滞因子)的表达，从而促进细胞增殖。在乳腺癌细胞系内，Liu H等人同样发现，S100A7可以促进NF-KB入核，促进细胞生长。但在口腔鳞癌细胞中，S100A7在早期增生及高分化癌症中表达升高，在低分化及转移癌中表达低。研究发现口腔鳞癌细胞系中过表达S100A7可以通过抑制β-catenin信号通路促进细胞分化，从而抑制癌细胞增殖。但研究同样发现，β-catenin信号通路激活后，会抑制S100A7表达，使细胞分化减轻，增殖加快。在膀胱癌患者尿液中，发现S100A7蛋白阳性率显著上升，表明S100A7具有作为膀胱癌分子诊断标志的潜力。在卵巢癌中，研究同样发现S100A7表达相对正常组织有明显升高，并可作为癌症诊断的分子标志。

S100A8/S100A9基因与S100A7同样定位于染色体1q21的EDC区域上，基因皆由三个外显子与两个内含子构成。S100A8/A9蛋白结构类似，也由靠近N端与C端的两个EF-手相结构域及中央铰链区构成，分子量分别为11KDa/13KDa。S100A8/S100A9常以钙离子依赖的方式形成异源二聚体蛋白复合物的形式存在。这两种蛋白在骨髓细胞、单核细胞、粒性白细胞、破骨细胞中呈组成型表达。此外、S100A8/A9在很多组织中呈共表达。S100A8/S100A9在正常细胞内可发挥多种功能。研究发现，敲除S100A8后，小鼠胚胎不能存活，这说明S100A8在体内发挥不可替代的重要作用。在巨噬细胞、树突状细胞及微血管上皮细胞中，S100A8可被炎性刺激诱导表达，且在中性粒细胞细胞质中，S100A8蛋白量占总蛋白量20％之多，显示其可能在炎症反应及机体免疫作用中发挥作用。此外研究还发现小鼠上皮细胞中，氧应激可刺激S100A8表达。S100A9同样在炎症反应与免疫系统中发挥作用。研究表明，S100A9在人体内可以作为趋化因子吸引中性粒细胞并刺激其合成整合素，从而促进中性粒细胞对组织中纤维连接蛋白的粘附。有研究还表明，S100A9可以通过激活NF-κB信号通路在巨噬细胞中诱导TNF-α和白细胞介素的表达，并可通过TLR-4受体激活中性粒细胞从而调节免疫系统。S100A9的另一项重要功能是它可以作为清道夫清除体内活性氧，保护细胞免受氧损伤。除单独发挥功能外，S100A8/A9在形成异源复合物后，可以发挥更广泛的功能。如S100A8/A9复合物可以抑制酪蛋白激酶1/2的活性，调节骨髓造血干细胞分化、帮助细胞内不饱和脂肪酸运输、与P67和RAC-2相互作用在巨噬细胞中激活NAPDH氧化酶等多种功能。S100A8及S100A9在癌症发生发展中也起重要作用。在胃癌中，发现S100A8及S100A9表达上调，在胃癌中肿瘤内间质细胞及炎细胞大量表达及分泌S100A8/A9、而S100A8/A9通过增加P38MAPK的磷酸化，激活NF-KB信号通路，进而增加MMP2/MMP12的表达，从而增加肿瘤的侵袭转移能力。亦有研究证明，在胃癌中，免疫抑制细胞(MDSCs)表达并分泌S100A8/A9，进而抑制免疫系统对癌细胞的攻击。在肺癌中，S100A8/A9在腺癌及晚期癌症中显著表达上调，且与临床预后有关。Hiratsuta等人发现，肺癌中原发肿瘤通过诱导转移灶正常细胞分泌S100A8和S100A9，吸引MaC-1阳性巨噬细胞，且S100A8/A9同样可以在肿瘤细胞内通过激活MAPK和P38信号通路，增加肿瘤侵袭转移能力^[24]。在乳腺癌中，研究则发现S100A8/A9可能在肿瘤细胞抗药性中发挥作用，SwarmaliAxharyya等人发现，虽然化疗药物能杀伤并抑制癌细胞生长，但同时化疗也使内皮细胞产生TNF-α。TNF-α通过NF-κB信号通路增强了肿瘤细胞中CXCL1/2的表达，从而招募了能表达CXCR2的CD11b(+)Gr1(+)髓细胞，髓细胞分泌S100A8/A9促使肿瘤细胞增殖活性和转移性增加，抵消了化疗药物效果。在肝癌中，S100A8和S100A9在人和小鼠肝癌组织中都有明显上调表达，并认为其可通过NF-KB信号通路改变癌细胞内活性氧浓度从而增加癌细胞生存能力。在结肠癌中，研究发现S1100A8和A9可以通过磷酸化smad2/3来激活Smad4信号通路，促进癌细胞迁移和增殖。此外，在卵巢癌、胆囊癌、前列腺癌、胰腺癌、血癌等多种癌症中，都有文献报道S100A8及S100A9表达失常并在癌症发生发展中起作用。综上所述，S100A8和S100A9在多种肿瘤细胞中高表达，并介导肿瘤细胞的生长和迁移。

技术实现要素：

本发明的目的是提供YAP蛋白及其活性抑制剂和活性促进剂的新用途。

本发明提供了能够抑制YAP蛋白活性的物质在如下(a)或(b)中的应用：

(a)促进癌细胞中S100A7蛋白和/或S100A8蛋白和/或S100A9蛋白表达；

(b)制备用于促进癌细胞中S100A7蛋白和/或S100A8蛋白和/或S100A9蛋白表达的产品。

活性成分为能够抑制YAP蛋白活性的物质，能够用于促进癌细胞中S100A7蛋白和/或S100A8蛋白和/或S100A9蛋白表达的产品也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了如下(1)-(5)所示物质中的任一种在如下(c)或(d)中的应用：

(1)YAP蛋白；

(2)S127A-YAP蛋白；所述S127A-YAP蛋白为将所述YAP蛋白的第127位丝氨酸突变为丙氨酸后所得的蛋白；

(3)所述YAP蛋白的编码基因，或含有所述YAP蛋白的编码基因的表达盒、重组载体或转基因细胞；

(4)所述S127A-YAP蛋白的编码基因，或含有所述S127A-YAP蛋白的编码基因的表达盒、重组载体或转基因细胞；

(5)能够增强YAP蛋白活性的物质；

(c)抑制癌细胞中S100A7蛋白和/或S100A8蛋白和/或S100A9蛋白表达；

(d)制备用于抑制癌细胞中S100A7蛋白和/或S100A8蛋白和/或S100A9蛋白表达的产品。

活性成分为如下(1)-(5)所示物质中的任一种，且能够用于抑制癌细胞中S100A7蛋白和/或S100A8蛋白和/或S100A9蛋白表达的产品也属于本发明的保护范围：

(1)YAP蛋白；

(2)S127A-YAP蛋白；所述S127A-YAP蛋白为将所述YAP蛋白的第127位丝氨酸突变为丙氨酸后所得的蛋白；

(3)所述YAP蛋白的编码基因，或含有所述YAP蛋白的编码基因的表达盒、重组载体或转基因细胞；

(4)所述S127A-YAP蛋白的编码基因，或含有所述S127A-YAP蛋白的编码基因的表达盒、重组载体或转基因细胞；

(5)能够增强YAP蛋白活性的物质。

在本发明中，所述能够抑制YAP蛋白活性的物质可为如下(a1)和(a2)中任一种：

(a1)能够沉默YAP蛋白的编码基因的核酸分子；

(a2)能够促进YAP蛋白磷酸化的物质。

在本发明中，所述能够增强YAP蛋白活性的物质可为能够抑制YAP蛋白磷酸化的物质。

进一步，所述能够沉默YAP蛋白的编码基因的核酸分子具体为将序列表中序列3和序列4所示的两条单链核酸退火形成的双链核酸；

所述能够促进YAP蛋白磷酸化的物质可为如下中任一种：LATS1蛋白，编码所述LATS1蛋白的编码基因，含有所述LATS1蛋白的编码基因的的表达盒、重组载体或转基因细胞，LATS1蛋白活性促进剂；

所述能够抑制YAP蛋白磷酸化的物质可为LATS1蛋白活性抑制剂；具体的，所述Lats1蛋白活性抑制剂为能够沉默所述Lats1蛋白的编码基因的核酸分子；更加具体的，所述“能够沉默所述Lats1蛋白的编码基因的核酸分子”为将序列表中序列7和序列8所示的两条单链核酸退火形成的双链核酸。

下述方法I或方法II也属于本发明的保护范围：

方法I：促进癌细胞中S100A7蛋白和/或S100A8蛋白和/或S100A9蛋白表达的方法，包括如下步骤：抑制所述癌细胞中YAP蛋白活性，从而实现促进所述癌细胞中S100A7蛋白和/或S100A8蛋白和/或S100A9蛋白的表达；

所述方法I中，抑制所述癌细胞中所述YAP蛋白活性是通过如下(b1)-(b3)中至少一种实现的：

(b1)向所述癌细胞中导入前文所述的能够抑制YAP蛋白活性的物质；

(b2)以悬浮培养的方式培养所述癌细胞；

(b3)以over-confluence贴壁培养的方式培养所述癌细胞，且所述癌细胞的培养密度为75000-150000个细胞/cm²培养面积。

在所述(b2)中，所述悬浮培养的时间为48小时以上，如48-72小时，再如48小时。

方法II：抑制癌细胞中S100A7蛋白和/或S100A8蛋白和/或S100A9蛋白表达的方法，包括如下步骤(A)或(B)或(C)，从而实现抑制所述癌细胞中S100A7蛋白和/或S100A8蛋白和/或S100A9蛋白的表达：

(A)向所述癌细胞中导入YAP蛋白的编码基因，提高所述癌细胞中YAP蛋白的表达量；

(B)向所述癌细胞中导入S127A-YAP蛋白的编码基因，使所述癌细胞表达所述S127A-YAP蛋白；所述S127A-YAP蛋白为将所述YAP蛋白的第127位丝氨酸突变为丙氨酸后所得的蛋白；

(C)增强所述癌细胞中YAP蛋白活性；

在所述(C)中，增强所述癌细胞中所述YAP蛋白活性是通过向所述癌细胞中导入前文所述的能够增强YAP蛋白活性的物质来实现的。

在本发明中，所述YAP蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示；所述YAP蛋白的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。相应的，所述S127A-YAP蛋白的氨基酸序列如将序列表中序列1的第127位丝氨酸替换为丙氨酸后所得序列所示；所述S127A-YAP蛋白的编码基因的核苷酸序列如将序列表中序列2的第379-381位的寡核苷酸“TCC”替换为“GCC”后所得序列所示。

所述LATS1蛋白的氨基酸序列如序列表中序列5所示；所述LATS1蛋白的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列6所示。

所述S100A7蛋白的氨基酸序列如序列表中序列9所示；所述S100A8蛋白的氨基酸序列如序列表中序列10所示；所述S100A9蛋白的氨基酸序列如序列表中序列11所示。

在本发明中，所述YAP蛋白磷化酸为序列表中序列1所示蛋白质的第127位丝氨酸的磷酸化。

在本发明中，所述癌细胞可为如下中任一种：肺癌细胞、宫颈鳞癌细胞、表皮癌细胞和口腔鳞癌细胞。更进一步，所述肺癌细胞具体可为NCI-H292细胞或H226Br细胞；所述宫颈鳞癌细胞具体可为HCC94细胞；所述表皮癌细胞具体可为A431细胞；所述口腔鳞癌细胞具体可为FaDu细胞。

所述方法I在制备S100A7蛋白和/或S100A8蛋白和/或S100A9蛋白中的应用也属于本发明的保护范围。

在本发明中，以上所有的所述产品均可为药物。

实验证明，抑制癌细胞中YAP蛋白活性，可以促进癌细胞中S100A7、S100A8和S100A9蛋白的表达。本发明首先揭示了S100A7、S100A8和S100A9在多种癌细胞中诱导表达的规律，并对设计治疗与S100A7、S100A8和S100A9相关的肿瘤的药物提供了重要的依据，同时对阐明肿瘤的发生和发展提供了重要的理论基础。

附图说明

图1为免疫组化检测S100A7、S100A8和S100A9在多种癌细胞中的表达情况。其中，Br即表示H226Br细胞。图中被染成棕褐色的为阳性细胞。

图2为沉默YAP蛋白可促进S100A7、S100A8和S100A9在癌细胞中的表达。其中，NC表示未经si-YAP转染的对照细胞。

图3为提高YAP蛋白的活性可抑制S100A7、S100A8和S100A9在癌细胞中的表达。其中，NC表示悬浮培养的对照细胞。Suspension表示悬浮培养。H292细胞即表示NCI-H292细胞。

图4为细胞形态对YAP的活性及其S100A7、S100A8和S100A9在癌细胞中表达的影响。其中，A为q-PCR结果；B为Western blot结果，NC表示正常密度贴壁培养48h，S48h或S48表示悬浮培养48h。H292细胞即表示NCI-H292细胞。

图5为细胞密度调控YAP的活性及其S100A7、S100A8和S100A9的表达。其中，A为q-PCR结果；B为Western blot结果，L表示初始细胞培养密度为7500细胞/cm²；H1表示初始细胞培养密度为100000细胞/cm²；H2表示初始细胞培养密度为120000细胞/cm²；H3表示初始细胞培养密度为150000细胞/cm²；H表示初始细胞培养密度为75000细胞/cm²；con15d表示细胞长满以后，再连续培养15天，且每天更换新的培养液。H292细胞即表示NCI-H292细胞。

图6为LATS1对癌细胞中S100A7、S100A8和S100A、9的表达情况的影响。A和B分别为HCC94细胞和A431细胞中过表达LATS1后对S100A7、S100A8和S100A9表达情况的影响。C和D分别为HCC94细胞和A431细胞中沉默LATS1后对S100A7、S100A8和S100A9表达情况的影响。其中，Pcmv-nc表示转入pCMV-14空载体的对照组；+lats1表示过表达LATS1组；Sinc表示siNC对照；SiLATS表示沉默LATS1；attached表示贴壁培养；suspension表示悬浮培养；sparse表示低密度贴壁培养；dense表示高密度贴壁培养。

图7为各种癌细胞至裸鼠成瘤后肿瘤组织的免疫组化结果。图中被染成棕褐色的为阳性细胞。其中，Br即表示H226Br细胞。H292细胞即表示NCI-H292细胞。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所有的定量实验结果均为平行实验的结果平均值。所有的实验均被重复两次及两次以上。实验组和它们相应的对照组均使用GraphPad软件进行双尾T检验。其中，P值小于0.05被认为是显著差异。

NCI-H292细胞：记载于“唐伟.多聚左旋精氨酸对NCI-H292细胞炎症介质调节作用的研究.安徽医科大学,2014年硕士论文”一文，公众可从申请人处获得，仅限用于重复本发明实验使用。

HCC94细胞：记载于“杨丞,饶翔,张弦.Twist基因转染对人宫颈癌细胞生物学行为影响的观察.中华肿瘤防治杂志,2013年03期”一文，公众可从申请人处获得，仅限用于重复本发明实验使用。

A431细胞：记载于“张斌.核激素受体在皮肤主要构成细胞和表皮鳞癌A431细胞中的表达及其部分配体的调节效应.第三军医大学,2013年博士论文”一文，公众可从申请人处获得，仅限用于重复本发明实验使用。

FaDu细胞：记载于“路武豪.HPV-16感染对喉咽鳞癌和FaDu细胞的生物学行为影响及miRNAs表达的调控.郑州大学,2013年博士论文”一文，公众可从申请人处获得，仅限用于重复本发明实验使用。

H226Br细胞：记载于“Chiu-Chin Hwang,Kang Fang,Limin Li,et al.Insulin-like growth factor-I is an autocrine regulator for the brain metastatic variant of a human non-small cell lung cell line.Cancer Letter,94(1995)157-163”一文，公众可从申请人处获得，仅限用于重复本发明实验使用。

A431、NCI-H292、HCC94细胞株使用含10％(体积分数)FBS的1640培养基培养，FaDu细胞株用含10％(体积分数)FBS的MEM培养基培养，H226Br细胞使用含10％(体积分数)FBS的DMEM培养基，培养条件5％CO2，恒温37℃。

本发明涉及到如下各蛋白：(1)YAP蛋白，氨基酸序列如序列表中序列1所示，编码基因如序列表中序列2所示。(2)S127A-YAP蛋白，氨基酸序列如将序列表中序列1的第127位丝氨酸替换为丙氨酸后所得序列所示；编码基因的核苷酸序列如将序列表中序列2的第379-381位的寡核苷酸“TCC”替换为“GCC”后所得序列所示。(3)LATS1蛋白，氨基酸序列如序列表中序列5所示；编码基因的核苷酸序列如序列表中序列6所示。(4)S100A7蛋白，氨基酸序列如序列表中序列9所示；(5)S100A8蛋白，氨基酸序列如序列表中序列10所示；(6)S100A9蛋白，氨基酸序列如序列表中序列11所示。

实施例1、S100A7、S100A8和S100A9蛋白在癌细胞中的表达

首先，本发明的发明人采用免疫组化的方法检测了多种癌细胞(H226Br细胞、NCI-H292细胞、HCC94细胞、A431细胞和FaDu细胞)在正常培养条件下(是指每种贴壁培养的细胞株在进行日常传代时所需的细胞密度)细胞中S100A7、S100A8和S100A9蛋白的表达。

具体按照如下进行操作：

取待实验的细胞爬片，PBS洗一次，3.4％(3.4g/100ml)甲醛(PBS配)室温固定20min，PBS-0.5％(体积分数)Triton室温通透10min，PBS洗一次后用3％(体积分数)过氧化氢-PBS室温孵育15min灭火内源过氧化物酶，PBS洗一次后用3％(体积分数)牛血清-PBS室温封闭20min，随后孵育一抗过夜或37℃1h，PBS洗3次(每次10min)，孵育HRP标记的二抗，15min室温，PBS洗3次(每次5min)，DAB显色3min后苏木素复染，水洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明后封片，显微镜下观察染色情况。

其中，用于检测S100A7蛋白的一抗为兔抗人S100A7(Psoriasin)抗体(Santa Cruz Biotechnology公司产品，产品目录号为SC67047)；二抗为快捷型酶标羊抗兔/鼠IgG聚合物(迈新试剂公司产品，产品目录号为KIT-5010)。用于检测S100A8蛋白的一抗为anti-hS100A8(R&B公司产品，产品目录号为MAB4570)；二抗为快捷型酶标羊抗兔/鼠IgG聚合物(迈新试剂公司产品，产品目录号为KIT-5010)。用于检测S100A9蛋白的一抗为羊抗人S100A9(Calgranulin B)抗体(Santa Cruz Biotechnology公司产品，产品目录号为SC-8114)；二抗为快捷型酶标兔抗羊IgG聚合物(迈新试剂公司，产品目录号为KIT-5107)。

结果显示，S100A7、S100A8和S100A9蛋阳性细胞在上述检测的癌细胞系(H226Br细胞、NCI-H292细胞、HCC94细胞、A431细胞和FaDu细胞)中均有表达，但比例非常低。除了HCC94细胞中S100A7的阳性细胞比例在10％左右外，其他癌细胞中的S100A7、S100A8和S100A9以及HCC94细胞中的S100A8和S100A9的阳性细胞比例<1％(图1)。

实施例2、抑制癌细胞中YAP蛋白的表达可促进S100A7、S100A8和S100A9的表达

采用特异性的si-YAP转染多种癌细胞系，包括肺腺癌细胞株NCI-H292、宫颈鳞癌细胞株HCC94、表皮癌细胞株A431和口腔鳞癌细胞株FaDu。采用RT-PCR和/或western blot方法确认YAP的沉默效果。然后采用RT-PCR和Western blot检测沉默YAP后，癌细胞中S100A7、S100A8和S100A9的表达情况。

一、si-YAP转染癌细胞系

在60mm培养皿中铺70万个癌细胞，培养24h。将转染试剂(jetPRIME)、Buffer与用于干扰YAP基因(序列2，Genbank：NM_001130145.2)表达的siRNA混匀，静置10min，均匀滴加到培养基中。48h后收细胞备用。

其中，用于干扰YAP基因(序列2，Genbank：NM_001130145.2)表达的siRNA为由如下A和B所示的两条单链退火而成的双链。

A：5’-GGUGAUACUAUCAACCAAATT-3’(序列3)；

B：5’-UUUGGUUGAUAGUAUCACCTT-3’(序列4)。

二、YAP沉默效果检测

1、RT-PCR检测YAP沉默效果

(1)细胞总RNA提取与cDNA的制备

取步骤一转染后获得的细胞，预冷PBS缓冲液清洗三次，加入1mL Trizol，用移液枪吹吸使细胞完全裂解，将Trizol裂解液置于EP管中，室温孵育5min；加入200μL氯仿，涡旋震荡混匀，室温孵育3min，冰上静置15min；12000rpm 4℃离心20min，吸上清至另一EP管中；加入500μL异丙醇，缓慢混匀至溶液变清澈为止，室温静置10min；12000rpm 4℃，离心10min，吸去上清；加1ml无水乙醇，颠倒混匀，4℃，12000rpm离心10min，吸取上清；加DEPC水配75％乙醇，颠倒混匀，4℃，12000rpm离心10min，吸去上清；超净台中吹干至EP管底部沉淀透明成为RNA粉末，可于-20℃冻存。

向RNA干粉中加入适量DEPC水溶解，使用紫外分光光度计测定其浓度；用DEPC水将RNA稀释成1μg/μL，配制以下反应体系：RNA溶液2μL；Oligo(dT)150.5μL；DEPC水2.5μL。

以上混合液72℃，5min，时间结束立即取出冰上放置5min，再加入以下试剂：5×M-MLV RT buffer 4μL；dNTPs 8μL；DEPC水2μL；M-MLV反转录酶1μL。

以上混合液42℃，60min；72℃，15min；cDNA即合成完成，储存于4℃或冻存于-20℃冰箱待用。

(2)RT-PCR检测基因表达

以GAPDH为内参，每个样品4个平行，阴性对照中cDNA模板以三蒸水代替。

其中，用于扩增YAP基因(Genbank：NM_001130145.2)的引物序列如下：

YAP-F：5’-CCTCTATTTTGCTCTTCCTTGTCC-3’；

YAP-R：5’-CCATCATCCAAACAGGCTCAC-3’。

用于扩增内参GAPDH的引物序列如下：

GAPDH-F：5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’；

GAPDH-R：5’-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’。

反应体系：10μL SYBR、2μL引物、7μL无菌水、1μL cDNA。

反应程序：第一步：95℃10min。第二步：94℃15s，60℃1min,40个循环。

实验同时设置未经si-YAP转染的相应细胞作为对照。

(3)结果

结果如图2所示，可见步骤一转染后获得的各癌细胞中YAP在RNA水平上与未经si-YAP转染的对照相比表达量明显降低。

2、western blot检测YAP沉默效果

(1)细胞总蛋白的提取

取步骤一转染后获得的各细胞，胰酶消化(若为悬浮细胞则直接离心)，1000rpm离心5min沉淀细胞；预冷的PBS洗三次，将细胞沉淀收集至EP管内；加入沉淀体积3-5倍量的RIPA裂解液，吹打混匀至无细胞团块，混悬仪上4℃混悬1h；4℃，12000rpm离心40min，吸取离心产物中部的澄清液体即蛋白提取液，随后用Bradford法检测样品蛋白浓度；向蛋白提取液中加入1/5体积的6×protein loading buffer混匀，沸水浴5min使蛋白二硫键打开并变性，分装后-20℃保存备用。

(2)免疫印迹(Western blot)实验

首先，配置12％的Tricine-SDS-Page胶，配方如下(以一块胶为例)：AB-32.67ml；3×Gel buffer 3.33ml；甘油1g；纯水4ml。搅拌混匀后加入10％AP 50μl，TEMED 5μl稍混匀后灌筑分离胶，水压胶，待分离胶凝后，再按照如下配方配置浓缩胶(一块胶为例)：AB-30.25ml；3×Gel buffer 0.75ml；纯水2ml。搅拌混匀后加入10％AP 20μl，TEMED 2μl稍混匀后灌筑样品胶。

胶配置完成后在胶槽上下分别加入阴极，阳极缓冲液，取等量蛋白样品及蛋白Marker上样，先30V恒压电泳待样品全部进入胶内，再80V恒压进行样品胶电泳，样品进入分离胶后电压加大至100伏电泳90min；取出并切下分离胶，使用Bio-Rad湿转仪将蛋白转至PVDF膜(甲醇预先激活)上，350mA恒流转膜2h；用TBS配置的5％脱脂奶粉溶液将膜室温封闭1h；加入目的蛋白的一抗，湿盒内37℃孵育1h或4℃孵育过夜；TBS洗膜3-5次，每次5min；加入HRP标记的对应一抗种属的二抗，37℃孵育1h；TBS洗TBS洗膜3-5次，每次5min。随后使用化学发光法或酶法显色。以β-actin为内参检测YAP蛋白的表达情况。

其中，用于检测YAP蛋白的一抗为YAP(63.7)(Santa Cruz Biotechnology公司，产品目录号为SC-101199)；二抗为Anti-IgG(H+L chain)(mouse)pHb-HRP(MBL公司，产品目录号为458)。用于检测β-actin的一抗为小鼠抗人β-Actin单抗(中杉金桥公司，产品目录号为TA-09)；二抗为Anti-IgG(H+L chain)(mouse)pHb-HRP(MBL公司，产品目录号为458)。

实验同时设置未经si-YAP转染的相应细胞作为对照。

(3)结果

结果如图2所示，可见步骤一转染后获得的各细胞中YAP在蛋白水平与未经si-YAP转染的对照相比表达量明显降低。

三、沉默YAP后各癌细胞中S100A7、S100A8和S100A9蛋白的表达情况检测

采用western blot检测导入si-YAP后各癌细胞中S100A7、S100A8和S100A9蛋白的表达情况，具体方法参见步骤2进行。

其中，用于检测S100A7蛋白的一抗为兔抗人S100A7(Psoriasin)抗体(Santa Cruz Biotechnology公司产品，产品目录号为SC67047)；二抗为Anti-Rabbit IgG(H+L chain)-HRP(MBL公司，产品目录号为330)。用于检测S100A8蛋白的一抗为anti-hS100A8(R&B公司产品，产品目录号为MAB4570)；二抗为Anti-IgG(H+L chain)(mouse)pAb-HRP(MBL公司，产品目录号为458)。用于检测S100A9蛋白的一抗为羊抗人S100A9(Calgranulin B)抗体(Santa Cruz Biotechnology公司产品，产品目录号为SC-8114)；二抗为donkey anti-goat IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology公司，产品目录号为SC-2020)。

实验同时设置未经si-YAP转染的相应细胞作为对照。

结果如图2所示，可见，沉默了癌细胞中的YAP后，可明显促进S100A7、S100A8和S100A9蛋白的表达。

实施例3、促进癌细胞中YAP的活性可抑制S100A7、S100A8和S100A9的表达

一、向癌细胞中导入野生型YAP和S127A-YAP突变质粒

通过Lipofectin2000转染试剂，将带有His标签的野生型的YAP和S127A-YAP突变质粒分别导入癌细胞HCC94和NCI-H292中，具体转染方法参见试剂盒说明书进行。获得瞬时表达相应蛋白的细胞。

其中，带有His标签的野生型的YAP质粒为pcDNA4/HisMaxB-YAP1(add gene Plasmid#18978)，带有His标签的S127A-YAP突变质粒pcDNA4/HisMaxB-YAP1-S127A(addgene Plasmid#18988)，这连个质粒均记载于“Mst2and Lats kinases regulate apoptotic function of YAP.Oka T,Mazack V,Sudol M.J Biol Chem.2008 Jul 17.():.10.1074/jbc.M804380200 PubMed 18640976”一文，公众可从申请人处获得，仅用于重复本发明实验。

带有His标签的野生型的YAP质粒pcDNA4/HisMaxB-YAP1可以表达在序列表中序列1所示的蛋白质的氨基酸残基末端连接6个His标签后形成的重组蛋白His-YAP。带有His标签的S127A-YAP突变质粒pcDNA4/HisMaxB-YAP1-S127A可以表达His-S127A-YAP蛋白，His-S127A-YAP蛋白与His-YAP蛋白相比，差别仅在于将序列表中序列1的第127位丝氨酸(S)替换为丙氨酸(A)。

本领域公知，将YAP蛋白的第127位丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A)后，可使YAP主要定位于核内，对其发挥生物学作用更加有利。

二、向癌细胞中导入野生型YAP和S127A-YAP突变质粒后细胞中His-YAP、YAP、S127-YAP、S100A7、S100A8和S100A9蛋白的表达情况检测

采用western blot检测向癌细胞中导入野生型YAP和S127A-YAP突变质粒后细胞中His-YAP、YAP、S127-YAP、S100A7、S100A8和S100A9表达情况，具体方法参见实施例2步骤二2进行。以GAPDH作为内参。其中，S127-YAP为YAP蛋白(序列1)的第127为丝氨酸发生了磷化酸后的蛋白。

其中，用于检测His-YAP蛋白的一抗为Anti-His-tag(MBL公司，产品目录号为D291-3)；二抗为Anti-IgG(H+L chain)(mouse)pAb-HRP(MBL公司，产品目录号为458)。用于检测YAP蛋白的一抗为YAP(63.7)(Santa Cruz Biotechnology公司，产品目录号为SC-101199)；二抗为Anti-IgG(H+L chain)(mouse)pAb-HRP(MBL公司，产品目录号为458)。用于检测S127-YAP蛋白的一抗为p-YAP(S127)Rabbit mAb(CST公司，产品目录号为D9W2I)；二抗为Anti-Rabbit IgG(H+L chain)-HRP(MBL公司，产品目录号为330)。用于检测S100A7蛋白的一抗为兔抗人S100A7(Psoriasin)抗体(Santa Cruz Biotechnology公司产品，产品目录号为SC67047)；二抗为Anti-Rabbit IgG(H+L chain)-HRP(MBL公司，产品目录号为330)。用于检测S100A8蛋白的一抗为anti-hS100A8(R&B公司产品，产品目录号为MAB4570)；二抗为Anti-IgG(H+L chain)(mouse)pAb-HRP(MBL公司，产品目录号为458)。用于检测S100A9蛋白的一抗为羊抗人S100A9(Calgranulin B)抗体(Santa Cruz Biotechnology公司产品，产品目录号为SC-8114)；二抗为donkey anti-goat IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology公司，产品目录号为SC-2020)。用于检测GAPDH蛋白的一抗为小鼠抗人GAPDH单抗(中杉金桥公司，产品目录号为TA-08)；二抗为Anti-IgG(H+L chain)(mouse)pAb-HRP(MBL公司，产品目录号为458)。

实验同时设置未导入野生型YAP和S127A-YAP突变质粒的HCC94细胞和NCI-H292细胞，以及导入pcDNA4/His空载体的HCC94细胞和NCI-H292细胞作为对照。

结果如图3所示，与空载对照细胞(NC)相比，细胞过表达野生型YAP和S127A-YAP质粒后，YAP的活性有所提高，尤其是转染了S127A-YAP突变质粒。同时S100A7、S100A8和S100A9蛋白的表达均不同程度的抑制，尤其是转染了S127A-YAP突变质粒的抑制效果更为明显。由此证明，促进YAP的活性可抑制S100A7、S100A8和S100A9蛋白在癌细胞中的表达。未导入野生型YAP和S127A-YAP突变质粒的癌细胞的检测结果与空载对照细胞(NC)相比基本一致，无统计学差异。

实施例4、改变细胞形态(悬浮培养和非悬浮培养或贴壁培养)调控癌细胞中YAP蛋白的活性和S100A7、S100A8和S100A9的表达

本发明的发明人将各癌细胞(H226Br细胞、NCI-H292细胞、HCC94细胞、A431细胞和FaDu细胞)分别进行悬浮培养和贴壁培养。然后采用q-PCR和/或Western blot检测YAP的活性和S100A7、S100A8和S100A9的表达。

一、培养各癌细胞

1、悬浮培养(suspension)

取配制好的Poly-Hema溶液(配方：将1.2g poly-Hema溶解在100mL95％的乙醇中)，向六孔板每孔中加入2ml溶液，打开盖子超净台中静置至乙醇挥发完全，打开超净台紫外灯杀菌20分钟待用。

取状态良好的细胞，胰酶消化后培养基重悬计数，配置成1×10⁴个/ml的细胞悬液，向poly-Hema包被好的六孔板每孔内加入2ml细胞悬液，置于细胞培养箱内培养。培养时间设置三个梯度：24小时(S1)，48小时(S2)和72小时(S3)。

2、不同细胞密度的贴壁培养

细胞计数后接种到培养皿中，在细胞长满培养皿底面积60-70％的条件下进行细胞培养。培养时间为48h小时。

二、q-PCR检测不同培养方式下各癌细胞中S100A7、S100A8和S100A9的表达情况

(1)细胞总RNA提取与cDNA的制备

参见实施例2步骤一1(1)进行。

(2)实时定量PCR检测基因表达

实时定量PCR以SYBR Green为染料，GAPDH为内参，每个样品4个平行，阴性对照中cDNA模板以三蒸水代替。

其中，用于扩增S100A7基因的引物如下：

S100A7-F：5’-CTTCCCCAACTTCCTTAGTG-3’；

S100A7-R：5’-GTAGTCTGTGGCTATGTCTC-3’。

用于扩增S100A8基因的引物如下：

S100A8-F：5’-AAGGGGAATTTCCATGCCGTCTA-3’；

S100A8-R：5’-GGCTGCCACGCCCATCTTTA-3’。

用于扩增S100A9基因的引物如下：

S100A9-F：5’-GGCACCCAGACACCCTGAACC-3’；

S100A9-R：5’-CCTCGCCATCAGCATGATGAACT-3’。

用于扩增内参GAPDH的引物序列如下：

GAPDH-F：5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’；

GAPDH-R：5’-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’。

反应体系如下：SYBR Green PCR Master Mix 10μL；cDNA模板1μL；引物2μL；纯水补足至20μL。

PCR反应采取两步法，60℃退火与延伸1min，95℃变性30s，吸光度在退火延伸阶段采集。采用△△Ct法作相对定量，计算出目的基因在各组cDNA中的相对表达量，计算方法为：

Ratio＝2^-△△Ct＝2^{-[△Ct(sample)-△Ct(calibrator)]}

式中，Ct值指目的基因的表达量达到阈值时所经历的扩增循环数，△Ct＝Ct(目的基因)-Ct(GAPDH)。Sample是指实验组(目的基因)，calibrator是指阴性对照(GAPDH)。

(3)结果

结果如图4中A所示，可见与贴壁培养的癌细胞相比，细胞悬浮后可明显促进癌细胞中S100A7、S100A8和S100A9的mRNA水平的表达。

三、Western blot检测不同培养方式下各癌细胞中YAP、S127-YAP、S100A7、S100A8和S100A9的表达情况

具体操作参见实施例2步骤二2进行。以GAPDH作为内参。

其中，用于检测YAP蛋白的一抗为YAP(63.7)(Santa Cruz Biotechnology公司，产品目录号为SC-101199)；二抗为Anti-IgG(H+L chain)(mouse)pAb-HRP(MBL公司，产品目录号为458)。用于检测S127-YAP蛋白的一抗为p-YAP(S127)Rabbit mAb(CST公司，产品目录号为D9W2I)；二抗为Anti-Rabbit IgG(H+L chain)-HRP(MBL公司，产品目录号为330)。用于检测S100A7蛋白的一抗为兔抗人S100A7(Psoriasin)抗体(Santa Cruz Biotechnology公司产品，产品目录号为SC67047)；二抗为Anti-Rabbit IgG(H+L chain)-HRP(MBL公司，产品目录号为330)。用于检测S100A8蛋白的一抗为anti-hS100A8(R&B公司产品，产品目录号为MAB4570)；二抗为Anti-IgG(H+L chain)(mouse)pAb-HRP(MBL公司，产品目录号为458)。用于检测S100A9蛋白的一抗为羊抗人S100A9(Calgranulin B)抗体(Santa Cruz Biotechnology公司产品，产品目录号为SC-8114)；二抗为donkey anti-goat IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology公司，产品目录号为SC-2020)。用于检测GAPDH蛋白的一抗为小鼠抗人GAPDH单抗(中杉金桥公司，产品目录号为TA-08)；二抗为Anti-IgG(H+L chain)(mouse)pAb-HRP(MBL公司，产品目录号为458)。

结果如图4中B所示，可见与贴壁培养的癌细胞相比，细胞悬浮培养可明显促进YAP蛋白的磷酸化，提高S127-YAP蛋白的表达水平，降低了YAP蛋白的活性。另外，与贴壁培养的癌细胞相比，细胞悬浮后可明显促进癌细胞中S100A7、S100A8和S100A9蛋白水平的表达。

本实施例结果证明，细胞生长的形态可调控S100A7、S100A8和S100A9在癌细胞中的表达。

实施例5、细胞密度调控癌细胞中YAP蛋白的活性和S100A7、S100A8和S100A9的表达

将不同细胞密度的各癌细胞(H226Br细胞、NCI-H292细胞、HCC94细胞和A431细胞)分别接种到培养皿中贴壁培养，采用q-PCR和western blot检测YAP的活性和S100A7、S100A8和S100A9的表达。

一、不同细胞密度的癌细胞贴壁培养

共采用两种方式，一种方法是连续培养法(低密度接种连续培养不同时间)；另一种是不同细胞密度接种，而后继续培养相同时间。

第一种方法：首先将细胞低密度(sparse)接种到培养皿中，连续培养，每天更换新鲜的培养液，对于NCI-H292细胞一共连续培养10天(C10)，然后将细胞消化后重新接种到培养皿中，并传代3次(C10S3D)；同样HCC94细胞连续培养6天(C6)，后而传代3次(C6S3D)；H226Br细胞连续培养3天(C3)、6天(C6)和10天(C10)，连续培养10天后将细胞消化后重新接种到培养皿中，并传代1次(C10S1D)，传代2次(C10S2D)和传代3次(C10S3D)。其中，接种细胞数量<7500个细胞/cm²培养面积定义低密度或Sparse。

第二种方法：细胞计数后接种到培养皿中，在不同密度下进行细胞贴壁培养48小时。将接种细胞数量≤7500个细胞/cm²培养面积定义低密度培养或Sparse，将细胞接种数量在7500-10000(不含端点值)个细胞/cm²培养面积定义为正常密度培养，细胞接种密度在75000-150000/cm²培养面积定义为高密度或dense或over-confluence。

二、q-PCR检测不同培养密度下各癌细胞中S100A7、S100A8和S100A9的表达情况

具体操作参见实施例4步骤二进行。

结果如图5中A所示，可见与正常密度培养和低密度培养组的癌细胞相比，高密度培养状态可明显促进癌细胞中S100A7、S100A8和S100A9的mRNA水平的表达。

三、Western blot检测不同培养密度下各癌细胞中YAP、S127-YAP、S100A7、S100A8和S100A9的表达情况

具体操作参见实施例2步骤二2进行。以GAPDH作为内参。

其中，用于检测YAP蛋白的一抗为YAP(63.7)(Santa Cruz Biotechnology公司，产品目录号为SC-101199)；二抗为Anti-IgG(H+L chain)(mouse)pAb-HRP(MBL公司，产品目录号为458)。用于检测S127-YAP蛋白的一抗为p-YAP(S127)Rabbit mAb(CST公司，产品目录号为D9W2I)；二抗为Anti-Rabbit IgG(H+L chain)-HRP(MBL公司，产品目录号为330)。用于检测S100A7蛋白的一抗为兔抗人S100A7(Psoriasin)抗体(Santa Cruz Biotechnology公司产品，产品目录号为SC67047)；二抗为Anti-Rabbit IgG(H+L chain)-HRP(MBL公司，产品目录号为330)。用于检测S100A8蛋白的一抗为anti-hS100A8(R&B公司产品，产品目录号为MAB4570)；二抗为Anti-IgG(H+L chain)(mouse)pAb-HRP(MBL公司，产品目录号为458)。用于检测S100A9蛋白的一抗为羊抗人S100A9(Calgranulin B)抗体(Santa Cruz Biotechnology公司产品，产品目录号为SC-8114)；二抗为donkey anti-goat IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology公司，产品目录号为SC-2020)。用于检测GAPDH蛋白的一抗为小鼠抗人GAPDH单抗(中杉金桥公司，产品目录号为TA-08)；二抗为Anti-IgG(H+L chain)(mouse)pAb-HRP(MBL公司，产品目录号为458)。

结果如图5中B所示，可见与正常密度培养和低密度培养组的癌细胞相比，高密度培养状态可促进YAP蛋白的磷酸化，提高S127-YAP蛋白的表达水平，降低YAP蛋白的活性；同时可明显促进S100A7、S100A8和S100A9蛋白水平的表达

本实施例结果证明，贴壁培养时细胞的培养密度可调控S100A7、S100A8和S100A9在癌细胞中的表达。

实施例6、Hippo通路的激活或抑制影响S100A7、S100A8和S100A9在癌细胞中的表达

Hippo通路激活后，可激活LATS1/2激酶，后者可促进YAP磷酸化，S127-YAP表达增加；反之当Hippo通路被抑制时，LATS1/2激酶失活，降低YAP磷酸化，S127-YAP的表达水平降低。为了确认S100A7、S100A8和S100A9在癌细胞中的诱导表达是否是由Hippo通路介导的，本发明的发明人在正常贴壁生长的HCC94细胞和A431细胞中分别过表达LATS1，以及沉默内源性的LATS1，然后检测了S100A7、S100A8和S100A9的表达情况。

一、过表达LATS1对癌细胞中S100A7、S100A8和S100A9的表达情况的影响

1、过表达LATS1重组载体的构建

用如下引物F和R对LATS1片段CDS区(序列6)进行扩增，将扩增产物以及pCMV14(nvitrogen,Carlsbad,CA,USA)质粒骨架用限制性内切酶KpnⅠ及Xba1进行双酶切以产生粘性末端，后16℃过夜连接；将10μl连接产物热激转化入50μl感受态细胞中DH5α，涂板(含Amp)，37℃过夜培养，挑单克隆，摇菌，后大提，进行测序验证，验证正确的重组质粒命名为pCMV14-Lats1。

F：5’-CGGGGTACCATGAAGAGGAGTGAAAAG-3’(下划线部分为KpnI的识别序列，其后的序列为序列6的第1-18位)；

R：5’-GCTCTAGAAACATATACTAGATCGCGATTT-3’(下划线部分为Xba1的识别序列，其后的序列为序列6的第3369-3390位的反向互补序列)。

过表达LATS1重组载体pCMV14-Lats1的结构描述为：将pCMV14载体的酶切位点KpnⅠ及Xba1之间的小片段替换为序列表中序列6所示LATS1基因的重组质粒。

pCMV14-Lats1可表达LATS1-Flag融合蛋白，LATS1-Flag融合蛋白为在LATS1蛋白的氨基酸残基末端连接Flag标签后形成的蛋白(Flag标签为pCMV14载体自带)。

2、向各癌细胞中转入过表达LATS1重组载体pCMV14-Lats1

供试癌细胞：HCC94细胞和A431细胞。

向各供试癌细胞中分别转入步骤1构建的过表达LATS1重组载体pCMV14-Lats1，具体按照Lipofectamin^TM2000转染试剂盒(美国Invitrogen公司产品)说明书进行转染。转染24小时后，将转染的细胞1：3传代，待细胞贴壁后，加入0.4毫克/毫升G418筛选，直至挑出阳性克隆细胞株。

实验同时设置向各供试细胞中转入pCMV14空载体的对照。

3、LATS1基因表达量检测

(1)RT-PCR检测

参照实施例2步骤二1进行。

其中，用于扩增LATS1基因的引物序列如下：

LATS1-F：5’-CACCCTTCTTGGATACCACAGC-3’；

LATS1-R：5’-CTGATTGACTCGTATGGAGGAACA-3’。

用于扩增内参GAPDH的引物序列如下：

GAPDH-F：5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’；

GAPDH-R：5’-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’。

结果显示，向各癌细胞中转入过表达LATS1重组载体pCMV14-Lats1后，细胞中LATS1在RNA水平表达量明显高于转入pCMV14空载体的对照。

(2)western blot检测

参见实施例2步骤二2进行。具体为采用Flag标签抗体检测LATS1-Flag融合蛋白的表达情况。

结果显示，向各癌细胞中转入过表达LATS1重组载体pCMV14-Lats1后，细胞中可检测到明显的LATS1-Flag融合蛋白信号。

4、检测过表达LATS1的癌细胞中YAP、S127-YAP、S100A7、S100A8和S100A9的表达情况

对过表达了LATS1的癌细胞在细胞长满培养皿底面积60-70％的密度下进行贴壁培养。培养时间为48h。

对不同处理的细胞进行western blot检测过表达LATS1的癌细胞中YAP、S127-YAP、S100A7、S100A8和S100A9的表达情况。western blot具体操作参见实施例2步骤二2进行。以GAPDH作为内参。

其中，用于检测YAP蛋白的一抗为YAP(63.7)(Santa Cruz Biotechnology公司，产品目录号为SC-101199)；二抗为Anti-IgG(H+L chain)(mouse)pAb-HRP(MBL公司，产品目录号为458)。用于检测S127-YAP蛋白的一抗为p-YAP(S127)Rabbit mAb(CST公司，产品目录号为D9W2I)；二抗为Anti-Rabbit IgG(H+L chain)-HRP(MBL公司，产品目录号为330)。用于检测S100A7蛋白的一抗为兔抗人S100A7(Psoriasin)抗体(Santa Cruz Biotechnology公司产品，产品目录号为SC67047)；二抗为Anti-Rabbit IgG(H+L chain)-HRP(MBL公司，产品目录号为330)。用于检测S100A8蛋白的一抗为anti-hS100A8(R&B公司产品，产品目录号为MAB4570)；二抗为Anti-IgG(H+L chain)(mouse)pAb-HRP(MBL公司，产品目录号为458)。用于检测S100A9蛋白的一抗为羊抗人S100A9(Calgranulin B)抗体(Santa Cruz Biotechnology公司产品，产品目录号为SC-8114)；二抗为donkey anti-goat IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology公司，产品目录号为SC-2020)。用于检测GAPDH蛋白的一抗为小鼠抗人GAPDH单抗(中杉金桥公司，产品目录号为TA-08)；二抗为Anti-IgG(H+L chain)(mouse)pAb-HRP(MBL公司，产品目录号为458)。

结果如图6所示：过表达LATS1后，S127-YAP水平提高，同时S100A7、S100A8和S100A9的表达水平也明显提高了(图6中A和B)。

二、沉默LATS1对癌细胞中S100A7、S100A8和S100A9的表达情况的影响

1、向各癌细胞中转入si-LATS1沉默细胞内源LATS1基因

在60mm培养皿中铺70万个癌细胞(HCC94细胞或A431细胞)，培养24h。将转染试剂(jetPRIME)、Buffer与用于干扰YAP基因(序列2)表达的siRNA混匀，静置10min，均匀滴加到培养基中。48h后收细胞备用。

其中，用于干扰LATS1基因(序列6)表达的siRNA为由如下C和D所示的两条单链退火而成的双链。

C：5’-GCAGCGUCUACAUCGUAAATT-3’(序列7)；

D：5’-UUUACGAUGUAGACGCUGCTT-3’(序列8)。

实验同时设置未经si-LATS1转染的相应细胞作为对照。

2、LATS1基因表达量检测

(1)RT-PCR检测

操作同步骤一。

结果显示，向各癌细胞中转入si-LATS1后，细胞中LATS1在RNA水平表达量明显低于未转入si-LATS1的对照。

(2)western blot检测

操作同步骤一。

结果显示，向各癌细胞中转入si-LATS1后，细胞中LATS1在蛋白水平表达量明显低于未转入si-LATS1的对照。

3、western blot检测沉默LATS1的癌细胞中YAP、S127-YAP、S100A7、S100A8和S100A9的表达情况

对沉默了LATS1的癌细胞的培养方式设置如下：悬浮培养；高密度贴壁培养(75000-150000/cm²培养面积)。培养时间为48h。

对不同处理的细胞进行western blot检测沉默LATS1的癌细胞中YAP、S127-YAP、S100A7、S100A8和S100A9的表达情况，具体操作同步骤一。

结果如图6所示：与未转入si-LATS1的对照(si-NC)相比，沉默内源性的LATS1表达可明显抑制YAP的磷酸化和S100A7、S100A8和S100A9在悬浮细胞和高密度培养的贴壁细胞中的表达(图6中C和D)。

本实施例结果表明，无论是沉默内源LATS1的表达，还是外源导入LATS1均可调控YAP的磷酸化水平和S100A7、S100A8和S100A9的表达。

实施例7、体内微环境可诱导S100A7、S100A8和S100A9在荷瘤组织中的表达

本发明的发明人将各癌细胞(NCI-H292细胞、HCC94细胞、A431细胞、FaDu细胞和H226Br细胞)分别接种到裸鼠皮下进行荷瘤。然后免疫组化检测荷瘤组织中S100A7、S100A8和S100A9的表达情况。具体如下：

一、将癌细胞接种裸鼠进行荷瘤

胰酶消化处于对数生长期、状态良好的各癌细胞，培养基重悬后离心收集细胞，用生理盐水(0.9％NaCl溶液)清洗三次后进行细胞计数；最终将细胞配制成为5×10⁷/mL的细胞悬液；向5周龄雌性裸鼠(来自于北京维通利华实验动物技术有限公司)前肢腋下双侧注射各100μL，饲养于SPF级环境中(北京大学医学部第三附属医院动物房)，观察其成瘤情况。

二、免疫组化方法同前步骤。

待小鼠荷瘤直径到达0.5-1cm时处死裸鼠，取下肿瘤在福尔马林中固定待用。按照如下进行免疫组化：

1、石蜡切片的制备

取福尔马林固定好组织块，梯度乙醇脱水后二甲苯透明，浸入溶解的石蜡中，浸蜡三次。随后将组织与熔蜡倒入包埋盒中，待冷却凝固后取下蜡块，放至石蜡切片机上切片，切片厚度5μm，切片放入42℃热水中摊片后用粘附载玻片捞，70℃烘箱内烤干备用。

2、组织免疫组化

取石蜡切片放入70℃烘箱内烤干1-2小时，二甲苯脱蜡后梯度醇水化。随后将片子及柠檬酸抗原修复液放入高压锅中高压加热1min 40s进行抗原修复。然后3％(体积分数)过氧化氢-PBS室温孵育15min灭火内源过氧化物酶，PBS洗一次后用3％(体积分数)牛血清-PBS室温封闭20min，随后孵育一抗过夜或37℃1h，PBS洗3次(每次10min)，孵育HRP标记的二抗，15min室温，PBS洗3次(每次5min)，DAB显色3min后苏木素复染，水洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明后封片，显微镜下观察染色情况”。

其中，用于检测S100A7蛋白的一抗为兔抗人S100A7(Psoriasin)抗体(Santa Cruz Biotechnology公司产品，产品目录号为SC67047)；二抗为快捷型酶标羊抗兔/鼠IgG聚合物(迈新试剂公司产品，产品目录号为KIT-5010)。用于检测S100A8蛋白的一抗为anti-hS100A8(R&B公司产品，产品目录号为MAB4570)；二抗为快捷型酶标羊抗兔/鼠IgG聚合物(迈新试剂公司产品，产品目录号为KIT-5010)。用于检测S100A9蛋白的一抗为羊抗人S100A9(Calgranulin B)抗体(Santa Cruz Biotechnology公司产品，产品目录号为SC-8114)；二抗为快捷型酶标兔抗羊IgG聚合物(迈新试剂公司，产品目录号为KIT-5107)。

结果如图7所示，可见与体外培养的细胞(见实施例1)相比，除了NCI-H292的荷瘤组织外，其他癌细胞的荷瘤组织内S100A7、S100A8和S100A9的阳性细胞数明显增多，尤其是H226Br和HCC94细胞的荷瘤组织中尤为显著。由此可见体内的微环境也可诱导S100A7、S100A8和S100A9在体内的表达。