本发明涉及勒马回注射液及其制备，具体涉及一种治疗糖尿病足的勒马回注射液及其制备方法。
背景技术：
糖尿病足是糖尿病一种严重的并发症，是糖尿病患者致残，甚至致死的重要原因之一，不但给患者造成痛苦，而且使其增添了巨大的经济负担。据不完全统计，糖尿病足部溃疡占20%左右。
糖尿病患者足部由于神经病变使下肢保护功能减退，大血管和微血管病变使动脉灌注不足致微循环障碍容易发生糖尿病足。其中感觉神经病变合并过高的机械应力，是引起足部溃疡和感染的主要始动因素。炎症与组织损害是一定程度的反复应力作用于一个特定的失去感觉的区域的结果。来自地面、鞋子或其他邻近足趾的压力或剪切力导致溃疡形成，由于缺乏正常的神经保护机制，溃疡常因骨突的存在而加重。自主神经系统的病变造成皮肤正常排汗调节功能、皮肤温度调节功能和血运调节能力丧失，导致局部组织柔韧性降低，形成厚的胼胝以及更易破碎和开裂。此外，正常排汗能力的丧失阻断了局部组织的再水化，造成组织进一步破坏，使得深部组织更易于细菌定植。运动神经病变在糖尿病足的发病中也起到了一定作用，足内在肌的挛缩造成典型的爪状趾畸形。跖趾关节的过伸也被证明能够直接增加跖骨头下压力，使得该部位更易形成溃疡。近趾间关节屈曲造成突起的趾间关节背侧与趾尖跖侧形成溃疡的风险增加，而血管病变又使得破坏的组织难以愈合。
现有技术中治疗糖尿病足的药剂主要为外擦软膏，通过活血、杀菌达到局部治疗糖尿病足的效果，然而外敷药剂的药效作用慢，且治标不治本，不能从根本上治愈糖尿病足。
本专利的发明人在研究工作中意外发现，将勒马回制备成注射液进行穴位注射治疗糖尿病足取了令人意想不到的效果，在此基础上，发明人进行了反复多次的研究后，得到了本发明的技术方案。
本发明所述勒马回为玄参科水蔓菁Pseudolysimachion linariifolium subsp．dilatatum(Nakai ＆Kitagawa)D．Y．Hong的地上全草。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供了一种治疗糖尿病足的勒马回注射液及其制备方法，它的作用迅速可靠其药液直接注入穴位，吸收过程很短，且不经过消化道，不受pH、酶、食物等影响，无首过效应，药物含量不易损失，疗效可靠。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种治疗糖尿病足的勒马回注射液，由活性药物和药物辅料组成，所述活性药物为勒马回提取液。
优选的，所述勒马回提取液占注射液总体积的5%。
优选的，所述药物辅料为氯化钠、维生素C、磺丁基-β-环糊精、丙三醇、乳酸乙酯、柠檬酸、甘露醇、甘油、甘氨酸、山梨醇中的一种或多种。
一种治疗糖尿病足的勒马回注射液的制备方法，步骤如下：
（1）取干燥的勒马回加入3～8倍量浓度为65～85％的乙醇水溶液中，升温至80～100℃，加热回流提取0.5～2 h后冷却过滤，得到提取液和药渣，对药渣重复上述操作2次，合并3次所得药液，然后减压蒸馏，得到醇提物；
（2）在醇提物中加入蒸馏水，混合均匀后，静置3～5 h后，过滤，取上清液，再用超滤膜过滤，滤液浓缩，得到相对密度为1.05～1.15的勒马回初提取液；
（3）将勒马回初提取液经D101B型大孔吸附树脂处理，先用柱体积2～10倍量的pH 1～5的水溶液进行洗脱，收集洗脱液，再用柱体积2～10倍量的50%的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，两次洗脱液合并，浓缩，得到浓缩液，然后将浓缩液用碱调节pH至10～11，在60～80℃下加热1～2h，再调节pH至3～5，然后将其经聚酰胺树脂柱处理，用2～5倍的水洗脱，收集洗脱液，然后在70～80℃下蒸馏，除去乙醇至无醇味，再调节pH至6～7，得到勒马回提取液；
（4）在勒马回提取液中加入氯化钠和其他药物辅料搅拌混合均匀，再补充注射用水至所需量，调整pH值6.5～8.0，然后冲氮气灌装，密封，用100℃的流通蒸汽灭菌30分钟，即得勒马回注射液。
优选的，所述治疗糖尿病足的勒马回注射液的制备方法，步骤如下：
（1）取干燥的勒马回加入5倍量浓度为75％的乙醇水溶液中，升温至85℃，加热回流1.5 h后冷却过滤，得到提取液和药渣，对药渣重复上述操作2次，合并3次所得药液，然后减压蒸馏，得到醇提物；
（2）在醇提物中加入蒸馏水，混合均匀后，静置4 h后，过滤，取上清液，再用超滤膜过滤，滤液浓缩，得到相对密度为1.15的勒马回初提取液；
（3）将勒马回初提取液经D101B型大孔吸附树脂处理，先用柱体积5倍量的pH 为3的水溶液进行洗脱，收集洗脱液，再用柱体积5倍量的50%乙醇进行洗脱，收集洗脱液，两次洗脱液合并，浓缩，得到浓缩液，然后将浓缩液用氨水调节pH至10，在60℃下加热1.5 h，再用盐酸调节pH至5，然后将其经聚酰胺树脂柱处理，用3倍的水洗脱，收集洗脱液，在80℃下对洗脱液进行蒸馏，除去乙醇至无醇味，再调节pH至7，得到勒马回提取液；
（4）在勒马回提取液中加入氯化钠和其他药物辅料搅拌混合均匀，再补充注射用水至所需量，调整pH值7，然后冲氮气灌装，密封，用100℃的流通蒸汽灭菌30分钟，即得勒马回注射液。
优选的，步骤（1）所述的减压蒸馏工艺条件为-0.05～-0.09MPa、40～90℃。
优选的，步骤（2）所述的超滤所用的超滤膜为3000～6000道尔顿，选自二醋酸纤维素膜、三醋酸纤维素膜、氰乙基醋酸纤维素膜、聚砜膜、磺化聚砜膜、聚醚砜膜、磺化聚醚砜膜、聚砜酰胺膜、酚酞侧基聚芳砜膜、聚偏氟乙烯膜、聚丙烯腈膜、聚酰亚胺膜、纤维素膜、甲基丙烯酸甲酯-丙烯腈共聚物膜、聚丙烯腈-二醋酸纤维素共混膜。
一种勒马回注射液在制备治疗糖尿病足药物中的应用，该勒马回注射液由活性药物和药物辅料组成，所述活性药物为勒马回提取液，占勒马回注射液总体积的5%，所述药物辅料为氯化钠、丙三醇、甘油、水，该勒马回注射液的制备方法，步骤如下：
（1）将干燥的勒马回加入5倍量浓度为75％的乙醇水溶液中，升温至85℃，加热回流1.5 h后冷却过滤，得到提取液和药渣，对药渣重复上述操作2次，合并3次所得药液，然后工艺条件为-0.05～-0.09MPa、40～90℃的条件下减压蒸馏，得到醇提物；
（2）在醇提物中加入蒸馏水，混合均匀后，静置4 h后，过滤，取上清液，再用3000～6000道尔顿的二醋酸纤维素超滤膜过滤，滤液浓缩，得到相对密度为1.15的勒马回初提取液；
（3）将勒马回初提取液经D101B型大孔吸附树脂处理，先用柱体积5倍量的pH 为3的水溶液进行洗脱，收集洗脱液，再用柱体积5倍量的50%乙醇进行洗脱，收集洗脱液，两次洗脱液合并，浓缩，得到浓缩液，然后将浓缩液用氨水调节pH至10，在60℃下加热1.5 h，再用盐酸调节pH至5，然后将其经聚酰胺树脂柱处理，用3倍的水洗脱，收集洗脱液，在80℃下对洗脱液进行蒸馏，除去乙醇至无醇味，再调节pH至7，得到勒马回提取液；
（4）在勒马回提取液中加入氯化钠和其他药物辅料搅拌混合均匀，再补充注射用水至所需量，调整pH值7，然后冲氮气灌装，密封，用100℃的流通蒸汽灭菌30分钟，即得勒马回注射液。
一种勒马回注射液在制备治疗失眠药物中的应用，该勒马回注射液由活性药物和药物辅料组成，所述活性药物为勒马回提取液，占勒马回注射液总体积的5%，所述药物辅料为氯化钠、丙三醇、甘油、水，该勒马回注射液的制备方法，步骤如下：
（1）将干燥的勒马回加入5倍量浓度为75％的乙醇水溶液中，升温至85℃，加热回流1.5 h后冷却过滤，得到提取液和药渣，对药渣重复上述操作2次，合并3次所得药液，然后工艺条件为-0.05～-0.09MPa、40～90℃的条件下减压蒸馏，得到醇提物；
（2）在醇提物中加入蒸馏水，混合均匀后，静置4 h后，过滤，取上清液，再用3000～6000道尔顿的二醋酸纤维素超滤膜过滤，滤液浓缩，得到相对密度为1.15的勒马回初提取液；
（3）将勒马回初提取液经D101B型大孔吸附树脂处理，先用柱体积5倍量的pH 为3的水溶液进行洗脱，收集洗脱液，再用柱体积5倍量的50%乙醇进行洗脱，收集洗脱液，两次洗脱液合并，浓缩，得到浓缩液，然后将浓缩液用氨水调节pH至10，在60℃下加热1.5 h，再用盐酸调节pH至5，然后将其经聚酰胺树脂柱处理，用3倍的水洗脱，收集洗脱液，在80℃下对洗脱液进行蒸馏，除去乙醇至无醇味，再调节pH至7，得到勒马回提取液；
（4）在勒马回提取液中加入氯化钠和其他药物辅料搅拌混合均匀，再补充注射用水至所需量，调整pH值7，然后冲氮气灌装，密封，用100℃的流通蒸汽灭菌30分钟，即得勒马回注射液。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一种治疗糖尿病足的勒马回注射液，由占注射液总体积5%的勒马回提取液和氯化钠、甘氨酸、甘氨酸、山梨醇、柠檬酸、水组成。
一种治疗糖尿病足的勒马回注射液的制备方法，步骤如下：
（1）取干燥的勒马回100g，加入3～8倍量浓度为65～85％的乙醇水溶液中，升温至80～100℃，加热回流提取0.5～2 h后冷却过滤，得到提取液和药渣，对药渣重复上述操作2次，合并3次所得药液，然后减压蒸馏，得到醇提物；
（2）在醇提物中加入蒸馏水，混合均匀后，静置3～5 h后，过滤，取上清液，再用超滤膜过滤，滤液浓缩，得到相对密度为1.05～1.15的勒马回初提取液；
（3）将勒马回初提取液经D101B型大孔吸附树脂处理，先用柱体积2～10倍量的pH 1～5的水溶液进行洗脱，收集洗脱液，再用柱体积2～10倍量的50%的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，两次洗脱液合并，浓缩，得到浓缩液，然后将浓缩液用碱调节pH至10～11，在60～80℃下加热1～2h，再调节pH至3～5，然后将其经聚酰胺树脂柱处理，用2～5倍的水洗脱，收集洗脱液，然后在70～80℃下蒸馏，除去乙醇至无醇味，再调节pH至6～7，得到勒马回提取液；
（4）在勒马回提取液中加入氯化钠和其他药物辅料搅拌混合均匀，再补充注射用水至1000mL，调整pH值6.5～8.0，垂熔玻璃漏斗滤过，然后冲氮气灌封于2mL安瓿中，密封，用100℃的流通蒸汽灭菌30分钟，即得勒马回注射液。
实施例2：
一种治疗糖尿病足的勒马回注射液，由占注射液总体积5%的勒马回提取液和氯化钠、磺丁基-β-环糊精、山梨醇、乳酸乙酯、水组成。
一种治疗糖尿病足的勒马回注射液的制备方法，步骤如下：
（1）取干燥的勒马回100g，加入6倍量浓度为65％的乙醇水溶液中，升温至80℃，加热回流提取0.5后冷却过滤，得到提取液和药渣，对药渣重复上述操作2次，合并3次所得药液，然后减压蒸馏，得到醇提物；
（2）在醇提物中加入蒸馏水，混合均匀后，静置3h后，过滤，取上清液，再用超滤膜过滤，滤液浓缩，得到相对密度为1.05～1.15的勒马回初提取液；
（3）将勒马回初提取液经D101B型大孔吸附树脂处理，先用柱体积10倍量的pH 1的水溶液进行洗脱，收集洗脱液，再用柱体积2倍量的50%的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，两次洗脱液合并，浓缩，得到浓缩液，然后将浓缩液用碱调节pH至11，在80℃下加热1h，再调节pH至5，然后将其经聚酰胺树脂柱处理，用5倍的水洗脱，收集洗脱液，然后在80℃下蒸馏，除去乙醇至无醇味，再调节pH至6，得到勒马回提取液；
（4）在勒马回提取液中加入氯化钠和其他药物辅料搅拌混合均匀，再补充注射用水至1000mL，调整pH值6.5～8.0，垂熔玻璃漏斗滤过，然后冲氮气灌封于2mL安瓿中，密封，用100℃的流通蒸汽灭菌30分钟，即得勒马回注射液。
实施例3：
一种治疗糖尿病足的勒马回注射液，由5%的勒马回提取液和氯化钠、丙三醇、水组成。
一种治疗糖尿病足的勒马回注射液的制备方法，步骤如下：
（1）取干燥的勒马回100g，加入5倍量浓度为75％的乙醇水溶液中，升温至85℃，加热回流1.5 h后冷却过滤，得到提取液和药渣，对药渣重复上述操作2次，合并3次所得药液，然后减压蒸馏，得到醇提物，所述减压蒸馏工艺为-0.05 MPa、60℃；
（2）在醇提物中加入蒸馏水，混合均匀后，静置3 h后，过滤，取上清液，再用3000道尔顿的氰乙基醋酸纤维素膜过滤24 h，得到相对密度为1.15的勒马回初提取液；
（3）将勒马回初提取液经吸附树脂柱处理，先用柱体积5倍量的pH 3的水溶液进行洗脱，再用柱体积5倍量的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，浓缩得到浓缩液，然后将浓缩液用氨水调节pH至10，在60℃下加热3 h，再调节pH至5，然后将其经聚酰胺树脂柱处理，用2倍的水洗脱，然后在80℃下蒸馏，除去乙醇至无醇味，再调节pH至7，得到勒马回提取液；
（4）在勒马回提取液中加入氯化钠和其他药物辅料搅拌混合均匀，再补充注射用水至1000mL，调整pH值7，垂熔玻璃漏斗滤过，然后冲氮气灌封于2mL安瓿中，密封，用100℃的流通蒸汽灭菌30分钟，即得勒马回注射液。
实施例4：勒马回提取工艺条件的研究
1、乙醇浓度
根据提取工艺的实验设计，多不同浓度的乙醇进行优选，实验分别以25%、50%、75%和95%的乙醇作为提取溶剂，以提取物中原儿茶酸的的转移率为考察指标，同时结合原儿茶酸的含量，对不同溶剂进行考察。
实验方法：称取勒马回5份，每份200g，加入溶剂加热回流3次，加热回流温度为85℃，时间为1h，将三次提取的提取液合并，减压蒸馏回收乙醇，真空干燥，测定原儿茶酸的含量（测定方法参照：陈勇,方翠芬,向智敏,唐登峰.RP-HPLC测定勒马回胶囊中原儿茶酸的含量[J].中成药. 2007.29(12): 1867-1869.下同），结果如表1。
其中实验组溶剂分别为5倍量 25%、50%、75%和95%的乙醇，对照组溶剂为5倍量蒸馏水。
表1 乙醇浓度对提取工艺的影响
结果表明，用75%的乙醇提取时，原儿茶酸的含量和转移率均高于其他浓度的乙醇，因此选择75%的乙醇作为提取溶剂。
、加热温度
在确定了提取溶剂后，还需对提取温度进一步优选，实验以75%乙醇作为提取溶剂，提取时间为1.5h，加热温度分别为80℃、85℃、90℃、100℃以提取物中原儿茶酸的的转移率为考察指标，对加热时间进行优选，结果如表2。
表2 加热温度对提取工艺的影响
结果表明，实验组2的原儿茶酸的转移率明显高于其他组，因此选择加热温度为85℃。
、加热时间
在确定了提取溶剂后，还需对提取时间进一步优选，实验以75%乙醇作为提取溶剂，加热回流温度为85℃，提取时间分别为0.5h、1h、1.5h、2h的乙醇作为提取溶剂，以提取物中原儿茶酸的的转移率为考察指标，对加热时间进行优选，结果如表3。
表3 加热时间对提取工艺的影响
结果表明，实验组3的原儿茶酸的转移率高于实施组1和实验组2，与实验组4物明显差异，因此选择加热回流时间为1.5h。
实施例5：勒马回注射液治疗糖尿病足的实验研究
1 实验材料
1.1 试验动物
实验选用SPF级健康雄性Wistar大鼠50只（由黑龙江中医药大学动物中心提供），体重为（250±10）g。饲养在室温22～25℃、湿度50%、通风良好的环境中，以清洁级饲料（由黑龙江中医药大学动物中心提供）单笼喂养，自由摄食、饮水。
1.2 试剂与药物
链脲佐菌素（Steptozotocin，STZ）：西格玛（Sigma）奥德里奇上海贸易有限公司；
勒马回注射液：勒马回注射液由活性药物和药物辅料组成，所述活性药物为勒马回提取液，占勒马回注射液总体积的5%，所述药物辅料为氯化钠、丙三醇、甘油、水，该勒马回注射液的制备方法，步骤如下：
（1）将干燥的勒马回100g，加入5倍量浓度为75％的乙醇水溶液中，升温至85℃，加热回流1.5 h后冷却过滤，得到提取液和药渣，对药渣重复上述操作2次，合并3次所得药液，然后工艺条件为-0.05～-0.09MPa、40～90℃的条件下减压蒸馏，得到醇提物；
（2）在醇提物中加入蒸馏水，混合均匀后，静置4 h后，过滤，取上清液，再用3000～6000道尔顿的二醋酸纤维素超滤膜过滤，滤液浓缩，得到相对密度为1.15的勒马回初提取液；
（3）将勒马回初提取液经D101B型大孔吸附树脂处理，先用柱体积5倍量的pH 为3的水溶液进行洗脱，收集洗脱液，再用柱体积5倍量的50%乙醇进行洗脱，收集洗脱液，两次洗脱液合并，浓缩，得到浓缩液，然后将浓缩液用氨水调节pH至10，在60℃下加热1.5 h，再用盐酸调节pH至5，然后将其经聚酰胺树脂柱处理，用3倍的水洗脱，收集洗脱液，在80℃下对洗脱液进行蒸馏，除去乙醇至无醇味，再调节pH至7，得到勒马回提取液；
（4）在勒马回提取液中加入氯化钠和其他药物辅料搅拌混合均匀，再补充注射用水至1000mL，调整pH值7，垂熔玻璃漏斗滤过，然后冲氮气灌封于2mL安瓿中，密封，用100℃的流通蒸汽灭菌30分钟，即得勒马回注射液。
1.3 制备糖尿病足大鼠模型
随机抽取40只大鼠采用STZ腹腔注射的方法建立糖尿病大鼠模型，根据缺血-再灌注原理制造糖尿病足大鼠模型（足溃疡是糖尿病足的主要症状之一）。对糖尿病模型组大鼠的右后肢同一部位进行结扎，使用10号外科缝线结扎大鼠足踝部，每次结扎2h，放开30min，每天重复结扎3次，共结扎3d，隔1d操作1次。以被结扎肢体出现皮肤发黑，水泡、血泡、溃疡，为确认造模成功的标准。结扎时，由同一个人进行操作，保证结扎时使用力量相同。所有被结扎大鼠均成模。
1.4 勒马回注射液对糖尿病足大鼠模型的干预
将40只糖尿病足大鼠模型根据体重编号，按照随机数字表法，将糖尿病足大鼠模型分为2组，每组20只，分别为：勒马回注射液治疗组和糖尿病足空白对照组。对勒马回注射液量组按照300mg/（kg·d）（相当于临床患者日用量的5倍）的用药量，向小鼠左侧腓肠肌位置注射药物，1次/d。对糖尿病足空白对照组使用生理盐水灌胃，2次/d。每周测量体重，更改用药量，共用药6周。分别检测各组大鼠的空腹血糖（FBG）、空腹血清胰岛素（FSI）、血流变（包括高切变率、低切变率、血浆黏度、血细胞比容、红细胞聚集指数、红细胞变形指数6项指标）。
1.5 统计学方法
用Excel建立数据库，以SPSS13.0统计分析软件分析数据。计量资料以±s表示，二组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析；计数资料比较采用χ2检验，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 勒马回注射液治疗组、糖尿病足空白对照组疗效比较
通过6周的勒马回注射液干预后，糖尿病足勒马回注射液治疗组治疗后，足部症状明显好转；而糖尿病足空白对照组大鼠的体重较治疗前明显下降，足部症状趋于恶化。见表4。
表4 勒马回注射液治疗组和糖尿病足空白对照组足部症状评分等级情况（只，%）
注：二组比较，χ2=10.489，P=0.015。两组有明显差异。
2.2 勒马回注射液治疗组和糖尿病足空白对照组之间各检测指标比较
在实验初期即治疗前，二组大鼠的FBG、体重量及足部症状评分无明显差异；勒马回注射液治疗组在治疗后FBG显著降低，FSI明显升高，血流变中高切变率、低切变率、血浆黏度、血细胞比容、红细胞聚集指数、红细胞变形指数均著性降低。见表5。
表5 勒马回注射液治疗组与糖尿病足空白对照组治疗后体重量、FBG、FSI和血流变的比较（±s）
3 结论
本实验证实：（1）勒马回注射液能够改善2型糖尿病大鼠的空腹血糖及足部溃疡的症状，具有一定的降低血糖、治疗糖尿病足的作用。（2）勒马回注射液能够显著降低糖尿病足大鼠血流变中6项指标，对血液流变学有改善作用。本次实验还证实勒马回注射液具有降低糖尿病大鼠的血糖，说明该药对糖尿病是有影响的；实验中大鼠的血清胰岛素水平在用药后有明显的升高，说明本药能够改善诱导的2型糖尿病大鼠的胰岛功能。
实施例6：勒马回注射液穴位注射治疗0级糖尿病足的临床观察
糖尿病足使病人的生活质量严重下降，而且治疗困难，治疗周期长，医疗费用高，给患者和社会带来了沉重的负担。发明人以0级糖尿病足病人为研究对象，采用随机分组对照设计的研究方法，给予不同的治疗护理措施，对0级糖尿病足的恶化干预进行研究，从而探索一种0级糖尿病足比较理想的治疗护理方法，防止足溃疡发生。
1对象与方法
1.1对象
2015年12月至2016年7月住院治疗的2型糖尿病0级糖尿病足24例，糖尿病足患者均符合糖尿病足国际临床指南的诊断标准。其中男12例，女12例，年龄50岁～65岁，平均（62.9±50.1）岁，糖尿病病程（3.6±2.1）年；均接受糖尿病系统治疗，口服降糖药或胰岛素治疗有效。所有患者足部皮肤完整，无开放性病灶，经中医辨证为脉络瘀阻，表现为足部皮肤紫红或紫黯，肢体发凉麻木，疼痛剧烈，趺阳脉减弱。随机分成实验组与对照组，每组12例，两组病人一般情况（性别、年龄、病程、症状、体征、血糖、糖化血红蛋自、血脂、血压等）无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2方法
把相关病人按入院的先后顺序编号，分别随机编入两个组。
对照组：糖尿病饮食及运动治疗加口服降糖药和（或）胰岛素治疗控制血糖，使空腹血糖≤7.0mmoL/L，餐后血糖≤10.0mmoL/L，采用常规足部护理及健康教育。
实验组：在原同等治疗护理基础上采用勒马回注射液穴位注射。参照国家技术监督局颁布的中华人民共和国标准《经穴定位》，定足三里穴。患者取平卧位，每次取一侧足三里穴位，左右轮替使用、穴区皮肤常规消毒后，用配有5号针头的2mL灭菌注射器抽取勒马回注射液2mL，直刺皮下0.5一1寸，得气后回抽无血及无神经放射痛，每穴注射入勒马回注射液1mL，每日1次，15次为一个疗程，治疗一个疗程。
勒马回注射液：勒马回注射液由活性药物和药物辅料组成，所述活性药物为勒马回提取液，占勒马回注射液总体积的5%，所述药物辅料为氯化钠、丙三醇、甘油、水，该勒马回注射液的制备方法，步骤如下：
（1）将干燥的勒马回100g，加入5倍量浓度为75％的乙醇水溶液中，升温至85℃，加热回流1.5 h后冷却过滤，得到提取液和药渣，对药渣重复上述操作2次，合并3次所得药液，然后工艺条件为-0.05～-0.09MPa、40～90℃的条件下减压蒸馏，得到醇提物；
（2）在醇提物中加入蒸馏水，混合均匀后，静置4 h后，过滤，取上清液，再用3000～6000道尔顿的二醋酸纤维素超滤膜过滤，滤液浓缩，得到相对密度为1.15的勒马回初提取液；
（3）将勒马回初提取液经D101B型大孔吸附树脂处理，先用柱体积5倍量的pH 为3的水溶液进行洗脱，收集洗脱液，再用柱体积5倍量的50%乙醇进行洗脱，收集洗脱液，两次洗脱液合并，浓缩，得到浓缩液，然后将浓缩液用氨水调节pH至10，在60℃下加热1.5 h，再用盐酸调节pH至5，然后将其经聚酰胺树脂柱处理，用3倍的水洗脱，收集洗脱液，在80℃下对洗脱液进行蒸馏，除去乙醇至无醇味，再调节pH至7，得到勒马回提取液；
（4）在勒马回提取液中加入氯化钠和其他药物辅料搅拌混合均匀，再补充注射用水至1000mL，调整pH值7，垂熔玻璃漏斗滤过，然后冲氮气灌封于2mL安瓿中，密封，用100℃的流通蒸汽灭菌30分钟，即得勒马回注射液。
1.3临床疗效观察
1.3.1评判标准
参考2002年《中药新药临床研究指导原则》中的《中药新药理疗消渴病（糖尿病）的临床要就指导原则》。
痊愈：疼痛、麻木、发凉等症状治疗后全部消失，皮肤颜色恢复正常；
显效：疼痛、麻木、发凉等症状治疗后明显改善，皮肤颜色明显改善；
有效：疼痛、麻木、发凉等症状治疗后好转，皮肤颜色改善；
无效：疼痛、麻木、发凉等症状治疗后变化不明显，皮肤颜色未改善。
所有对象由专人负责观察相关症状及体征并记录（观察者不参与治疗，也不知分组情况），观察及检测于第一次治疗前一天和最后一次治疗后一天进行。
1.3.2学业流变学监测
采用Acuson28XP/10型彩色超声多普勒仪测定病人治疗前后的足背动脉血液流变参数，于第一次治疗前一天和最后一次治疗后一天进行。
1.4副反应观察
分别于注射后0.5h、2h、6h、12h、24h、三天、七天，观察有无搔痒、红肿、疼痛等局部反应及晕针、头痛、休克等全身反应。
1.5统计学处理
所有数据应用SPSS11.0统计软件处理，计数资料和率的检验采用检验，计量资料用均数±标准差（）表示，采用t检验。
2结果
2.1两组病人双足治疗效果比较
表6 两组病人双足治疗效果比较
表6结果表明：实验组的治疗总有效率为100.00%，对照组的治疗总有效率为58.33%，两组间比较有显著差异（=12.596，*P<0.01）.
2.2两组病人血液流变学参数比较
表7 两组病人足背动脉血液流变学参数比较（）
表7结果表明：两组病人治疗前足背动脉内径、血流速度和血流量数值比较，无统计学差异（P>0.05）。②两组病人治疗前后自身比较，治疗组病人治疗后足背动脉内径扩大，血流速度加快，血流量增多，与治疗前比较具有统计学意义（P<0.01），而对照组病人治疗后变化无统计学意义（P>0.05）。③两组病人治疗后比较，各参数实验组均优于对照组，具有显著的统计学意义〔P<0.01）。
3 结论
通过对两组2型糖尿病0级糖尿病足不同治疗护理干预后，临床疗效及足背动脉血液流变学相关调查表明：实验组明显优于对照组，更有利于改善足部血液循环，缓解糖尿病足的足部症状及体征，有利于防止足溃疡的发生。
糖尿病足是糖尿病重要并发症之一，据国外的调查，约15%的糖尿病患者将发生足溃疡，80%以上的糖尿病患者截趾或截肢起因于足溃疡，因此如果能对0期糖尿病足合理治疗与及时进行护理干预，预防足溃疡的发生，将减少患者痛苦，减轻社会负担，这正是中医“不治已病、治未病”理念的最好体现。糖尿病足的发病机制涉及神经病变、血管病变和感染，而血液循环障碍是糖尿病足发病的基础。因而在基础治疗之上，采用中医特色的治疗方法，抓住血循环障碍这一病理过程，通过活血化癖药物穴位注射达到改善血循环，消除诱发因素，从而干预0级糖尿病足的恶化，防止足溃疡发生。
本研究结果显示，对2型糖尿病0级糖尿病足采用勒马回注射液在足三里、三阴交穴位注射，可促使0级糖尿病足症状缓解，预防足溃疡的发生，患者无不良反应，是一种安全、有效、简单易行的0级糖尿病足干预措施。
实施例7：勒马回注射液对大鼠糖尿病肾病的治疗作用研究
1 材料与方法
1.1 动物、药品、试剂及仪器
清洁级Wistar大鼠45只，购自黑龙江中医药大学实验动物中心。
勒马回注射液：勒马回注射液由活性药物和药物辅料组成，活性药物为勒马回提取液，占勒马回注射液总体积的5%，药物辅料为氯化钠、丙三醇、甘油、水，该勒马回注射液的制备方法，步骤如下：
（1）将干燥的勒马回100g，加入5倍量浓度为75%的乙醇水溶液中，升温至85℃，加热回流1.5 h后冷却过滤，得到提取液和药渣，对药渣重复上述操作2次，合并3次所得药液，然后工艺条件为-0.05～-0.09MPa、40～90℃的条件下减压蒸馏，得到醇提物；
（2）在醇提物中加入蒸馏水，混合均匀后，静置4 h后，过滤，取上清液，再用3000～6000道尔顿的二醋酸纤维素超滤膜过滤，滤液浓缩，得到相对密度为1.15的勒马回初提取液；
（3）将勒马回初提取液经D101B型大孔吸附树脂处理，先用柱体积5倍量的pH 为3的水溶液进行洗脱，收集洗脱液，再用柱体积5倍量的50%乙醇进行洗脱，收集洗脱液，两次洗脱液合并，浓缩，得到浓缩液，然后将浓缩液用氨水调节pH至10，在60℃下加热1.5 h，再用盐酸调节pH至5，然后将其经聚酰胺树脂柱处理，用3倍的水洗脱，收集洗脱液，在80℃下对洗脱液进行蒸馏，除去乙醇至无醇味，再调节pH至7，得到勒马回提取液；
（4）在勒马回提取液中加入氯化钠和其他药物辅料搅拌混合均匀，再补充注射用水至1000mL，调整pH值6.5～8.0，垂熔玻璃漏斗滤过，然后冲氮气灌封于2mL安瓿中，密封，用100℃的流通蒸汽灭菌30分钟，即得勒马回注射液。
羊抗鼠CTGF单隆抗体，购自美国CellSignaling公司；羊抗鼠β-actin抗体，购自Sigma公司；链脲佐菌素，购自Sigma公司。台式微型离心机（Mierofuge18），购自Bechman Coulter公司；涡旋振荡器（Vortex-GenieZ），购自美国Scilnd公司；全自动生化分析仪，购自美国贝克曼库尔特公司。
1.2 大鼠分组、模型制作及给药
将45只清洁级Wistar大鼠随机分为正常组、对照组和实验组，各15只。对照组和实验组予以链脲佐菌素55mg/kg腹腔内注射建立糖尿病肾病大鼠模型，正常组给予同等剂量的生理盐水腹腔注射。建模成功后，实验组大鼠予以勒马回注射液300mg/kg腹腔内注射，1次/d；正常组及对照组给予同等剂量的生理盐水腹腔内注射，1次/d。三组大鼠自由饮水进食，不给予任何降糖处理。
1.3 血糖、24小时尿蛋白、血清肌酐和尿素氮检测
三组大鼠注射前（治疗前）及注射12周时（治疗后）分别检测其血糖、24小时尿蛋白、血清肌酐和尿素氮。
1.4 统计学方法
采用Stata 10.0统计软件。计量资料用±s表示，三组比较采用方差分析，组间两两比较采用t检验，相关性分析用Pearson相关分析法。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1治疗前后三组大鼠血糖、24小时尿蛋白、血清肌酐和尿素氮水平比较
治疗前实验组和对照组大鼠24小时尿蛋白、血清肌酐和尿素氮水平高于正常组（P均＜0.05）；治疗后实验组大鼠24小时尿蛋白、血清肌酐和尿素氮较治疗前没有明显降低（P均＞0.05）。详见表8。
表8 三组大鼠治疗前后血糖、24小时尿蛋白、血清肌酐和尿素氮水平比较（±s）
3 讨论与结论
勒马回注射液12 周后，其24 小时尿蛋白、血清肌酐和尿素氮水平均未明显降低，且均未低于对照组治疗后，说明勒马回注射液不能降低糖尿病大鼠蛋白尿，对大鼠肾功能没有保护作用，不能治疗糖尿病肾病。
实施例8：勒马回注射液治疗失眠的实验研究
1 实验材料
药品：
勒马回注射液：勒马回注射液：勒马回注射液由活性药物和药物辅料组成，活性药物为勒马回提取液，占勒马回注射液总体积的5%，药物辅料为氯化钠、丙三醇、甘油、水，该勒马回注射液的制备方法，步骤如下：
（1）将干燥的勒马回100g，加入5倍量浓度为75%的乙醇水溶液中，升温至85℃，加热回流1.5 h后冷却过滤，得到提取液和药渣，对药渣重复上述操作2次，合并3次所得药液，然后工艺条件为-0.05～-0.09MPa、40～90℃的条件下减压蒸馏，得到醇提物；
（2）在醇提物中加入蒸馏水，混合均匀后，静置4 h后，过滤，取上清液，再用3000～6000道尔顿的二醋酸纤维素超滤膜过滤，滤液浓缩，得到相对密度为1.15的勒马回初提取液；
（3）将勒马回初提取液经D101B型大孔吸附树脂处理，先用柱体积5倍量的pH 为3的水溶液进行洗脱，收集洗脱液，再用柱体积5倍量的50%乙醇进行洗脱，收集洗脱液，两次洗脱液合并，浓缩，得到浓缩液，然后将浓缩液用氨水调节pH至10，在60℃下加热1.5 h，再用盐酸调节pH至5，然后将其经聚酰胺树脂柱处理，用3倍的水洗脱，收集洗脱液，在80℃下对洗脱液进行蒸馏，除去乙醇至无醇味，再调节pH至7，得到勒马回提取液；
（4）在勒马回提取液中加入氯化钠和其他药物辅料搅拌混合均匀，再补充注射用水至1000mL，调整pH值6.5～8.0，垂熔玻璃漏斗滤过，然后冲氮气灌封于2mL安瓿中，密封，用100℃的流通蒸汽灭菌30分钟，即得勒马回注射液。
戊巴比妥钠：北京大田丰拓化学技术有限公司生产；
硝酸士的宁注射液：北京双鹤药业股份有限公司生产；
安定注射液：天津金耀氨基酸有限公司生产；
动物：昆明种小鼠，体重18g～22g，雌性兼用，由黑龙江中医药大学实验中心提供。
2 实验方法与结果
2.1 对小鼠自发活动的研究
小鼠30只，雌雄不拘，随机分为3组，即生理盐水对照组、勒马回注射液组，安定阳性对照组，每组10只。
给药前把小鼠投入动物活动箱中适应5分钟后，记录2分钟的动物走动时间和前肢向上抬举次数的数值作为正常值。
然后分别给予：
勒马回注射液组：予以注射勒马回注射液1mL，腹腔注射。
安定阳性对照组：予以注射安定注射液1mL，腹腔注射；
生理盐水对照组：予以注射同体积的0.9%氯化钠注射液，腹腔注射。
各组小鼠于给药后60分钟，按同法测定小鼠走动时间及双前肢向上抬举次数。结果以±S表示，结果见表9。
表9 对小鼠自发活动次数的影响（±S， n= 10）
注：与生理盐水对照组比较，* P < 0.01；与安定组比较：# P > 0.05；
表中结果显示：勒马回注射液对小鼠均有明显的镇静作用，与生理盐水对照组比较有显著差异（P < 0.01）。勒马回注射液组镇静作用明显，与安定组比较无差异（P> 0.05）。结果表明：勒马回注射液有明显的镇静作用。
2.2 对小鼠睡眠影响的研究
2.2.1 对小鼠戊巴比妥钠睡眠时间的影响
小鼠30只，雌雄不拘，随机分为3组，即生理盐水对照组、勒马回注射液组，安定阳性对照组，每组10只。
然后分别给予：
勒马回注射液组：予以注射勒马回注射液1mL，腹腔注射；
安定阳性对照组：予以注射安定注射液1mL，腹腔注射；
生理盐水对照组：予以注射同体积的0.9%氯化钠注射液，腹腔注射。
给药60分钟后，每组小鼠分别给予戊巴比妥钠40mg/kg，腹腔注射。记录小鼠的睡眠时间（以翻正反射消失为入睡时间，从翻正反射消失至恢复时间为睡眠持续时间）。结果见表10。
表10 对小鼠戊巴比妥钠睡眠时间的影响（±S， n= 10）
2.2.2 对小鼠戊巴比妥钠阈下剂量的影响
小鼠30只，雌雄不拘，随机分为3组，即生理盐水对照组、勒马回注射液组，安定阳性对照组，每组10只。
然后分别给予：
勒马回注射液组：予以注射勒马回注射液1mL，腹腔注射；
安定阳性对照组：予以注射安定注射液1mL，腹腔注射；
生理盐水对照组：予以注射同体积的0.9%氯化钠注射液，腹腔注射。
给药30分钟后，各组小鼠分别给予戊巴比妥钠30mg/kg，腹腔注射，观察并记录入睡动物数（15分钟内小鼠翻正反射消失达1分钟上的鼠数作为入睡动物数），计算入睡率。结果见表11。
表11 对小鼠戊巴比妥钠阈下催眠剂量的影响
以上两实验均说明了勒马回注射液对小鼠均有明显的催眠作用，与生理盐水对照组比较有显著差异（P < 0.01）。勒马回注射液组具有明显的催眠作用。
2.3 抗硝酸士的宁惊厥发作作用的研究
小鼠30只，雌雄不拘，随机分为3组，即生理盐水对照组、勒马回注射液组，安定阳性对照组，每组10只。
然后分别给予：
勒马回注射液组：予以注射勒马回注射液1mL，腹腔注射。
安定阳性对照组：予以注射安定注射液1mL，腹腔注射；
生理盐水对照组：予以注射同体积的0.9%氯化钠注射液，腹腔注射。
各组小鼠于给药60分钟后，分别给予硝酸士的宁注射液1.5mg /kg，皮下注射，记录小鼠惊厥数（以小鼠出现全身强直性惊厥为指标）。结果见表12。
表12 抗硝酸士的宁惊厥发作的作用（n= 10）
注：与生理盐水对照组比较：*P < 0.01；与安定组比较：※P > 0.05
结果表明，安定组与勒马回注射液组均有对抗硝酸士的宁惊厥发作的作用，各组与生理盐水对照组比较，经统计学处理差异均有显著意义。且发现勒马回注射液的抗惊厥作用最强，疗效最好，说明勒马回注射液有抗惊厥的作用。
3 结论
本研究发现，勒马回注射液能抑制小鼠自发活动；对小鼠睡眠的影响与戊巴比妥钠有协同作用；有对抗硝酸士的宁惊厥发作的作用。说明勒马回注射液有明显的镇静、催眠、抗惊厥作用，具有开发治疗失眠药物的前景。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明。