本发明涉及西北沼委陵菜抗HBV病毒有效部位及制法和应用，属于植物提取物技术领域。
背景技术：
西北沼委陵菜（Comarum salesovianum (Stepn.) Asch. et Gr.）为蔷薇科（Rosaceae）沼委陵菜属（Comarum palustre L.）多年生亚灌木植物[参见：中国科学院中国植物志编辑委员会.中国高等植物[M].北京:科学出版社,2003(6).]，是传统药用植物。其主要生于海拔2800-4250米的山坡林缘、林下及河谷湿草地。分布在我国西南、西北、华北至东北。北温带广布，北美洲、欧洲至日本、小亚细亚至喜马拉雅等地也有。蒙古科学院发现其具有明显抗炎活性；一项日本专利表明其具有葡萄球菌抑制效果，可以预防痤疮和过敏性皮肤炎。
乙型肝炎病毒(HBV)感染是一种严重影响公共卫生与人体健康的全球性流行性疾病,尽管乙肝防治已有很大提高,但仍缺乏高效的药物与手段。乙肝是影响我国国计民生的重大传染性疾病，迄今为止尚无特异有效的治疗手段。针对该病毒特点，通过系统的评价西北沼委陵菜的体外抗病毒活性和靶点，并从中寻找具有抗病毒活性的有效部位。建立成熟Hep2.2.15-乙肝病毒细胞培养体系，可用于快速的体外抗病毒活性筛选。此外，采用表面等离子共振SPR（BIAcore）技术探讨提取物与病毒蛋白的体外结合亲和力，并结合相关分子生物学实验初步确定作用靶点。该技术简便高效、应用成熟，课题组已通过表达纯化或其他途径获得十多种病毒相关的靶点蛋白。以上技术的应用将为作用机制明确的抗病毒药物开发提供可能。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供西北沼委陵菜抗HBV病毒有效部位及制法和应用，该西北沼委陵菜抗HBV病毒有效部位能具有明显HBV病毒表面抗原亲和作用，能用于制备抑制HBV病毒治疗药物。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：该西北沼委陵菜抗HBV病毒有效部位，其特征在于：选自西北沼委陵菜乙酸乙酯部位、西北沼委陵菜正丁醇部位中的一种或两种按任意质量比的混合物。
该西北沼委陵菜抗HBV病毒有效部位的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：将西北沼委陵菜粉碎，加入体积百分比浓度65%~95%乙醇溶液提取，将所得提取液浓缩、干燥，得浸膏；将浸膏加蒸馏水分散，得浸膏分散液，然后依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作为溶剂萃取浸膏分散液，取所得乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液，分别挥去溶剂，得到西北沼委陵菜乙酸乙酯部位、西北沼委陵菜正丁醇部位。
所述的提取为超声波辅助回流提取；超声波辅助回流提取的具体操作为：将粉碎后的西北沼委陵菜加入体积百分比浓度65%~95%乙醇溶液超声波提取0.5~3小时，过滤，滤渣加入体积百分比浓度65%~95%乙醇溶液回流提取2~3次，合并提取液，即得。
该西北沼委陵菜抗HBV病毒有效部位的应用，其特征在于：在制备抗HBV病毒药物方面的应用。
所述抗HBV 病毒药物是通过：将西北沼委陵菜乙酸乙酯部位、西北沼委陵菜正丁醇部位中的一种或两种按任意质量比的混合物，与药用辅料混合后，制成的口服制剂或注射制剂。
所述的注射制剂为脂质体注射剂、纳米粒注射剂或微球注射剂。
所述的口服制剂为散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂或溶液剂。
申请人对于本发明的说明如下：现有技术中，西北沼委陵菜常规用途为消炎抗菌，未见其有抗HBV病毒功效的相关报道。申请人通过大量研究发现：西北沼委陵菜还具有抗HBV病毒的作用，但是其功效不明显，也不能确定其具体的有效部位。因此通过怎样的溶剂、采用怎样制备方法，才能获得抗HBV病毒活性效果最好的有效部位，是必须要解决的问题。申请人通过研究，最终发现：采用本发明制备方法，所得的西北沼委陵菜乙酸乙酯萃取部位和西北沼委陵菜正丁醇萃取部位有较强的抗HBV病毒效果。
制备方法中，所用西北沼委陵菜选用全草粉碎。所得浸膏为粗提取物，采用不同的溶剂萃取浸膏分散液，指的是依次将石油醚加入浸膏分散液萃取分离获得石油醚萃取液、将乙酸乙酯加入浸膏分散液萃取分离获得乙酸乙酯萃取液、将正丁醇加入浸膏分散液萃取分离获得正丁醇萃取液；取西北沼委陵菜乙酸乙酯萃取液和西北沼委陵菜正丁醇萃取液分别挥发去除溶剂后，将会对应得到西北沼委陵菜乙酸乙酯部位和西北沼委陵菜正丁醇部位；乙酸乙酯部位和正丁醇部位对应易溶于乙酸乙酯和正丁醇。优选的，挥发去除溶剂采用减压浓缩，该方法效率高，并且能避免热敏性成分因高温丧失药性。具体的，西北沼委陵菜乙酸乙酯部位中含有黄酮类化合物，西北沼委陵菜正丁醇部位中含有黄酮苷和酚类。并且，申请人分别研究了西北沼委陵菜乙酸乙酯部位和西北沼委陵菜正丁醇部位对HBV病毒（即乙肝病毒）体表抗原（即HBsAg）的亲和能力，进一步发现其中西北沼委陵菜乙酸乙酯部位抗HBV病毒的效果最优。
优选的，抗HBV病毒药物的剂型为口服制剂或注射制剂，是由于申请人发现口服制剂和注射制剂为最佳给药途径。此处，所述口服制剂为经肠胃道给药制剂，优选的，口服制剂为缓释型或控释型口服制剂。另外，本发明中的抗HBV病毒药物也可以为非肠胃给药的其他口服剂，如呼吸道给药制剂（喷雾剂、气雾剂、粉雾剂）；皮肤给药制剂（外用溶液剂、洗剂、搽剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、贴剂）；膜给药制剂（滴眼剂、滴鼻剂、眼用软膏、含漱剂、舌下片剂）；腔道给药制剂（栓剂）。注射制剂可以为常规注射制剂。根据药物传递系统进行分类，优选的，本发明的注射制剂为脂质体注射剂、纳米粒注射剂或微球注射剂；其他的，本发明的注射剂还可以为微囊注射剂、聚合物胶束注射剂、微乳或亚微乳注射剂、亚微粒注射剂或凝胶注射剂，以上药物传递系统的注射剂能延长药物载体在体内的循环时间、延长载药微粒在吸收部位的停留时间、控制药物在释放初期的突释效应。药用辅料包括药物载体，以及溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、助悬剂、澄清剂、反絮凝剂、矫味剂、着色剂、防腐剂、化学灭菌剂、吸附剂、助滤剂、抗氧剂、pH调节剂、等渗调节剂、稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、抗粘着剂、缓释剂、控释剂、包衣材料、成膜材料、胶囊材料中的一种或多种。
与现有技术相比，本发明的西北沼委陵菜抗HBV病毒有效部位及制法和应用所具有的有益效果是：
1、该西北沼委陵菜抗HBV病毒有效部位能具有明显HBV病毒表面抗原亲和作用，能用于制备抑制HBV病毒治疗药物。申请人发现：现有技术中仅具有消炎抗菌功效的西北沼委陵菜，还具有抗乙肝病毒的功效。申请人经进一步研究发现西北沼委陵菜乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部分的具有抑制HBV病毒活性，并首次在HBV病毒上进行药效筛选，活性好，适宜开发成治疗乙肝的新药。进一步的，申请人通过鸭感染乙型肝炎模型实验（2年龄北京鸭感染DHBV）发现，西北沼委陵菜乙酸乙酯部位高剂量组（800mg/kg/d）、西北沼委陵菜正丁醇部位中剂量组（500mg/kg/d）和高剂量组（800mg/kg/d），具有较好的抗乙肝病毒效果。综上所述，申请人经研究首次发现西北沼委陵菜的新功效，并通过研究确定其所抑制的酶的种类，设计制备方法并最终获得西北沼委陵菜抗HBV病毒有效部位，以上过程是付出了大量的创造性劳动的。
2、该西北沼委陵菜抗HBV病毒有效部位的制备方法提取方便，提取效率高。申请人设计加入体积百分比浓度65~95%乙醇溶液进行回流提取，提取方法简便；萃取中，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作为溶剂萃取浸膏分散液，采用以上溶剂萃取顺序所得的西北沼委陵菜乙酸乙酯部位、西北沼委陵菜正丁醇部位具有较好的抑制HBV病毒的效果。
3、本发明拓展了抗HBV病毒药物的原料渠道，扩大了西北沼委陵菜的用途，使西北沼委陵菜发展成为抗HBV病毒药物的新原料，显著提高了西北沼委陵菜的附加值。
具体实施方式
实施例1~3是本发明的西北沼委陵菜抗HBV病毒有效部位及制法的具体实施方式，其中实施例1为最佳实施例。
实施例1
制备方法，包括下述步骤：将西北沼委陵菜全草粉碎，先加入体积百分比浓度85~95%乙醇溶液，超声波提取1~1.5小时，过滤得超声波提取液和滤渣，向滤渣中加入体积百分比浓度85%~95%乙醇溶液回流提取3次，每次0.5~1小时，过滤得回流提取液，合并超声波提取液和回流提取液，将所得总提取液浓缩、干燥，得浸膏；将浸膏加蒸馏水分散，得浸膏分散液，然后依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作为溶剂萃取浸膏分散液；取乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液分别挥去溶剂，得西北沼委陵菜乙酸乙酯部位和西北沼委陵菜正丁醇部位。
实施例2
制备方法，包括下述步骤：将西北沼委陵菜全草粉碎，先加入体积百分比浓度75~85%乙醇溶液，超声波提取1.5~2小时，然后过滤得超声波提取液和滤渣，向滤渣中加入体积百分比浓度75%~85%乙醇溶液回流提取2次，每次0.5~1小时，过滤得回流提取液，合并超声波提取液和回流提取液、浓缩、干燥，得西北沼委陵菜浸膏；将浸膏分散在蒸馏水中得浸膏分散液，然后依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作为溶剂萃取浸膏分散液。取乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液分别挥去溶剂，得到西北沼委陵菜乙酸乙酯部位和西北沼委陵菜正丁醇部位。
实施例3
制备方法，包括下述步骤：将西北沼委陵菜全草粉碎，加入体积百分比浓度65~75%乙醇溶液超声波提取0.5~1小时，然后过滤得超声波提取液和滤渣，向滤渣中加入体积百分比浓度65%~75%乙醇溶液回流提取2次，每次1.5~2小时，过滤得回流提取液，合并超声波提取液和回流提取液，将所得总提取液浓缩、干燥，得浸膏；将浸膏加蒸馏水分散，得浸膏分散液，然后依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作为溶剂萃取浸膏分散液。取乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液分别挥去溶剂，得到西北沼委陵菜乙酸乙酯部位和西北沼委陵菜正丁醇部位。
性能测试
以实施例1得到的西北沼委陵菜乙酸乙酯部位（标号为X1）、西北沼委陵菜正丁醇部位（标号为X2），作为受试药物。
一、检测样品与乙肝病毒（HBV）表面抗原（HBsAg）的亲和力实验：
以实施例1得到的西北沼委陵菜抗HBV 病毒有效部位为受试药物。采用 BIAcore 3000 生物分子相互作用仪，采用乙肝病毒表面抗原HBsAg直接与CM5 芯片偶联，采用牛血清蛋白（BSA）作为阴性对照。将X1、X2用经 0.45 μm 滤膜过滤的 PBS 稀释到200 μg/mL，流速 20 μL/min，注入量为 60 μL 进样，记录样品流经靶蛋白结合期时的 RU 值与流经 BSA 蛋白结合期的 RU 值，二者之差为该样品与靶蛋白的结合响应值。RU值越大说明其对乙肝病毒活性越好。
表1 西北沼委陵菜抗HBV 病毒有效部位与HBV病毒表面抗原的体外亲和RU值
。
通过表1可以看出：西北沼委陵菜乙酸乙酯部位和西北沼委陵菜正丁醇部位均对HBV病毒表面抗原具有较高的亲和力，抗HBV病毒的效果好。其中，西北沼委陵菜乙酸乙酯部位抗HBV病毒效果最优。
实施例4
将西北沼委陵菜有效部位制备为片剂，采用如下步骤：将西北沼委陵菜乙酸乙酯部位300mg和淀粉100mg混匀，加体积百分比浓度10%的淀粉糊40mg制成软材，过筛得湿颗粒，干燥得干颗粒，整粒，加硬脂酸镁4 mg混匀、压片，即得。
实施例5
冲剂的制备方法：按重量份配比将西北沼委陵菜正丁醇部位5份、蔗糖1份、糊精3份混匀，加入适量体积百分比95%乙醇溶液2~5份，边加边搅拌，制得软材，将软材干燥、过16目筛，分装即得。
实施例6
微丸胶囊由以下重量份原料组成：西北沼委陵正丁醇部位30份、卵磷脂5份、牛黄胆酸钠5份、微晶纤维素30份；
微丸胶囊的制备方法：按配比将西北沼委陵菜正丁醇醇部位、卵磷脂、牛黄胆酸钠和微晶纤维素混均，倒入乙醇水溶液搅匀获得软材，将软材倒入挤出机中挤出，经滚圆获得颗粒，挤出转速250r/min，滚圆转速800r/min，滚圆时间20min，干燥、过24~30目筛获得微丸，将微丸灌装入胶囊壳内，即得。
实施例7
脂质体注射剂的制备方法：1）在氮气保护下，将50g胆固醇琥珀酸酯、250g二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、40g大豆卵磷脂、50g泊洛沙姆-188、和10g西北沼委陵菜正丁醇部位溶解于1500mL 体积比为1:1的乙醇和正丁醇的有机溶剂中，搅拌使其溶解获得混悬液；将混悬液通过减压浓缩挥去有机溶剂，获得磷脂膜；
2）在氮气保护下，向磷脂膜中加入8000mL pH为6.8的磷酸盐缓冲溶液，搅拌，使磷脂膜洗脱并充分溶胀水合，经0.22μm微孔滤膜过滤，得西北沼委陵菜正丁醇部位的脂质体；
3）在无菌条件下，向西北沼委陵菜正丁醇部位的脂质体中，加入100g海藻糖，搅拌均匀，超声波处理0.5~1小时，加注射用水定容，经0.22μm微孔滤膜过滤，灌装，即得西北沼委陵菜65%乙醇部位的脂质体注射剂。
实施例8
纳米粒注射剂的制备方法：取25g西北沼委陵菜乙酸乙酯部位和100g泊洛沙姆407用3000mL 无水乙醇溶解，加入30mL 1mol/L氯化锌的乙醇溶液，搅拌混合，超声波处理0.5~1小时使其溶解，获得混合液；将混合液减压浓缩挥去溶剂，放入-20℃冰箱冷冻2小时；取出加注射用水定容，超声波处理0.5~1小时，经0.22μm微孔滤膜过滤，灌装，即得西北沼委陵菜乙酸乙酯部位的纳米粒注射剂。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。