本发明涉及医药领域，尤其涉及一种组合物及其在制备改善慢性鼻炎的产品中的应用。
背景技术：
：慢性鼻炎(chronicrhinitis)是鼻腔粘膜和粘膜下层的慢性炎症。表现为鼻粘膜的慢性充血肿胀，称慢性单纯性鼻炎(chronicsimplerhinitis)。其主要特点是炎症持续三个月以上或反复发作，经久不愈，间歇期亦不能恢复正常，且无明确的致病微生物，伴有不同程度的鼻塞，分泌物增多，鼻黏膜肿胀或增厚等障碍。引起慢性鼻炎的因素很多，主要分为全身因素、局部因素和环境因素3类。如如贫血、结核、糖尿病、风湿病、急性传染病后及慢性心、肝、肾疾病等，均可引起鼻黏膜长期淤血或反射性充血；鼻腔及鼻窦的慢性炎症，或临近感染灶的影响，促使发生慢性鼻炎；职业或生活环境中长期吸入各种粉尘，如煤、岩石、水泥、面粉、石灰等可损伤鼻黏膜纤毛功能，引起慢性鼻炎。在常规慢性鼻炎治疗中，西医主要采用粘膜血管收缩剂、口服抗菌药或手术等，有一定疗效，但难以消除全部症状。中医采用各类中药材熬制而成。但总体而言，目前并没有改善慢性鼻炎的特效药，进一步该法用于改善慢性鼻炎的产品具有十分重要的意义。技术实现要素：有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种组合物及其在制备改善慢性鼻炎的产品中的应用。本发明提供了一种组合物，包括中药提取物、干细胞提取物A和干细胞提取物B；中药提取物由金银花和薄荷水煎提取制得；干细胞提取物A由干细胞的培养上清液过滤、浓缩后冻干制得；干细胞提取物B由干细胞匀浆后与Tris-HCl溶液混合，离心后沉淀以乙酸水溶液溶解制得干细胞提取物B。每100mL组合物中包括干细胞提取物A20mg～200mg；干细胞提取物B50μg～100μg；余量为中药提取物。一些实施例中，每100mL组合物中包括干细胞提取物A20mg；干细胞提取物B50μg；余量为中药提取物。一些实施例中，每100mL组合物中包括干细胞提取物A100mg；干细胞提取物B100μg；余量为中药提取物。一些实施例中，每100mL组合物中包括干细胞提取物A200mg；干细胞提取物B80μg；余量为中药提取物。本发明提供的组合物中，干细胞为脐带间充质干细胞。具体的，干细胞为人脐带间充质干细胞。脐带间充质干细胞的获得方法为市场购得或自行制备本发明对此不做限定，其实施皆在本发明的保护范围之内。干细胞的制备方法包括：步骤1：脐带以含有200U/m双抗的PBS溶液冲洗3遍后，剪成2cm长小段，剥去动、静脉管和外膜后，剪碎成1-2mm2小块，均匀贴附于10cm培养皿，37℃5％CO2培养箱内倒放1-2h；培养基为X-VIVO15无血清培养基。步骤2：加入含有10ng/mL的EGF的X-VIVO15无血清培养基，37℃5％CO2培养2～3天后半量换液，继续培养6～8天，待细胞从组织块中爬出，弃去组织块继续培养；步骤3：待生长至80％融合，倒去培养液，PBS清洗一遍，加0.25％胰酶消化1～2min，加FBS终止消化，400g离心5min收集脐带间充质细胞。本发明中，干细胞的培养的采用含有EGF的X-VIVO15无血清培养基；其中EGF的浓度为10ng/mL。干细胞的培养方法为，将细胞接种至含有EGF的X-VIVO15无血清培养基37℃，5％CO2培养箱培养至80％融合后继续传代。干细胞提取物A的制备方法包括：将干细胞培养上清液以0.45μm滤膜过滤后，滤液再经0.22μm滤膜过滤，所得滤液以切向流过滤器循环过滤3h后，经冷冻干燥制得干细胞提取物A。干细胞培养上清液为P2或P3代的脐带间充质干细胞的培养上清液。干细胞提取物B的制备方法包括：步骤1：收集干细胞以生理盐水清洗后，与缓冲液混合，进行匀浆；步骤2：步骤1中所得匀浆液与Tris-HCl溶液混合后，18000rpm离心10min，取沉淀以浓度为0.1mol/L乙酸水溶液溶解制得干细胞提取物B。步骤1中所述缓冲液中含有HEPES、MgCl2和EGTA；其中，HEPES的浓度为50mmol/L；MgCl2的浓度为3mmol/L；EGTA的浓度为1mmol/L。该缓冲液的pH值为7.4。作为优选，步骤2中匀浆液与Tris-HCl溶液混合后，18000rpm离心10min的操作重复3次。所述Tris-HCl溶液的浓度为50mmol/L，pH值为7.4。所述匀浆液与Tris-HCl溶液的体积比为1:1至1:5。本发明实施例中，每μg干细胞提取物B由0.04×107个细胞制成。一些实施例中，中药提取物中金银花与薄荷的质量比为1：(1～5)。水煎提取中药提取物中，金银花与薄荷的质量之和与水的质量体积比为1:10至1:50。所述水煎提取的温度为80～100℃，时间为30min～60min.水煎提取后，以100目筛网过滤，获得中药提取物。每100ml中药由100～500g金银花，100～500g薄荷制成。本发明提供的组合物在制备改善慢性鼻炎的产品中的应用。实验表明，相对于不做处理的对照组，本发明提供的组合物能够显著改善慢性鼻炎模型小鼠的严重程度，流涕、喷嚏、鼻痒症状减轻。相对于巾给予中药提取物的对照组和仅给予干细胞提取物A和B的对照组，本发明提供的组合物对鼻炎模型小鼠症状的改善效果皆存在显著性差异(p<0.05)。本发明还提供了一种改善慢性鼻炎的产品，包括本发明提供的的组合物。本发明提供的组合物可单独用于改善慢性鼻炎，也可添加其他辅料制成不同的剂型用于改善慢性鼻炎，本发明对此不做限定。优选剂型为喷剂。实验表明，给予本发明提供的组合物制成的喷剂能够有效改善慢性鼻炎，有效率可达95％；治愈率可达60％。本发明还提供了一种改善慢性鼻炎的方法，该方法为给予本发明提供的组合物。给予本发明提供的组合物的剂量为每次1-2滴/孔。本发明提供了一种组合物，其中包括中药提取物、干细胞提取物A和干细胞提取物B。实验表明，本发明提供的组合物能够显著改善慢性鼻炎的症状，将其用于治疗慢性鼻炎，有效率可达95％；治愈率可达60％。具体实施方式本发明提供了一种组合物及其在制备改善慢性鼻炎的产品中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1制备脐带间充质干细胞脐带以含有200U/m双抗的PBS溶液冲洗3遍后，剪成2cm长小段，剥去动、静脉管和外膜后，剪碎成1-2mm2小块，均匀贴附于10cm培养皿，37℃5％CO2培养箱内倒放1-2h；培养基为X-VIVO15无血清培养基加入含有10ng/mL的EGF的X-VIVO15无血清培养基，37℃5％CO2培养2～3天后半量换液，继续培养6～8天，待细胞从组织块中爬出，弃去组织块继续培养；待生长至80％融合，倒去培养液，PBS清洗一遍，加0.25％胰酶消化1～2min，加FBS终止消化，400g离心5min收集脐带间充质细胞。以含有10ng/mL的EGF的X-VIVO15无血清培养基重悬脐带间充质细胞，根据计数结果接种2-3皿(接种密度为1-5×105cell/ml)。待细胞生长至80％融合后继续传代，至P2或P3代细胞进行细胞和培养上清液的收集。实施例2干细胞提取物A的制备收集实施例1中制得的P2和P3代干细胞培养上清液，采用Slice200切向流过滤器浓缩，循环过滤的时间为3h，该过程中，经0.45μm滤膜过滤除去大颗粒物质，再经0.22μm滤膜过滤，除去3kDa以下小颗粒物质；浓缩液用冻干机制成冻干粉，即为干细胞提取物A。实施例3干细胞提取物B的制备1、收集实施例1中制得的P2和P3代干细胞，消化收集。收集细胞悬液与50ml离心管，400g离心，去上清液，加生理盐水清洗两遍。2、沉淀细胞中加入冰冷的匀浆液(HEPES:50mM，PH7.4，MgCl2：3mM，EGTA：1mM)将溶液和沉淀转移到匀浆器中，匀浆。3、将匀浆液转入离心管中，加入适量的Tris–HCl(50mM,pH7.4)4℃，18000rpm(40000g)离心10分钟。在沉淀中加入同前量的匀浆液，再匀浆，匀浆后加入适量的tris-HClbuffer.4℃18000rpm(40000g)离心，共离心三次。4在最后一次离心得到沉淀中加入0.1M的乙酸溶液溶解，于-80℃冰箱中备用。实施例4中药提取物的制备1.取金银花和薄荷按1:1的质量比混合后，取混合物200g加入1L水煎提取后(80℃熬制60min)，冷却。(每100ml提取物由100g金银花，100g薄荷制成)。实施例5中药提取物的制备1.取金银花和薄荷按1:5的质量比混合后，取混合物200g加入1L水煎提取后(100℃熬制30min)，冷却。(每100ml提取物由100g金银花，500g薄荷制成)。实施例6组合物的制备混合实施例4制得的中药提取物、实施例3制得的干细胞提取物B，加入实施例2制得的干细胞提取物A，制得组合物每100ml组合物中含有：干细胞提取物A20mg干细胞提取物B50μg其余为中药提取物。实施例7组合物的制备混合实施例5制得的中药提取物、实施例3制得的干细胞提取物B，加入实施例2制得的干细胞提取物A，制得组合物每100ml组合物中含有：干细胞提取物A100mg干细胞提取物B100μg其余为中药提取物。实施例8组合物的制备混合实施例5制得的中药提取物、实施例3制得的干细胞提取物B，加入实施例2制得的干细胞提取物A，制得组合物每100ml组合物中含有：干细胞提取物A200mg干细胞提取物B80μg其余为中药提取物。实施例9组合物对动物模型鼻炎症状的改善1、鼻炎动物模型构建：取健康Wistar大鼠若干只，以卵清蛋白(OVA)作为致敏原进行致敏作用，具体操作如下：a取0.3mg的OVA和30mg的佐剂Al(OH)3，加生理盐水1ml形成混悬液，进行腹腔注射，隔日一次，共7次；b用0.5％的OVA生理盐水滴鼻。每侧0.05ml，每日一次，共7次。当出现严重鼻痒、抓挠鼻、喷嚏、流涕则动物模型构建成功。2、给药实验：取鼻炎模型构建成功大鼠35只，随机分成7组，分别进行给药，其中，对照组1：不进行任何药物使用；对照组2：公开号为CN105311003的专利药物；对照组3：实施例5中药提取物；对照组4：生理盐水中混合实施例3干细胞提取物B80μg(3.2×107个细胞)、实施例2干细胞提取物A200mg；实验组1：给予实施例6组合物；实验组2：给予实施例7组合物；实验组3：给予实施例8组合物；连续7天，每天2次，每次1ml，第7天观察状态。3、效果评估：鼻痒轻度：1分，轻擦鼻几次；重度：2分，抓挠鼻、面不止，到处摩擦；喷嚏轻度：1分，1～3个/小时；中度：2分，4～10个/小时；重度：3分，11个以上/小时；流涕轻度：1分，留到鼻前孔中度：2分，流过鼻前孔重度：3分，流涕满面；4、评分结果表1评分结果组别分值对照组18.25对照组24.8对照组35.2对照组43.4实验组10.25实验组20.25实验组30.4实验表明，相对于不做处理的对照组，本发明提供的组合物能够显著改善慢性鼻炎模型小鼠的严重程度，流涕、喷嚏、鼻痒症状减轻。相对于巾给予中药提取物的对照组和仅给予干细胞提取物A和B的对照组，本发明提供的组合物对鼻炎模型小鼠症状的改善效果皆存在显著性差异(p<0.05)。实施例10组合物对受试人群鼻炎症状的改善选取100名慢性鼻炎志愿者(男性65名，女性35名，年龄20-55岁，平均年龄37岁，慢性鼻炎时间2-8年)，随机分成5组，分别进行如下试验：对照组1：不进行任何药物使用；对照组2：公开号为CN105311003的专利药物；对照组3：实施例5中药提取物；对照组4：生理盐水中混合实施例3干细胞提取物B80μg(3.2×107个细胞)、实施例2干细胞提取物A200mg；实验组1：给予实施例6组合物；实验组2：给予实施例7组合物；实验组3：给予实施例8组合物；各组组合物制成喷剂，每天早中晚各一次，所有人群持续使用半年，调查效果：治愈率＝治愈数/病例数有效率＝(好转数+治愈数)/病例数得到结果如下表：表2治疗效果实验表明，给予本发明提供的组合物制成的喷剂能够有效改善慢性鼻炎，有效率可达95％；治愈率可达60％。该效果显著优于对照组。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3