营养不良性疾病的高效全身治疗的制作方法

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发明背景

杜氏肌营养不良症(DMD)是最常见的渐进性肌肉退行性疾病，影响大约每3500至5000出生男性中的一个。DMD是由位于X染色体上编码肌营养不良蛋白的基因缺失或突变引起的。肌营养不良蛋白是肌营养不良蛋白-糖蛋白复合物的装配所必需的，并为肌纤维的细胞骨架和细胞外基质之间提供机械和功能性连接。功能性肌营养不良蛋白的缺乏引起纤维变性、炎症、坏死和肌肉被疤痕和脂肪组织替代，导致进行性肌无力和在生命的第二和第四个十年由于呼吸和心脏衰竭导致的过早死亡(Moser,H.,Hum Genet,1984.66(1):第17-40页)。

所谓Becker型肌营养不良(BMD)疾病的一个温和形式与DMD的区别在于延迟发作，后来就是依赖于轮椅上的支持，以及较长的寿命跨度。BMD是由保持阅读框和该基因的最关键的部分突变造成的，导致截短的但仍有功能的肌营养不良蛋白(Muntoni F等,Lancet Neurol,2003)。

目前没有可用于DMD(Rodino-Klapac,L.R.等,Curr Neurol Neurosci Rep,2013.13(3):p.332)或BMD的治愈或有效治疗方法。常规疗法仅限于支持治疗，部分地减轻症状和体征，但不直接靶向疾病机制也不反转表型。

当前正在开发用于DMD的多种治疗策略，包括体内基因治疗、细胞移植治疗、药物救援DMD无义突变和外显子跳跃策略以修复DNA基因阅读框。所有这些策略都有需要克服的问题，包括靶向不同的肌肉群、递送的优化，转基因的长期表达和潜在的免疫应答(Jamin等,Expert Opin Biol Ther,2014)。

肌营养不良蛋白基因是人类基因组中最大的已知基因，并且由于太大以至于不能容纳在已知的基因治疗载体系统内。因此，就今天而言，实质有2种用病毒载体的DMD基因治疗策略：i)反义寡核苷酸的组成性表达以促进外显子跳跃，这仅适合于某些突变，以及ii)编码功能性、缩小尺寸的肌营养不良蛋白(“微肌营养不良蛋白”，也称为”小型营养蛋白”)的cDNA的组成型表达。

这两种策略，使用小型反义序列或使用微肌营养不良蛋白的，解决在DMD基因治疗中使用AAV载体的主要障碍，即他们的包装能力。AAV载体可容纳约4.7kb，而野生型肌营养不良蛋白的cDNA的大小约为14kb。为了克服这个问题，许多研究已经开发了部分缺失，但高度功能性的肌营养不良蛋白基因，其可以成功包装于AAV载体内，并显示出改善，尽管不能完全正常化动物模型中的肌营养不良表型。

mdx小鼠模型通常用于测试编码微肌营养不良蛋白新构建体。然而，这种模型也有缺点，因为mdx小鼠显示所述疾病的一个较不严重的形式，没有免疫反应。其它动物模型是GRMD狗，这被认为更可靠的预测基因治疗产物在人体中的治疗潜力(Kornegay等.,Mamm Genome,2012)。

在所有提出的微肌营养不良蛋白的序列中，Foster H.等(Mol Ther,2008.16(11):p.1825-32)在小鼠中，在重组AAV载体(rAAV2/8)中，在肌肉特异性启动子(Spc5-12)的控制下，比较了微小肌营养不良蛋白(microdystrophin)基因的两种不同配置ΔAB/R3-R18/ΔCT和ΔR4-R23/ΔCT。据报道，微小肌营养不良蛋白(microdystrophin)的密码子人类优化改善了在mdx小鼠模型中的基因转移和肌肉功能。静脉注射3.10¹¹vg总rAAV/8允许高效心脏基因转移和在骨骼肌和隔膜内显著地肌营养不良蛋白的表达。

关于CXMDj狗，Ohshima S.等(Mol Ther,2009.17(1):第73-80页)报道了通过肢体灌注，即在压力下静脉内注射，将在CMV启动子控制下的编码M3微小肌营养不良蛋白(microdystrophin)的rAAV8施用到狗。

Zhang Y.等(Hum Mol Genet,2013.22(18):第3720-29页)研究了在DMD小鼠中的全身(5.10¹²vg总)双重AAV9基因治疗。通过同源重组，通过尾静脉注入的双重AAV载体重构含有肌营养不良蛋白重复R16和R17的nNOS结合微小肌营养不良蛋白。

同样地，Odom G.等(Mol Ther,2011.19(1):第36-45页)论证了在小鼠中，重构编码ΔH2-R19微小肌营养不良蛋白的表达盒，随后血管内共递送两种共享一个中央同源重组的区域的rAAV6载体(2.10¹²vg总)。

Wang B.等(J Orthop Res.2009；27(4):第421-6页)在新生小鼠(dKO和mdx)中腹膜内(i.p.)注射3.10¹¹vg总rAAV1载体。这些AAV载体编码微小肌营养不良蛋白(microdystrophin)Δ3990，其置于MCK或CMV启动子控制之下。

Koppanati等(Gene therapy.2010；17(11):第1355-62页)报道了在mdx小鼠子宫内基因转移，通过腹膜内注射(i.p.)6.4.10¹¹vg总rAAV8载体，其编码置于CMV启动子控制之下的犬微小肌营养不良蛋白。

Schinkel等(Human Gene therapy.2012；23(6):第566-75页)报道了在mdx小鼠中心脏基因治疗，通过静脉内(IV)注射10¹²vg总rAAV9载体，其编码置于CMV启动子或心脏特异性MLC0.26启动子控制下的微小肌营养不良蛋白。

Gregorevic等(Mol.Therapy 2008；16(4):第657-64页)报道了在mdx小鼠中肌肉基因治疗，通过静脉内(IV)注射10¹³vg总rAAV6载体，其编码置于CMV启动子控制下的ΔR4-R23/ΔCT微小肌营养不良蛋白。

Shin等(Gene Therapy 2011；18(9):第910-19页)报道了在mdx小鼠中心脏基因治疗，通过静脉内(IV)注射3.10¹²vg总rAAV9载体，其编码置于CMV启动子控制下的hΔCS2微小肌营养不良蛋白。

Shin等(J.of Gene Medicine 2008；10(4):第449页)在小鼠中比较了通过皮下注射或静脉内注射对于编码置于CMV启动子控制下的ΔCS2微小肌营养不良蛋白rAAV8的递送效率。

Colgan等(Mol.Therapy 2014；22(S1):第S197页)报道了在dKO小鼠中，微小肌营养不良蛋白和卵泡抑素(follistatin)通过静脉注射rAAV6载体的组合基因递送。

在DMD的情况下，有价值的治疗的解决方案是具有以下特征的基因治疗产品：

-可以合理的剂量(即，在靶组织中适当的基因转移)并可能通过独特的注射全身施用的产品；

-在所述剂量下具有可接受的毒性，并且特别是不会诱导针对肌营养不良蛋白的不良免疫应答的产品；

-具有满意的向性，即在骨骼肌、而且还包括隔膜和心肌的大区域内具有广泛的基因转移的产品；

-能够改善人类的营养不良疾病的产品。

在实践中，以前的报道表明，这是一个非常具有挑战性的任务，并且和若干尝试已经失败：

使用CMV启动子下编码人类特异性，但不是密码子优化的微小肌营养不良蛋白(AR4-R23/ACT)的AAV2/6载体的研究导致注射的CXMDj狗肌肉纤维的有限表达，并且在停止免疫抑制后6周，初始肌内注射后22周通过免疫系统被最终破坏(Wang,Z.等,Mol Ther,2007.15:第1160-66页)。

基于CMV启动子下编码人类特异性，但不是密码子优化的微小肌营养不良蛋白(ΔR3-R21/ΔCT)的肌肉内注射临床试验导致非常有限的转基因表达和不适当的免疫应答(Mendell,JR等,N Engl J Med,2010.363(15):第1429-37页；Bowles,DE.等,Mol Ther,2012.20(2):第443-55页)。

因此，在生存期、总体临床评分、消化系统、心脏和/或呼吸功能方面，本领域需要人类营养不良疾病的有效治疗方法。

发明简述

本发明的目的在于通过表达较短但功能性的称为微小肌营养不良蛋白的肌营养不良蛋白多肽来减轻或治愈破坏性杜氏肌营养不良症(DMD)。

本发明首次提供一种有前途的基因治疗产品，在AAV8衣壳中壳体化的序列优化的微小肌营养不良蛋白，用于治疗营养不良性疾病。单次剂量的全身性静脉内给药后，不仅是在多个肌肉中高度表达微小肌营养不良蛋白，而且导致肌肉病理的改善和改善的临床结果测量。

事实上，在狗的模型获得这么好的效果，在以下方面：肌肉、消化系统、呼吸系统和心脏抢救、在良好的条件下与延长的寿命相关，关于这种病理目前从未报道。

定义

冠词“一”和“一个”在本文中用于指一个或多于一个(即，至少一个)所述冠词的语法对象。通过举例的方式，“一个元件”意指一个元件或多于一个元件。

“关于”或“近似”在本文中用于涉及可测量值，例如数量、时间期限等时，是指包括从指定的值变化±20％或±10％，更优选的±5％，甚至更优选的±1％，并且还更优选的±0.1％，因为这些变化适于执行所公开的方法。

范围：贯穿本发明，本发明的各个方面可以以范围形式呈现。应当理解的是，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应该被解释为对本发明的范围的硬性限制。因此，范围的描述应当被认为具有该范围内具体公开的所有可能的子范围以及单独的数值。例如，范围的描述，例如从1到6应被认为具有具体公开的子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及在该范围内的单独的数值，例如，1，2，2.7，3，4，5，5.3和6。这适用而不考虑范围的宽度。

“分离的”是指改变或从自然状态中移除。例如，核酸或肽天然存在于活的动物内不是“分离的”，但同样的核酸或肽部分或完全分离自其天然状态的共存材料是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或者可以在非天然环境，例如宿主细胞中存在。

在本发明的上下文中，使用通常存在的核酸碱基的下述缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，和“U”是指尿苷。

除非另有说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括互为简并形式并编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白或RNA或cDNA的短语核苷酸序列也可包括内含子，其包括程度为编码所述蛋白的核苷酸序列可以在一些版本含有一个(多个)内含子。

“编码”指的是在多核苷酸，如基因、cDNA或mRNA的核苷酸的特定序列的固有的属性，以作为在生物过程中合成具有限定的核苷酸序列(即rRNA,tRNA和mRNA)或者限定的氨基酸序列、并由此产生的生物学特性的其它聚合物或大分子的模板。因此，基因编码蛋白质，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞内或其他生物系统中产生蛋白的话。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同且通常在序列表中提供)，和用作基因或cDNA转录模板的非编码链都可称为编码该蛋白或基因或cDNA的其它产品。

如本文所用的术语“多核苷酸”被定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，核酸和本文所用的多核苷酸是可互换的。本领域技术人员具有核酸是多核苷酸，其可水解成单体“核苷酸”的一般知识。单体核苷酸可以水解成核苷。本文所用的多核苷酸包括，但不限于，通过本领域任何可用的手段获得的所有核酸序列，包括，但不限于，重组方法，即，使用普通的克隆技术和PCR等，以及通过合成方法，从重组文库或细胞基因组中克隆核酸序列。

如本文所用，术语“肽”，“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对于可以组成蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括包含两个或多个氨基酸通过肽键彼此连接的任何肽或蛋白。如本文所用，该术语指短链，这在本领域也通常指肽，例如寡肽和寡聚体，和长链，其通常在本领域中是指为蛋白质，其中有许多类型。“多肽”包括，例如，生物活性片段，基本上同源的多肽，寡肽，二聚体，异二聚体，多肽的变体，修饰的多肽，衍生物，类似物，融合蛋白，等等。所述多肽包括天然的肽，重组肽，合成肽，或其组合。

“相同”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列相同性。当两个进行比较的序列中的位置由相同碱基或氨基酸单体亚单位占据，例如在每两个DNA分子的一个位置由腺嘌呤占据，则分子在该位置同源或相同。两个序列之间的同源性/相同性的百分比是两个序列共享匹配位置的数目除以位置数相比×100的函数。例如，如果两个序列中10个位置中的6个匹配，则两个序列60％相同。通常，当两个序列进行比对时进行对比以得到最大同源性/相同性。

“载体”是物质的组合物，其包含分离的核酸和可用于将所述分离的核酸递送到细胞内部的物质。许多载体是本领域公知的，包括但不限于，线性多核苷酸，与离子的或两亲性化合物相关的多核苷酸，质粒，和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应被理解为包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，如，例如，聚赖氨酸化合物，脂质体，和类似物。病毒载体的实例包括，但不限于，腺病毒载体，腺相关病毒载体，逆转录病毒载体，和类似物。

“表达载体”指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包括可操作地连接于待表达核苷酸序列的控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括所有本领域中已知的那些，如粘粒，质粒(例如，裸的或包含在脂质体中的)和病毒(例如，慢病毒，逆转录病毒，腺病毒，和腺相关病毒)，其纳入所述重组多核苷酸。

如本文所用，术语“启动子”定义为细胞的合成机制或引进的合成机制识别，启动多核苷酸序列的特异性转录所需要的DNA序列。

如本文所用，术语“启动子/调控序列”是指一核酸序列，这是可操作地连接至启动子/调控序列的基因产物的表达所需要的。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列和在其他情况下，该序列还可包括增强子序列和其他调控元件，它们所述基因产物的表达必需的。所述启动子/调控序列可以是，例如，是这样一种，其以组织特异性方式表达所述基因产物。

“组成型”启动子是一核苷酸序列，当它可操作地连接于编码或指定基因产物的多核苷酸时，导致所述基因产物在细胞的大多数或所有生理条件下在细胞中产生。

“诱导型”启动子是一核苷酸序列，当它可操作地连接于编码或指定基因产物的多核苷酸时，导致所述基因产物基本上只在所述细胞中存在对应于所述启动子的诱导物时在细胞中产生。

“组织特异性”启动子是一核苷酸序列，当它可操作地连接于编码或指定基因的多核苷酸时，导致所述基因产物优先在如果所述细胞是对应于所述启动子的组织类型的细胞时在细胞中产生。

术语“不正常”，当在生物体，组织，细胞或其组分的上下文中使用时，是指那些生物体，组织，细胞或其组分，其在至少一种可观察或可检测的特征方面(例如，年龄，治疗，时间等)不同于那些显示“正常”(预期)相应特性的生物体，组织，细胞或其组分。对于一种细胞或组织类型，正常或预期的特征对于不同的细胞或组织类型可能是异常的。

术语“患者”，“受试者”，“个体”等在本文中可互换使用，并且指可适用于本文所述方法的任何动物或其细胞，无论是体外还是原位。在某些非限制性实施方案中，患者，受试者或个体是人。

“疾病”是动物的健康状态，其中动物不能维持体内平衡，并且其中如果所述疾病没有改善，则动物的健康继续恶化。相比之下，动物中的“病症”是健康状态，其中所述动物能够维持体内平衡，但是其中动物的健康状况比不存在所述病症时更差。未经治疗，病症不一定引起动物健康状态的进一步降低。

如果疾病或病症的症状的严重程度，患者经历的这种症状的频率，或两者都减轻，则疾病或病症被“减轻”或“改善”。这还包括阻止所述疾病或病症的进展。如果疾病或病症的症状的严重程度，患者经历这种症状的频率，或两者都消除，则疾病或病症被“治愈”。

“治疗性”治疗是对表现出病理学体征的受试者施用的治疗，目的是减少或消除这些体征。

如本文所用，“治疗疾病或病症”是指降低受试者经历的疾病或病症的至少一种体征或症状的频率或严重程度。疾病和病症在本文中在治疗的上下文中可互换使用。

化合物的“有效量”是足以对施用该化合物的受试者提供有益效果的化合物的量。本文所用的短语“治疗有效量”是指足以或有效预防或治疗(延迟或防止发作，阻止其进展，抑制，减少或逆转)疾病或病症的量，包括减轻这些疾病的症状。递送载体的“有效量”是足以有效结合或递送化合物的量。

具体实施方式/发明详述

在一个实施方案中，本发明涉及包含用于治疗受试者的营养不良性疾病的基因治疗产品的组合物，其中：

-所述基因治疗产物包含编码功能性微肌营养不良蛋白的核酸序列；

-所述组合物全身施用。

换言之，本发明提供了用于治疗受试者的营养不良性疾病的方法，包括向受试者全身施用包含编码功能性微肌营养不良蛋白的核酸序列的组合物。

在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗受试者的营养不良性疾病的方法，包括向受试者全身施用包含编码功能性微肌营养不良蛋白的核酸序列的基因治疗产品。本发明涉及包含编码功能性微肌营养不良蛋白的核酸序列的基因治疗产品用于制备为治疗营养不良性疾病的药物的用途，其中所述药物是全身性施用的。

根据第一方面，本发明涉及用于治疗受试者的营养不良性疾病的基因治疗产品。

通常，基因治疗产品由2种组分制成：

-壳体化的重组核酸序列，其限定一旦在靶细胞/组织中表达就提供治疗益处的表达盒；和

-病毒衣壳，其允许适当的基因转移和一定程度的组织嗜性。

根据一个方面，所述基因治疗产品包含编码功能性微肌营养不良蛋白的核酸序列。

在本发明的框架中，微肌营养不良蛋白是指比天然或野生型肌营养不良蛋白更短的肽或蛋白质。在本发明的上下文中，术语“微肌营养不良蛋白”和“小型肌营养不良蛋白”具有相同的含义。在本申请的其余部分中，将使用术语“微肌营养不良蛋白”，以及缩写“MD”或“μDys”。

“功能性”微肌营养不良蛋白是指相应的肽或蛋白质能够执行野生型肌营养不良蛋白的至少一些功能，并且能够至少部分减轻与缺少天然肌营养不良蛋白相关的一种或多种症状，特别是纤维变性，炎症，坏死，肌肉被瘢痕和脂肪组织替代，肌肉无力，消化系统，呼吸系统和心脏衰竭，以及过早死亡。

肌营养不良蛋白的结构已被充分证明(参见图1)，并且已经公开了其活性片段(Athanasopoulos等,Gene Ther 2004 Suppl 1:S109-21)。如本领域所理解的，活性片段是全长序列的一部分或多个部分，其保留全长序列的生物学功能。

全长肌营养不良蛋白的特征在于不同的结构域：

-结合肌动蛋白的N-末端结构域；

-4个铰链结构域(H1至H4)；

-24个血小板样重复或棒结构域(1至24)；

-富含半胱氨酸的结构域；

-C末端结构域。

根据一个实施方案，微肌营养不良蛋白具有至少一个缺失的结构域，有利地至少一个血小板样重复序列。

根据一个具体实施方案，微肌营养不良蛋白具有ΔR4-R23/ΔCT的构型，其包含4个血小板样重复序列，即如图1所示的血小板样重复序列1,2,3和24。更精确地，这一序列包含肌营养不良蛋白的棒结构域4-23和CT结构域的外显子71-78的缺失，并且包含肌营养不良蛋白的外显子79的最后三个氨基酸，其后是三个终止密码子。

这种称为ΔR4-R23/ΔCT或MD1的微肌营养不良蛋白具有例如SEQ ID NO：3,4或7所示的氨基酸序列。

在一个实施方案中，编码功能性微肌营养不良蛋白的核酸序列(也称为“开放阅读框”，ORF)是cDNA。然而，可以使用例如单链或双链DNA或RNA。

在一个具体的实施方案中，本发明提供了包含比野生型肌营养不良蛋白cDNA短的核酸序列的组合物。

当用于可容纳约4.7kb的AAV载体的情况下，编码功能性微肌营养不良蛋白的核酸序列以及其正确表达所需的所有序列不应超过该包装能力。在一个实施方案中，编码功能性微肌营养不良蛋白的核酸序列不超过4500、4000bp，优选3900、3800、3700、3600或甚至3500bp。

编码功能性微肌营养不良蛋白的核酸序列有利地是人来源的，但也可以是非人灵长类动物，犬，大鼠或鼠序列。在一个实施方案中，所述核酸序列源自其将被施用的生物体(例如人类中的人序列)。

根据另一个实施方案，编码所述微肌营养不良蛋白的核酸序列被优化用于给定受试者，有利地用于人。优选地，该优化的序列如下修改：

-修改序列以在mRNA内AUG起始密码子之前包括共有Kozak序列，以改善翻译的起始。

-基于人中转移RNA频率的优化序列，并且增加GC含量以促进RNA稳定性。因此并且在特定情况下，人类的密码子优化有利地导致63％的密码子被修改，并且GC含量增加到超过60％。这当然取决于原始(优化前)微肌营养不良蛋白序列和靶向宿主。

根据一个实施方案，所述编码功能性微肌营养不良蛋白的核酸序列对应于：

-序列SEQ ID NO：1的核苷酸586至4185，如SEQ ID NO：5所示；或

-序列SEQ ID NO：2的核苷酸586至4188，如SEQ ID NO：6所示。

根据一个实施方案，所述序列可以是编码微肌营养不良蛋白的分离的核酸，所述微肌营养不良蛋白与本文公开的肽，尤其是序列SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4或甚至SEQ ID NO：7，具有基本同源性或相同性(60％，70％，80％，90％，95％或甚至99％)。

优选地，编码本发明的肽的分离的核酸的核苷酸序列与编码功能性微肌营养不良蛋白，特别是序列SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或甚至SEQ ID NO：8的分离的核酸的核苷酸序列“基本同源/相同”，即约60％同源，更优选地约70％同源，甚至更优选地约80％同源，更优选地约90％同源，甚至更优选地约95％同源，以及甚至更优选地约97％，98％或甚至99％同源。

根据另一方面，由本发明的表达载体携带的核苷酸序列与序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2是“基本上同源的/相同的”，即约60％同源，更优选地约70％同源，甚至更优选地约80％同源，甚至更优选地约90％同源，甚至更优选地约95％同源，以及甚至更优选地约97％，98％或甚至99％同源。

在另一个实施方案中，所述组合物包含质粒或载体。根据一个具体实施方案，将分离的核酸插入载体中。简言之，天然或合成核酸的表达通常通过将核酸或其部分可操作地连接至启动子，并将该构建物并入表达载体中来实现。待使用的载体适合于复制和，任选地，整合入真核细胞中。典型的载体含有转录和翻译终止子，起始序列和用于调控所需核酸序列表达的启动子。

在一个实施方案中，所述组合物包含表达载体，有利地是病毒载体。特别感兴趣的是包装能力不允许负载(野生型)肌营养不良蛋白基因，包括(野生型)肌营养不良蛋白cDNA的表达载体。

在一个实施方案中，所述病毒载体选自下组：杆状病毒载体，疱疹病毒载体，慢病毒载体，逆转录病毒载体，腺病毒载体和腺相关病毒(AAV)载体。

根据本发明的具体实施方案，含有表达构建物的病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。

腺相关病毒(AAV)载体已经成为用于治疗各种病症的强有力的基因递送工具。AAV载体具有使它们理想地适合于基因治疗的许多特征，包括缺乏致病性，中等免疫原性和以稳定和有效的方式转导有丝分裂后细胞和组织的能力。通过选择AAV血清型，启动子和递送方法的适当组合，可以将包含在AAV载体内的特定基因的表达特异性靶向一种或多种类型的细胞。

在一个实施方案中，编码序列包含在AAV载体内。已知超过100种天然存在的AAV血清型。AAV衣壳中存在许多天然变体，允许鉴定和使用具有特别适合营养不良病理的性质的AAV。AAV病毒可以使用常规分子生物学技术工程改造，使得可以优化这些颗粒以用于核酸序列的细胞特异性递送，最大程度降低免疫原性，调节稳定性和颗粒寿命，有效降解，精确递送至细胞核。

如上所述，AAV载体的使用是DNA的外源递送的共同模式，因为其相对无毒，提供有效的基因转移，并且可以容易地为特定目的优化。在从人或非人灵长类动物(NHP)分离并且充分表征的AAV的血清型中，人血清型2是作为基因转移载体开发的第一个AAV。其他目前使用的AAV血清型包括AAV1，AAV3，AAV4，AAV5，AAV6，AAV7，AAV8，AAV9，AAV10，AAV11和AAV12。此外，非天然工程改造的变体和嵌合AAV也可以是有用的。

用于装配到载体中的理想的AAV片段包括帽蛋白，包括vp1，vp2，vp3和高可变区，rep蛋白，包括rep78，rep68，rep52和rep40，以及编码这些蛋白的序列。这些片段可以容易地用于多种载体系统和宿主细胞中。

这样的片段可以单独使用，与其他AAV血清型序列或片段组合使用，或与来自其他AAV或非AAV病毒序列的元件组合使用。如本文所用，人工AAV血清型包括但不限于具有非天然存在的衣壳蛋白的AAV。这样的人工衣壳可以通过任何合适的技术，使用选择的AAV序列(例如，vp1衣壳蛋白的片段)与可以从不同的选择的AAV血清型、同一AAV血清型的非连续部分、非AAV病毒来源或非病毒来源获得的异源序列组合产生。人工AAV血清型可以是但不限于嵌合AAV衣壳，重组AAV衣壳或“人源化”AAV衣壳。因此，示例性AAV或人工AAV包括AAV2/8(US 7,282,199)，AAV2/5(可从国立卫生研究院获得)，AAV2/9(WO2005/033321)，AAV2/6(US 6,156,303)和AAVrh8WO2003/042397)。在一个实施方案中，用于本文所述的组合物和方法的载体至少含有编码所选AAV血清型衣壳，例如AAV8衣壳或其片段的序列。在另一个实施方案中，有用的载体至少含有编码所选AAV血清型rep蛋白(例如AAV8rep蛋白)或其片段的序列。任选地，这样的载体可以含有AAV cap和rep蛋白。在其中提供AAV rep和cap两者的载体中，AAV rep和AAV帽序列都可以是一种血清型来源，例如都是AAV8来源。或者，可以使用的载体中rep序列来自的AAV血清型不同于提供cap序列的血清型。在一个实施方案中，rep和cap序列从不同的来源(例如，分开的载体，或宿主细胞和载体)表达。在另一个实施方案中，这些rep序列在框架中与不同AAV血清型的cap序列融合以形成嵌合AAV载体，如AAV2/8(US 7,282,199)。

根据一个实施方案，组合物包含血清型2,5,8或9的AAV。有利地，要求保护的载体是AAV8或AAV9载体，特别是AAV2/8或AAV2/9载体。更有利地，要求保护的载体是AAV8载体或AAV2/8载体。

在用于本发明的AAV载体中，AAV基因组可以是单链(ss)核酸或双链(ds)/自身互补(sc)核酸分子。

有利地，将编码功能性微肌营养不良蛋白的核酸序列插入AAV载体的ITR(《反向末端重复》)序列之间。典型的ITR序列对应于：

-序列SEQ ID NO：1或序列SEQ ID NO：2的核苷酸1至128(5'ITR序列)；

-序列SEQ ID NO：1的核苷酸4511至4640或序列SEQ ID NO：2的核苷酸4514至4643(3'ITR序列)。

重组病毒颗粒可以通过本领域技术人员已知的任何方法获得，例如通过共转染293HEK细胞，通过单纯疱疹病毒系统和通过杆状病毒系统。载体滴度通常表示为每mL病毒基因组(vg/mL)。

在一个实施方案中，表达载体包含调控序列，特别是启动子序列。这样的启动子可以是天然或合成的(人工)启动子，诱导型或组成型。

在一个实施方案中，启动子是普遍存在的启动子或具有低组织特异性。作为实例，表达载体可以携带磷酸甘油酸激酶1(PGK)，EF1，β-肌动蛋白，CMV启动子。

在优选的实施方案中，选择启动子序列以便在表达水平方面，但也在组织特异性方面充分控制位于其控制下的核酸序列的表达。在一个实施方案中，表达载体包含肌肉特异性启动子。这样的启动子允许在骨骼肌，并且可能在心肌以及在隔膜中的强力表达。本领域技术人员已知的合适启动子的示例是例如，结蛋白启动子，肌肉肌酸激酶(MCK)启动子，CK6启动子和Syn启动子。另一个启动子是如序列SEQ ID NO：1或2(核苷酸215至537)所示的合成启动子C5-12(spC5-12)，其允许在骨骼和心肌中的强力表达。

其他可能的调控序列的非穷尽列表是：

-聚腺苷酸化信号，例如，感兴趣的基因的多聚A，SV40或β血红蛋白(HBB2)的多聚A，有利地位于编码功能性微肌营养不良蛋白的序列的3'端；SV40的多聚A在序列SEQ ID NO：1(核苷酸4223至4353)和SEQ ID NO：2(核苷酸4226至4356)中公开；

-用于转录物稳定化的序列，例如血红蛋白(HBB2)的内含子1；

-增强子序列；

-miRNA靶序列，其可以抑制编码功能性肌营养不良蛋白的序列在非靶组织中的表达，其中所述表达是不需要的，例如其可以是毒性的。优选地，相应的miRNA不存在于骨骼肌中，并且可能不存在于隔膜中或心脏中。

根据一个实施方案，所述基因治疗产品包含表达载体，有利地为携带序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2，有利地为SEQ ID NO：1的AAV载体。如上所述，本发明还涵盖与序列SEQ ID NO：1或2“基本上同源”的序列，即显示约60％的同源性，更优选地约70％同源性，甚至更优选地约80％同源性，更优选地约90％同源性，甚至更优选地约95％同源性，以及甚至更优选地约97％、98％或甚至99％的同源性。

根据本发明，组合物至少包含所述基因治疗产品和可能的其它活性分子(其它基因治疗产品，化学分子，肽，蛋白质等)，专用于治疗相同疾病或另一种疾病。

根据具体实施方案，所述组合物不包含任何免疫抑制剂。

本发明然后提供包含本发明的核酸或本发明的载体的药物组合物。此类组合物包含治疗有效量的治疗剂(本发明的核酸或载体)和药学上可接受的载体。在具体实施方案中，术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的监管机构批准的或在美国或欧洲药典或其他公认的药典中列出的用于动物和人的。

术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂，佐剂，赋形剂或媒介。这样的药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油，动物，植物或合成来源的那些，例如花生油，大豆油，矿物油，芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。盐溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，硬脂酸钠，甘油单硬脂酸酯，滑石，氯化钠，脱脂奶粉，甘油，丙二醇，水，乙醇等。

如果需要，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液，悬浮液，乳液，缓释制剂等形式。合适的药物载体的实例描述于E.W.Martin的“《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)”。这样的组合物将含有治疗有效量的治疗剂，优选以纯化形式，与合适量的载体一起，以提供用于向受试者适当施用的形式。

在优选的实施方案中，根据常规程序将组合物配制为适合于静脉内施用于人的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂例如利多卡因，以在注射部位缓解疼痛。

在一个实施方案中，根据本发明的组合物适合于在人中施用。组合物优选为液体形式，有利地为盐水组合物，更有利地为磷酸盐缓冲盐水(PBS)组合物或林格氏乳酸盐溶液。

可有效治疗营养不良性疾病的本发明治疗剂(即核酸或载体)的量可通过标准临床技术确定。此外，可以任选地使用体内和/或体外测定来帮助预测最佳剂量范围。在制剂中使用的精确剂量还将取决于施用途径、重量和疾病的严重性，并且应当根据医生的判断和每个患者的情况来决定。

合适的施用应该允许将治疗有效量的基因治疗产品递送到靶组织，特别是骨骼肌和可能的平滑肌(例如食管)，隔膜和心脏。在本发明的上下文中，当基因治疗产品是包含编码功能性微肌营养不良蛋白的核酸序列的病毒载体时，治疗剂量定义为施用于受试者每千克(kg)体重的含有微营养不良蛋白序列的病毒颗粒的量(病毒基因组的vg)。

可用的给药途径是局部(局部)，肠内(全系统效应，但通过胃肠道(GI)道递送)或胃肠外(全身作用，但通过GI道以外的途径递送)。本文公开的组合物的优选给药途径是胃肠外给药，其包括肌内给药(即进入肌肉)和全身给药(即进入循环系统)。在本文中，术语“注射”(或“灌注”或“输注”)包括血管内的，特别是静脉内(IV)和肌内(IM)给药。注射通常使用注射器或导管进行。

在一个实施方案中，组合物的全身递送包括在局部治疗部位附近，即在弱化肌肉附近的静脉或动脉中施用组合物。在某些实施方案中，本发明包括组合物的局部递送，其产生全身效应。这种给药途径，通常称为“局部(局部)输注”，“通过孤立肢体灌注给药”或“高压经静脉肢体灌注”已经成功地用作肌营养不良症中的基因递送方法(Zheng Fan等.(2012,Molecular Therapy 20(2),456-461)。

根据一个方面，通过输注或灌注将组合物施用于分离的肢体(局部-区域)。换言之，本发明包括在腿和/或手臂中通过血管内施用途径，即静脉(经血管)或动脉在压力下局部递送组合物。这通常通过使用止血带暂时阻止血液循环，同时允许灌注产品的区域扩散来实现，例如，公开于Toromanoff等(2008,Molecular Therapy 16(7):1291-99),Arruda等(2010,Blood 115(23):4678-88)和Fan等(2012,Molecular Therapy 20(2),456-461)。

在一个实施方案中，将组合物注射到受试者的肢体中。在一个实施方案中，受试者是哺乳动物，优选人，狗或非人灵长类动物。当受试者是人时，所述肢体可以是手臂或腿。根据一个实施方案，组合物在受试者身体的下部施用，例如，在膝盖下方，或在受试者的身体的上部，例如在肘下方。

在一个实施方案中，将组合物施用于外周静脉，例如，头静脉。待输注的组合物的体积可以在肢体体积的约5％至40％之间变化的范围内。典型的剂量可以在5和30ml/kg体重之间变化。在一个实施方案中，待施加的压力(止血带压力或最大管线压力)低于100 000Pa，有利地低于50 000Pa。在优选实施方案中，施加的压力为约300托(40 000Pa)。

在一个实施方案中，使用止血带停止肢体的血液循环，止血带收紧几分钟至多于一小时，通常在约1至80分钟之间，例如约30分钟。在优选的实施方案中，在施用之前，期间和之后应用止血带，例如在输注之前约10分钟，在输注期间约20分钟和输注之后约15分钟。更一般地，施加压力几分钟，通常在约1至80分钟之间，例如约30分钟。在优选的实施方案中，在施用之前，期间和之后施加压力，例如在输注之前约10分钟，在输注期间约20分钟和在输注之后约15分钟。

在一个实施方案中，平均流速为5至150ml/min，有利地为5至80ml/min，例如10ml/min。当然，流速还决定血液循环停止的时间段和施加的压力。

在局部-区域施用的情况下，注射的剂量可以在10¹²和10¹⁴vg/kg患者体重之间变化，优选在10¹²和10¹³vg/kg之间。

根据本发明的优选的施用方法是全身施用。系统性注射打开了全身注射的方式，以便到达包括心脏和膈肌的受试者身体的整个肌肉，然后是实际治疗这些全身性和仍然不可治愈的疾病。在某些实施方案中，全身递送包括将组合物递送至受试者，使得组合物在受试者的整个身体中可及。

根据优选的实施方案，全身给药通过在血管中注射组合物进行，即血管内(静脉内或动脉内)给药。根据一个实施方案，通过外周静脉作静脉内注射施用组合物。

全身给药通常在以下条件下进行：

-1至10mL/min，有利地1至5mL/min的流速，例如3mL/min；

-总注射体积可以在1至20mL之间变化，优选5mL载体制剂/kg受试者体重。注射体积不应超过总血量的10％，优选地约6％。

当全身递送时，组合物优选以小于或等于10¹⁵vg/kg或甚至10¹⁴vg/kg的剂量施用，有利地为10¹²vg/kg至10¹⁴vg/kg，更有利地为5.10¹²vg/kg至10¹⁴vg/kg/kg，例如1,2,3,4,5,6,7,8或9.10¹³vg/kg。也可考虑较低剂量例如1,2,3,4,5,6,7,8或9.10¹²vg/kg，以避免潜在的毒性和/或免疫反应。如技术人员已知的，优选在效率方面给出令人满意的结果的尽可能低的剂量。

在具体实施方案中，治疗包括单次施用组合物。

如将在下面的实施例中说明的，本发明的基因治疗产品的施用不认为与不良免疫反应相关。因此，根据一个实施方案，所述施用不与任何进一步或额外的免疫抑制治疗(免疫抑制)组合。

在一个实施方案中，观察基因治疗产品的存在和/或功能性微营养不良蛋白的表达以及相关的治疗益处，持续长达1个月，或3个月或6个月，或甚至1年，2年，5年，10年，甚至受试者的整个生命。

根据本发明，受试者是哺乳动物，优选人或狗，但也可以是小鼠，大鼠或非人灵长类动物。

“营养不良疾病”是指与肌营养不良蛋白基因缺陷相关的疾病。该缺陷可以是导致低水平的表达或缺失表达的缺失或突变，在开放阅读框中引入提前终止密码子或产生无活性的蛋白质。优选的营养不良性疾病是由肌营养不良蛋白基因的突变引起的杜氏和贝克肌营养不良(DMD/BMD)。所述突变可导致肌营养不良蛋白表达的缺失或低水平，或者产生部分或完全失活的，可能截短的蛋白质。

可受益于本发明的组合物的受试者包括所有诊断为肌营养不良或有发展为这类肌肉营养不良的风险的患者。然后可以基于肌营养不良蛋白基因中的突变或缺失的鉴定，通过本领域技术人员已知的任何方法来选择待治疗的受试者，包括例如肌营养不良蛋白基因的测序，和/或通过本领域技术人员已知的任何方法评价肌营养不良蛋白的表达或活性水平。因此，所述受试者包括已经表现出营养不良疾病症状的受试者和具有发展所述疾病风险的受试者。在一个实施方案中，所述受试者包括已经表现出营养不良性疾病症状的受试者。在另一个实施方案中，所述受试者是流动患者和早期非流动患者。

这种组合物特别意在用于基因治疗，特别是用于治疗杜氏肌营养不良(DMD)或贝克肌营养不良(BMD)，有利地是DMD。

本发明的第一个目的是提供安全(无毒)治疗。另一个目的是提供有效的治疗，其允许推迟，减缓或防止疾病的发展，并且可能改善可以在临床水平上容易监测的患者的表型。

在受试者中，可以使用本发明的组合物：

-用于改善肌肉功能。特别感兴趣的是骨骼肌，以及心肌和膈肌；

-用于改善步态；

-用于改善心脏功能；

-用于改善呼吸功能；

-用于改善消化功能；和/或

-用于延长生存期，更一般地改善生活的质量和期望。

根据一个方面，本发明涉及用于改善肌肉功能，步态，消化功能，心脏功能和/或呼吸功能，和/或用于延长生存期，有利地无副作用(细胞和/或体液免疫应答)的方法，包括向有需要的受试者施用治疗量的如上所公开的基因治疗产品。

有利地，所述改善在给药后长达1个月，或3个月或6个月或9个月，更有利地在给药后长达1年，2年，5年，10年或甚至在受试者整个生命中观察到。

在一个实施方案中，所述改善导致症状严重程度和/或频率的减轻，和/或延迟出现，其中所述症状选自下组：频繁跌倒，不能行走，吞咽困难，心肌病，涎分泌过多(ptyalism)，运动技能降低(跑，蹦，跳)，呼吸异常，假性肥大，腰椎突起和肌肉僵硬。

所述功能的改善可以基于本领域已知的方法评估，例如：

-评估表达肌营养不良蛋白的肌纤维的百分比；

-步行测试；

-通过测力计测量的强度评估；

-通过运动功能测量评估精确肢体的运动功能；

-使用运动监测器评估全身活动；

-通过3轴加速度记录评估步态；

-通过超声心动图，多普勒分析和斑点跟踪分析评估心脏功能；

-通过评估隔膜动力学评估呼吸功能；

-通过临床随访评估重要功能，特别是心脏，呼吸和消化功能；

-通过临床评分评估生活质量和预期寿命。

如实施例中所示，与未治疗的受试者相比，所要求保护的治疗方法允许改善临床状态和上文公开的各种参数。

根据一个实施方案，本发明涉及治疗营养不良性疾病的方法，包括向受试者施用如上公开的基因治疗产品，其中：

-至少30％的肌纤维，有利地40％，更有利地至少50％的肌纤维表达肌营养不良蛋白；和/或

-临床得分维持在对应于健康受试者的得分的至少50％，有利地至少60％或甚至70％的水平。

有利地，所述效果在给药后长达1个月，或3个月或6个月或9个月，更有利地在给药后长达1年，2年，5年，10年，或甚至受试者整个生命中更长。

如本领域已知的，肌肉中肌营养不良蛋白表达的水平易于由本领域技术人员确定，有利地通过免疫组织化学法，例如通过使用如上公开的抗肌营养不良蛋白抗体作肌肉活检免疫染色。临床评分的计算对于本领域技术人员来说也是常规的。如上面关于狗所详述的，可以基于吞咽困难，呼吸，涎分泌过多(ptyalism)和全身活动来计算该得分。关于患者，Bushby和Connor已经例如列出了，杜氏肌营养不良中的试验的临床结果测量(Clin Investig(Lond).2011；1(9)：1217–1235)。

除非另有说明，本发明的实践采用分子生物学(包括重组技术)，微生物学，细胞生物学，生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域技术人员的能力范围内。这样的技术在文献中充分解释，例如“分子克隆：实验室手册”，第四版(Sambrook，2012)；“寡核苷酸合成”(Gait，1984)；“动物细胞培养”(Freshney，2010)；“酶学方法”“实验免疫学手册”(Weir，1997)；“哺乳动物细胞基因转移载体”(Miller和Calos，1987)；“分子生物学简单方法”(Ausubel，2002)；“聚合酶链式反应：原理，应用和疑难解答”，(Babar，2011)；“最新免疫学方法”(Coligan，2002)。这些技术适用于生产本发明的多核苷酸和多肽，并且因此在制备和实施本发明时可以考虑。在下面的部分中将讨论用于特定实施方案的特别有用的技术。

本文引用的每个专利，专利申请和出版物的公开内容通过引用整体并入本文。

无需进一步描述，相信本领域普通技术人员能够使用前述说明和以下说明性实施例，制备和利用本发明的化合物并实施要求保护的方法。

实验实施例

通过参考以下实验实施例和附图进一步详细描述本发明。提供这些实施例仅仅是为了说明的目的，而不是限制性的。

下面给出的结果是在GRMD(金毛犬肌营养不良)狗模型中获得的。它是营养不良病理学的最佳动物模型，以便在临床试验之前评估基因治疗产品在效果(治疗剂量，稳定性，毒性，...)以及免疫应答方面的潜力。

图1：全长肌营养不良蛋白(A)，各种微肌不良营养蛋白(B)和表达构建物(C)的示意图。

图2：研究计划-GRMD犬全身治疗的一般方案。

图3：A/通过静脉内全身递送施用rAAV2/8-SPc5.12-cMD载体至GRMD2犬(ICI)3个月后获得的肌肉活检。

a/m.股二头肌注射前

b/健康狗

c/m.桡侧腕伸肌右：

82％的cMD+纤维(在82％的纤维中检测到cMD)

2.8vg/dg(每个二倍体基因组的载体基因组)

d/m.指总伸肌右：

59％的cMD+纤维(在59％的纤维中检测到cMD)

4.1vg/dg

e/m.桡侧腕伸肌左：

62％的cMD+纤维(在62％的纤维中检测到cMD)

6.2vg/dg

f/m.指总伸肌左：

66％的cMD+纤维(在66％的纤维中检测到cMD)

2.6vg/dg

B/通过静脉内全身递送施用rAAV2/8-SPc5.12-cMD载体至GRMD2犬(ICI)8个月后获得的肌肉活检：

a/m.股二头肌右：

58％的cMD+纤维(在58％的纤维中检测到cMD)

1.0vg/dg

b/m.股二头肌左：

56％的cMD+纤维(56％的纤维中检测到cMD)

0.8vg/dg

图4：在2月龄时全身接受10¹⁴vg/kg rAAV2/8-SPc5.12-cMD载体的GRMD组中获得的临床评分数据。

*表示狗不再活着

图5：全身步态指数的数据。使用通过判别分析构建的模型计算曲线，并且表示对于未处理的GRMD和健康的狗获得的数据。对于后者，示出了平均质心曲线和95％置信区间。

图6：在经治疗和未经治疗的GRMD犬上监测的运动膜片范围(ROM)。健康犬显示的ROM值在90和110％之间。

图7：使用犬μDys肽池的IFNγELISpot(PBMC的动力学)。数据在GRMD狗2(ICI)中获得，其在2个月龄时全身接受了10¹⁴vg/kg的rAAV2/8-SPc5.12-cMD载体。

图8：在注射的狗血清中通过Western印迹检测抗肌营养不良蛋白IgG抗体。数据在GRMD狗2(ICI)中获得，其在2月龄时全身接受了10¹⁴vg/kg的rAAV2/8-SPc5.12-cMD载体。在用pCMV-犬-MD(cμDys)转染(或不转染)的293细胞的细胞提取物上测试每种血清的反应性。已经测试了注射前(第0天)和注射后(第3周，第1.5个月，第2.5个月，第4个月和第7.5个月)的血清。阳性对照包括抗肌营养不良蛋白抗体MANEX 1011C和来自抗肌营养不良蛋白免疫的GRMD狗的阳性犬血清(C+)。

材料和方法：

1/动物

在GRMD狗模型(Kornegay等,Mamm Genome,2012)中进行了完全全身注射微营养不良蛋白载体(rAAV2/8-SPc5.12-cMD)的评价。对选定的雄性狗进行DMD突变的基因分型，其由引起不准确的mRNA加工的肌营养不良蛋白基因的内含子6的3'共有剪接位点(A>G)中的单碱基变化组成。

如下表1所示处理狗(无免疫抑制)：

对照狗对应于非注射的GRMD犬和健康狗。

2/微肌营养不良蛋白载体

rAAV2/8-SPc5.12-cMD载体编码在肌肉特异性启动子(SPc5.12)控制下的mRNA序列优化的犬肌营养不良蛋白(cMD)。

犬特异性mRNA序列优化的cMD cDNA的构建，引入了肌营养不良蛋白的CT结构域的外显子71-78和杆状结构域4-23(ΔR4-R23；图1)的缺失，其含有肌营养不良蛋白外显子79的最后三个氨基酸，随后是三个终止密码子并掺入SV40聚腺苷酸化位点。cDNA序列被修饰以包括共有Kozak序列。基于人类中的转移RNA频率优化mRNA序列并增加GC含量以提高RNA稳定性。微肌营养不良蛋白(GENEART,雷根斯堡,德国)的mRNA序列优化导致在犬抗肌营养不良蛋白中GC含量从48％增加至61％，以及23.6％的密码子的被修饰。cMD基因cDNA的大小为3603bp，并且该载体的含侧翼反向末端重复(ITR)的转基因盒的大小为4643bp，其对应于野生型AAV2基因组长度的4682bp的99.2％。去除肌营养不良蛋白基因的5'-和3'-非翻译区以减少肌营养不良蛋白盒的侧翼ITR大小。表达处于肌肉特异性合成启动子(SPc5-12)的控制之下(Wang,B.,等,Gene Ther,2008.15(22)：第1489-99页)。

这个表达盒(SEQ ID NO：2，包括AAV_ITR，Spc512启动子，犬MD cDNA和SV40PolyA)被证明在基于Duchenne beagle的CXMDJ模型中肌内注射后导致广泛和稳定的肌营养不良蛋白表达(Koo,T.,等,J Gene Med,2011.13(9):p.497-506)。此外，这种构建物改善肌肉病理并且减少目标肌肉组织中的炎症反应。

3/rAAV2/8-SPc5.12-cMD的制备

在杆状病毒/Sf9系统中产生含有由SPc5-12启动子调节的犬微营养不良蛋白cDNA的重组腺相关病毒载体rAAV2/8-SPc5.12-cMD。产生两个杆状病毒批次，一个表达rep(编码AAV2Rep蛋白)和cap(编码AAV8Cap蛋白)AAV基因，第二个是AAV2转移载体。产生病毒，库存并用于在200升一次性生物反应器(Sartorius)中共感染SF9细胞。在三天培养后，收集细胞，裂解，通过澄清处理裂解液，在免疫亲和柱上纯化，通过切向流过滤浓缩，配制，无菌过滤和填充。纯化基于携带结合AAV1，AAV2，AAV3，AAV5，AAV6和AAV8的单链抗体的商业凝胶(购自GE Healthcare的AVB)。该过程的总产率>20％，并产生145单位的4.5ml产物，病毒滴度>10¹³vg/ml。

4/全身给药

已经通过全身递送用治疗性候选物(rAAV2/8-SPc5.12-cMD)载体注射GRMD狗。该试验组以10¹⁴vg/kg(总计约5×10¹⁴vg/动物)给药。通过外周静脉，在插管头静脉中以3mL/min的流速进行简单的全身注射。总注射体积约为25mL的载体制剂(5ml/kg)，代表6％的总血液体积(10％是推荐的上限)，其结果是非常好的耐受性。

实验动物在2个月龄时注射，并如表1所示跟进。它们都对在血清中缺少AAV8中和因子进行了预筛选。在静脉内(IV)注射载体之前，从实验中丢弃显示出深度虚弱和/或吞咽损伤的GRMD狗。从未使用免疫抑制方案，并且提供的唯一医疗护理被限制为保持动物的舒适和健康。在适当时间获得适当的管理文件(伦理和转基因生物处理)。所有程序均按照“实验动物的护理和使用指南”进行，并由特设动物使用和护理委员会批准。

5/全身治疗的评价

发病率和死亡率每天评估两次。发现死亡的动物将在病理学家在场时进行尸体剖检，并在适当时收集组织样品以尝试系统地确定死亡原因。

该方案的临床和生物学耐受性

在所有狗中，在注射后定期监测临床实验室参数，包括电解质，肾和肝功能测试和全血细胞计数。在整个方案期间，还仔细和每周评估每个狗的临床状态，包括心脏，呼吸，消化，运动和神经功能。

通过Q-PCR评估载体脱落和载体生物分布

通过Q-PCR定期对尿，血清，中间肌肉活检，来自四肢的主要骨骼肌其中屈肌和伸肌，心脏和隔膜，肝脏，脾脏，肾脏，淋巴结和睾丸进行载体脱落和载体生物分布(检测)，直到安乐死。使用Qiamp病毒RNA微型试剂盒(Qiagen)从流体中提取rAAV DNA。从140μL血清中提取rAAV。1/8的提取物(10μL)用于Q-PCR分析。使用Gentra Puregene试剂盒(Qiagen)和Tissue Lyzer II(Qiagen)从组织中提取基因组DNA(gDNA)。使用纳米分光光度计(Implen)测定每种gDNA样品的浓度。

在StepOne Plus(Applied Biosystem)上使用50ng一式两份的gDNA或10μL流体提取物进行定量PCR。使用设计用于特异性扩增SPc5.12-cMD盒的引物和探针确定载体拷贝数。使用设计用于扩增犬葡萄糖醛酸酶基因的引物和探针来确定gDNA拷贝数。对于每个样品，将Ct(循环阈值)值与用不同稀释度的线性化标准质粒(含有SPc5.12-cMD盒或犬葡萄糖醛酸酶基因)获得的值进行比较。结果以每个二倍体基因组的载体基因组(vg/dg)表达。对于流体，仅进行转基因特异性Q-PCR，并且结果以每μl提取流体的载体基因组表达。通过分析掺入不同稀释度的标准质粒的从脾脏，睾丸，肝脏，肾脏或骨骼肌提取的10μL流体提取物或50nggDNA，来预先检查在gDNA存在下，Q-PCR抑制是否不存在。

通过Q-RT-PCR评估不同组织中的转基因表达

在多种骨骼肌，心脏和隔膜，肝脏，脾脏和任何其他表现出高载体拷贝数的组织中通过Q-RT-PCR评估微肌营养不良蛋白表达。简言之，根据制造商的说明书，用TRIzol试剂(英杰公司)从肌肉，肝脏和脾脏中提取总RNA，并用来自TURBO DNA free试剂盒(Ambion)的无RNA酶的DNAseI处理。使用随机引物和M-MLV逆转录酶(英杰公司)进行逆转录。为每个样品加工无逆转录酶(RT-)的阴性对照。在StepOne Plus(Applied Biosystem)上对稀释的一式两份cDNA进行定量PCR。使用设计用于特异性扩增该序列的引物来确定cMD信使的相对定量。通过已知在狗的不同组织中相似表达的犬RPL32(核糖体蛋白L32)信使的Q-PCR分析将结果标准化(Peters,I.R.,等,.Vet Immunol Immunopathol,2007.117(1-2)：第55-66页)。通过分析掺有不同稀释度的标准质粒的稀释的cDNA来检查在肌肉、肝脏和脾的cDNA的存在下，是否不存在Q-PCR抑制。

对于每个样品，将Ct(循环阈值)值与用不同稀释度的标准质粒(含有cMD表达盒或犬RPL32信使的序列)获得的值进行比较。结果以相对量(RQ)表示：

RQ＝2^-ΔCt＝2^{-(Ct靶标-Ct外源对照)}

通过蛋白质印迹分析肌营养不良蛋白表达

使用特异性Western印迹分析，评估注射的狗的不同肌肉中的微肌营养不良蛋白的表达：

-在一些骨骼肌，以及心脏和隔膜，在安乐死时采样，

-在将发现高水平的转基因拷贝数的肝脏，脾脏和任何其他组织中，在安乐死时。

从组织样品中提取总蛋白。在SDS-PAGE上分离蛋白质提取物，转移到硝酸纤维素膜上。在Red Ponceau染色后，将膜在TBS中的5％脱脂乳中封闭，并与抗肌营养不良蛋白MANEX1011C抗体和第二抗-小鼠IgGHRP偶联的抗体杂交。

免疫组化分析肌营养不良蛋白表达

通过免疫化学方法，在注射的狗的骨骼肌中评价微肌营养不良蛋白的表达：

-在中间肌肉活检，

-在所有骨骼肌，以及心脏和隔膜，在安乐死时采样，

-在肝脏，脾脏，睾丸，肾脏和淋巴结，安乐死时采样。

通过免疫组织化学方法评估微肌营养不良蛋白的表达和定位。使用来自Novocastra的小鼠肌营养不良蛋白抗体(NCL-DYS-B)在每个肌肉的横切片上进行微肌营养不良蛋白多肽免疫染色。肌营养不良蛋白相关蛋白的恢复是通过β肌营养不良蛋白聚糖，β-肌蛋白聚糖，γ-肌蛋白聚糖和Utrophin的免疫染色来评估的，包括在肌浆膜上与层粘连蛋白共定位。

评估肌肉中的局部病理模式

病理学评估是讨论基因治疗产品在靶组织水平的实际益处的关键。使用形态测量分析，EC委员会认证的病理学家评估注射的狗的骨骼肌中的病理模式。这些分析在具有大多数I型纤维(近肢肌肉，椎旁肌肉)的姿势肌肉；具有大多数II型纤维(来自远端肢体肌肉的屈肌和伸肌)的运动肌；呼吸肌，隔膜，肋间和咀嚼肌上进行。也对心脏进行了广泛评估，由于不平行的取向，捕获纤维直径有特定困难。

内膜纤维化在胶原I的免疫组织化学揭示(免疫过氧化酶测定)和标记区域的百分比的自动测量之后评价。

总纤维化在胶原I的免疫组织化学揭示(免疫过氧化酶测定)之后，在与内膜纤维化的同一载玻片上评价。还进行总标记区域的百分比的自动测量。

横纹肌纤维化通过在肌肉组织的相同区域中的总纤维化和肌内膜纤维化之间的差计算。

Anocytosis(纤维直径的变化)通过手工形态测定法评价：每分析的肌肉横截面测定至少200个肌纤维和6个区域的最小纤维直径。

坏死通过茜素红(Alizarin Red)染色测量钙富集来评价。标记区域的百分比在手动阈值后测量。

再生在用发育性肌球蛋白重链同种型的特异性抗体作免疫组织化学揭示肌管(免疫过氧化物测定)之后评价。标记区域的百分比在手动阈值后测量。

炎症在同一载玻片上免疫组织化学揭示T和B淋巴细胞和巨噬细胞后评价(免疫过氧化酶测定)。标记区域的百分比在手动阈值后确定。

评估不同组织中的病理模式

使用HE染色和解剖病理学专门技术在安乐死的狗的不同组织中评估脱离靶组织(肝脏，脾脏，肾脏，...)所致的潜在不良副作用。

骨骼肌的NMR成像和光谱指数

非侵入性肌肉成像和光谱指数在安乐死前一周进行。狗被送到巴黎的肌肉学研究所(Institute of Myology，Pierre Carlier的团队)，并接受3T西门子Trio扫描仪核磁共振(NMR)以定量和连续描述与未治疗和健康动物相比的营养不良肌肉异常。除此之外，在Bruker biospec扫描仪中在4T下实现/获取伸肌桡侧腕(extensor carpi radialis)的P31光谱。相对于未治疗和健康犬的组中疾病进展的在先NMR研究期间的参考数据定位每个单独的测量Thibaud,J.L.,等,Neuromuscul Disord,2012.22 Suppl 2:p.S85-99；Wary,C.,等,NMR Biomed,2012.25(10):p.1160-9.胸椎和骨盆/前肢在3T扫描仪中成像。如Thibaud,J.L.,等(Neuromuscul Disord,2007.17(7):p.575-84)所述，获取标准和脂肪饱和的T1-，T2-和质子-密度-加权图像。还进行T1的测量和在钆-螯合物注射后肌肉增强的两小时动力学研究。已经鉴定了在健康和未治疗的GRMD犬之间不同的十个指数，其能够解释基因治疗治疗对大肌肉区域的效果。

功能评估：临床分级

临床检查也每天进行两次，包括食物和水的消耗，活动(全身性动作，对外部刺激的反应)和身体外观(面部，毛皮，四肢)。在每次麻醉期间对所有动物进行包括体重在内的全面检查。

使用先前公开的方案(Rouger,K.,等,Am J Pathol,2011.179(5):第2501-18页)，通过在注射后每周进行的临床分级来评价动物关于肌肉疾病的一般临床状态。该评价包括11项运动标准和6项与一般健康状况(包括吞咽困难，涎分泌过多，全身活动和呼吸)有关的项目。每个项目得分从0到2，0对应于无症状，2对应于最大严重程度。全局临床评分表示为最大临床评分(对于健康狗定义为100％)的百分比，并建立趋势曲线(移动平均值为3)以表示临床评分演变。将注射的狗中获得的临床评分演变与非注射的GRMD狗的临床评分演变进行比较。

功能评估：步态分析(肌肉功能)

由Locometrix量化的步态分析每月进行两次。是由3个正交放置的加速度计组成的3D加速度计设备。这种结构允许沿着狗的背腹，头尾和中间-横轴记录加速度。可以使用该设备分析速度，步频，步长，规律性，总功率，背腹功率，头尾功率，中间-横轴功率和力，并且在GRMD狗中该疾病进展期间，这些指数中的一些被修改(Barthelemy,I.,等,BMC Musculoskelet Disord,2011.12:第75页)。

功能评价：心功能评价

每月使用超声心动图和多普勒分析来评估治疗的狗的心脏功能，这是一种允许检测收缩性缺陷的敏感方法。

数据采集：

根据美国兽医内科学院的推荐(Thomas,W.P.,等,JVet Intern Med,1993.7(4):第247-52页)，使用配备有5-7.5和2-5MHz相控阵换能器的Vivid 7超声单元(GE，沃基肖，威斯康辛州)，在持续ECG的监视下，对有意识的狗以站立位置进行常规超声心动图和2D彩色组织多普勒成像(TDI)。转移所有数据，由两名不知道狗的临床状态的检查者使用特定软件(Echo Pac 5.4，GE)进行离线分析。如下所述测量一些参数用于评估心肌收缩性。

常规参数：测量左心室(LV)尺寸，后壁和室间隔壁的厚度。

计算左心室缩短和射血分数(Teichholz方法)。二尖瓣流入的脉冲多普勒用于测量早期相对于晚期舒张流速(E/A)的比率。

组织多普勒成像：从在后壁中的乳头肌水平的短轴视图和在隔壁和侧壁基底部分水平的尖4腔视图获得径向心肌速度和应变率的测量值。

斑点跟踪成像：在短轴视图中，测量5个预定段中的每一个中的节段应变。平均周向和径向通过手动计算所获得的测量的平均值来确定。在4个腔室视图中，总体纵向应变用程序自动测量，该程序对从6个自动检测的段的分析导出的测量值进行积分。预注射数据和模拟注射的GRMD用作参考。

功能评价：呼吸功能评价

呼吸功能每月评价，并通过使用对有意识的狗进行胸部放射镜采集来完成。在提取呼气末和吸气末后图像之后，计算2个指数：

-膜片的尾部回缩指数(RI)反映膜片的回缩；

-隔膜运动范围(ROM)反映了隔膜的移动性：它是在(i)在吸气末和呼气末获得的2个图像的叠加之后获得的，(ii)测量每个图像上尾部腔静脉孔的中心点位置之间的距离，(iii)将该距离通过第13胸椎(T13)的长度归一化。

这2个指数与膈肌的收缩和移动性相关，其在GRMD狗的疾病进展期间被修改(Barthelemy,I.,等,Myology congress,2011)。在GRMD狗中获得的结果相对于在未注射的未处理动物中获得的结果进行定位。

呼吸功能的临床随访：

呼吸功能也通过观察呼吸运动/周期来评估，其修改揭示一些呼吸异常，那可能是隔膜和其他呼吸肌无力的结果。

通过由专业兽医每两个月进行的临床检查来评价关于呼吸异常的显现和恶化的动物状态。特别地，评价呼吸运动/周期的数量和规律性。

功能评价：消化功能评价

消化功能的临床随访：

如在DMD患者中所见，吞咽困难(即吞咽困难)是GRMD狗中疾病进展的典型症状，作为明显的口腔和咽部肌肉虚弱的结果(van den Engel-Hoek,J Neurol,2013,260(5):1295-303)。

通过由专业兽医每两个月进行的临床检查来评价关于吞咽困难的显现和恶化的动物状态。特别地，评价舌头大小，口腔内异常量的唾液的存在和动物吃固体或软食物的能力。

免疫反应的随访

在整个研究期间，收集来自参与研究的狗的血液样品(血浆，血清和外周血单核细胞-PBMC)以监测：

-针对rAAV8的体液免疫应答

-针对微肌营养不良蛋白的体液免疫应答

-针对rAAV8的细胞免疫应答

-针对微肌营养不良蛋白的细胞免疫应答

-注射后早期的炎症性免疫应答

血液样品根据法国L2生物安全性要求处理，并进行血液学和临床生物化学处理。定期获得专用血清样品用于以下免疫学评估：(i)抗AAV抗体和抗肌营养不良蛋白抗体；(ii)通过Luminex测量炎症细胞因子；(iii)补体激活。还在治疗之前和之后收集全血以分离外周血单核细胞(PBMC)，随后监测针对AAV和/或肌营养不良蛋白多肽的潜在细胞免疫应答。

对rAAV8载体的体液免疫应答：

在载体注射后的不同时间点评价狗血清：(i)通过定制ELISA检测IgG的和对rAAV8特异性的IgM存在；(ii)通过定制中和测定揭示的rAAV8中和能力。

对肌营养不良蛋白的体液免疫应答：

通过Western-Blot分析常规地进行IgG抗肌营养不良蛋白抗体的检测。简言之，将含有犬肌营养不良蛋白的细胞提取物进行SDS-PAGE，然后转移到Hybond ECL硝酸纤维素膜上。过夜饱和后，将膜与来自注射动物的实验犬血清一起温育。随后，通过与过氧化物酶偶联的兔抗狗IgG抗体杂交，随后通过增强的化学发光检测进行检测。阳性对照包括抗肌营养不良蛋白MANEX 1011C抗体(Wolfson遗传性神经肌肉疾病中心(Wolfson Center for Inherited Neuromuscular Diseases))。

对AAV8和肌营养不良蛋白多肽的细胞免疫应答评估如下：简言之，用编码AAV8的VP蛋白或犬肌营养不良蛋白多肽的慢病毒载体(LV)进行IFN-γELISPOT测定。LV载体用于转导PBMC。使用覆盖犬肌营养不良蛋白多肽的犬序列的重叠肽文库的补充方法也用于刺激淋巴细胞。

炎症免疫应答(细胞因子)通过Luminex技术在载体施用前和施用后不同时间点观察IL2，IL4，IL6，IL8，IL10，IL15，IFN和TNF进行定量。

结果：

如图2所示，通过外周静脉的简单全身注射，2个月大的GRMD犬已被注射1×10¹⁴vg/kg的上述rAAV2/8-SPc5.12-cMD载体。载体施用后瞬间以及长达数月从未检测到临床，生物化学和血液学不良反应。

肌肉活检：

在全身注射后3和8个月，获取GRMD狗的来自一些不同肌肉的中间活检。

根据上述方法，研究了在载体的全身递送后3个月，表达肌营养不良蛋白多肽的肌纤维的百分比。GRMD狗2的结果如图3A所示。

连同表达治疗性转基因的纤维的百分比，每个二倍体细胞的载体基因组数(vg/dg)在遵循上文所述的方法学之后说明。对于平均2-4vg/dg，在活组织检查中，表达肌营养不良蛋白的纤维的平均百分比从59％到82％(图3A c/到f/)，这被解释为非常令人鼓舞。可以注意到主要细胞浸润的缺乏和相当显着保存的组织结构。

在载体的全身递送后8个月，对于1vg/dg，在活组织检查中表达肌营养不良蛋白的纤维的百分比为约50％(图3B)。

所有可用的数据汇编在下表2中：

N/A：不适用，因为活检的质量低

此外，在注射后7，5个月的GRMD狗3的组织中发现的载体基因组拷贝的进一步定量显示在下表中：

表3：在处死时(注射后7,5个月)在GRMD3的肌肉中发现的载体基因组拷贝。

以非常有趣的方式，观察到即使在这个晚期时间点，在身体的所有骨骼肌中检测到大量的转基因颗粒(甚至在注射部位的远端，即右头静脉)，还有在心脏和隔膜中。这有利于转基因在整个生物体内的优良的生物分布。

临床评价：

如上所述对5只经治疗的GRMD狗的临床评价的初步数据针对8只其他未经治疗的年龄匹配的GRMD狗进行。图4显示了在载体注射后的不同时间点，基本上根据吞咽困难、呼吸、多涎、全身活性的临床评分的改善。100％评分对应于健康个体。即使临床结果同一组内的治疗个体之间可能不同(在未治疗的GRMD之间通常是这种情况)，这些结果表明治疗的GRMD动物表现出迄今相当稳定的表型，优于大多数未治疗的动物。在治疗的狗中评价的临床评分保持在对应于在健康狗中获得的最大评分(100％)的至少50％的水平，一些动物高于70％，而大多数未经治疗的动物的临床评分迅速下降至40％以下甚至更少(图4)。

值得注意的是，临床随访表明，即使在一岁大，治疗的GRMD狗能够跑，跳跃障碍，以他们的后肢站立。这对于未经治疗的GRMD犬而言从未观察到，其预期寿命很少超过一年。

图4所示的数据还支持治疗的狗的心脏和呼吸功能的改善，以及与未治疗的狗相比延长的生存期，连同改善的生活质量。

步态表征：

如上所述，使用装置每两个月进行步态评估。在3轴上记录加速度：背腹(DV)，内外侧(ML)和头尾(CC)。通过7个步态变量(步频，规律性，总功率，头尾功率，背腹功率，中间-侧向功率和步长)的统计判别因子分析的步态特征示于图5。

在注射的狗中获得的结果相对于以前在25只未治疗的GRMD和9只正常狗的组中疾病进展的3D加速度计研究期间收集的参考数据定位(Barthelemy,I.,等,BMC Musculoskelet Disord,2011.12:第75页)。

数据显示，μdys治疗的GRMD狗产生了与年龄匹配的未治疗的GRMD犬中观察到的非常不同并且大大改善的整体步态指数。注射后仅3到4个月后，它们迅速改善他们的步态表现，显示与健康狗十分接近的步态。从这些数据，看起来μdys治疗的GRMD狗呈现出接近同一品种的健康狗的步态。

心脏和呼吸功能：

图4所示的临床评分支持心脏和呼吸功能的改善。

更具体地，图6支持改善的呼吸功能，尽管狗之间存在显著的变化，但是在治疗的GRMD犬中显示出ROM指数更好的值，与隔膜的改善的活动性相关。

这些数据也证实了下表4中报道的狗的临床随访：

GRMD犬的呼吸异常的特征在于呼吸运动/周期的改变。与DMD患者一样，这些异常是膈肌和其他呼吸肌无力的结果。表4显示了在治疗的GRMD(μDys)狗中呼吸异常显现的延迟或甚至抑制。

消化功能：

吞咽困难(吞咽困难)是GRMD犬的疾病进展的典型症状。与DMD患者一样，吞咽困难是明显的口腔和咽部肌肉虚弱的结果。

已经研究了治疗对消化功能的可能好处，并且结果报告在下表5中：

这种临床随访揭示了在治疗的GRMD(μDys)狗中吞咽困难出现的延迟，具有症状严重程度较轻。

免疫反应/毒性：

注射后3和8个月(图3)的蛋白质检测以及图4所示的良好临床评分表明对重组AAV载体和微肌营养不良蛋白不存在不良和有害的免疫应答。

肌肉活检(图3)以及图4所示的良好临床评分支持所述基因治疗产品的无毒性。

在生物安全性方面，通过干扰素γElispot使用在PBMC的动力学上孵育的cMDYF肽库来评价针对cMD的细胞免疫应答(图7)。无论注射剂量如何，注射的动物无一表现出可检测的干扰素γ分泌，表明不存在针对cMDYF的细胞免疫应答。

还通过免疫western印迹评价了针对cMD的体液免疫应答(图8)。所有可用的结果汇编在下表6中：

这里，在注射10¹⁴vg/kg AAV-cMD载体的5只狗中的2只中检测到抗μ肌营养不良蛋白抗体的存在。重要的是，针对cMD的这种体液免疫应答只是短暂的(最大检测范围＝在注射后2周和4个月之间)，并且似乎不与任何临床有害作用相关，表明在这些动物中可能发生免疫耐受。

生存期：

图4清楚地显示生存期延长：

-在8-9个月时，8只未治疗的GRMD狗中仅有2只仍然存活。相反，所有经治疗的GRMD狗仍然存活且健康；

-以一般方式，未治疗的GRMD犬的预期寿命为约12个月，在该年龄时具有非常差的临床状态。相反，经过长期随访测试的2只治疗的GRMD狗(μDys1和2)在该截止时间后保持存活(分别为19和17个月的年龄)，并且处于良好的临床状态。

治疗剂量：

该研究显示，就在狗中的效果和毒性而言，全身给药的相对低剂量10¹⁴vg/kg是合适的剂量。

结论：

总之，这些功能数据与中间肌肉活检中的肌营养不良蛋白多肽的实质性表达(>50％表达微肌营养不良蛋白的纤维)良好相关。它们显示MD微肌营养不良蛋白构建物的治疗效果，并且支持全身递送可能有益于停止/减少疾病的进展。从这个GRMD的系统性试验组获得的结果表明，从分子，病理学和功能方面测量的一些结果支持人类中系统性基因治疗。

该研究证明了这样的概念：全身静脉注射单剂量后，编码序列优化的微肌营养不良蛋白并衣壳化在AAV8衣壳中的SPc5.12-cMD治疗盒，为杜氏肌病(Duchenne myopathy)的狗模型提供临床益处。不仅微肌营养不良蛋白多肽在多种肌肉中高度表达，而且还导致步态改善和改善的临床结果测量，延长的生存期，无不良免疫反应。以本发明人的知识，这是令人鼓舞和令人意想不到的结果的第一次报道，特别是在全身用药的情况下。

序列表

<110> 吉尼松公司

皇家霍洛威和贝德福德新学院

<120> 营养不良性疾病的高效全身治疗

<130> G143-B-43539 PCT

<150> EP14174848.3

<151> 2014-06-27

<150> PCT/EP2015/058964

<151> 2015-04-24

<160> 8

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 4640

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAV_ITR_Spc512-人 MD1

<400> 1

gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg 60

tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaact ccatcactag 120

gggttccttg tagttaatga ttaacccgcc atgctactta tctacgtagc catgctctag 180

acatggctcg acagatcgag ctccaccgcg gtggcggccg tccgccctcg gcaccatcct 240

cacgacaccc aaatatggcg acgggtgagg aatggtgggg agttattttt agagcggtga 300

ggaaggtggg caggcagcag gtgttggcgc tctaaaaata actcccggga gttattttta 360

gagcggagga atggtggaca cccaaatatg gcgacggttc ctcacccgtc gccatatttg 420

ggtgtccgcc ctcggccggg gccgcattcc tgggggccgg gcggtgctcc cgcccgcctc 480

gataaaaggc tccggggccg gcggcggccc acgagctacc cggaggagcg ggaggcgcca 540

agctctagaa ctagtggatc ccccgggctg caggaattcg ccaccatgct gtggtgggag 600

gaagtggagg actgctacga gagagaggac gtgcagaaga aaaccttcac caagtgggtg 660

aacgcccagt tcagcaagtt cggcaagcag cacatcgaga acctgttcag cgacctgcag 720

gatggcagga gactgctgga tctgctggag ggactgaccg gccagaagct gcccaaggag 780

aagggcagca ccagagtgca cgccctgaac aacgtgaaca aggccctgag agtgctgcag 840

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aacatcatgg ccggcctgca gcagaccaac agcgagaaga tcctgctgag ctgggtgagg 1020

cagagcacca gaaactaccc ccaggtgaac gtgatcaact tcaccacctc ctggagcgac 1080

ggcctggccc tgaacgccct gatccacagc cacagacccg acctgttcga ctggaacagc 1140

gtggtgtgtc agcagagcgc cacccagaga ctggagcacg ccttcaacat cgccagatac 1200

cagctgggca tcgagaagct gctggacccc gaggacgtgg acaccaccta ccccgacaag 1260

aaaagcatcc tgatgtatat tacctctctg tttcaggtgc tgccccagca ggtgtccatc 1320

gaggccatcc aggaagtgga aatgctgccc aggcccccca aagtgaccaa ggaggagcac 1380

ttccagctgc accaccagat gcactatagc cagcagatca ccgtgtccct ggcccagggc 1440

tatgagagaa ccagcagccc caagcccaga ttcaagagct acgcctacac ccaggccgcc 1500

tacgtgacca cctccgaccc caccagaagc cccttcccca gccagcacct ggaggccccc 1560

gaggacaaga gcttcggcag cagcctgatg gagagcgaag tgaacctgga cagataccag 1620

accgccctgg aggaagtgct gtcttggctg ctgtccgccg aggacaccct gcaggcccag 1680

ggcgagatca gcaacgacgt ggaagtggtg aaggaccagt tccacaccca cgagggctac 1740

atgatggatc tgaccgccca ccagggcaga gtgggcaata tcctgcagct gggcagcaag 1800

ctgatcggca ccggcaagct gagcgaggac gaggagaccg aagtgcagga gcagatgaac 1860

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caccgcgtgc tgatggacct gcagaaccag aagctgaagg agctgaacga ctggctgacc 1980

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ctgaagagac aggtgcagca gcacaaagtg ctgcaggagg acctggaaca ggagcaggtg 2100

cgcgtgaaca gcctgaccca catggtggtc gtggtggacg agagcagcgg cgaccacgcc 2160

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cacaccaccg gcttcaagga ccagaacgag atgctgagca gcctgcagaa gctggccgtg 2400

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agccaggccg tgaccaccac ccagcccagc ctgacacaga ccaccgtgat ggagaccgtg 2640

accacagtga ccaccaggga gcagatcctg gtgaagcacg cccaggagga gctgccccct 2700

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caggaagcca ccgacgagct ggacctgaag ctgagacagg ccgaagtgat caagggcagc 2820

tggcagcctg tgggcgatct gctgatcgac agcctgcagg accacctgga gaaagtgaag 2880

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agacagctga ccaccctggg catccagctg agcccctaca atctgagcac cctggaagat 3000

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gaggcccaca gagacttcgg ccctgcctcc cagcacttcc tgagcaccag cgtgcagggc 3120

ccctgggaga gagccatctc ccccaacaaa gtgccctact acatcaacca cgagacccag 3180

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gatagcatcc agatccctag gcagctgggc gaagtggcca gctttggcgg cagcaacatc 3720

gagccctctg tgaggagctg cttccagttc gccaacaaca agcccgagat cgaggccgcc 3780

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tgctttttca gcggcagagt ggccaagggc cacaagatgc actaccccat ggtggagtac 4020

tgcaccccca ccacctccgg cgaggatgtg agagacttcg ccaaagtgct gaagaataag 4080

ttccggacca agcggtactt tgccaagcac cccaggatgg gctacctgcc cgtgcagacc 4140

gtgctggagg gcgacaacat ggagaccgac accatgtgat gatgagcggc cgcttccctt 4200

tagtgagggt taatgcttcg agcagacatg ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc 4260

acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta 4320

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<210> 2

<211> 4643

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAV_ITR_Spc512-犬 MD1

<400> 2