一种多房棘球蚴亚单位疫苗LTB-Emy162的设计、制备方法和应用与流程

本发明属于生物医药
技术领域：
，具体涉及一种多房棘球蚴疫苗的设计、制备方法和相关应用。
背景技术：
：多房棘球蚴病又称泡型包虫病，该病是—种严重的人畜共患的疾病，我国包虫病高发流行区主要集中在牧区及半农半牧区，青海、甘肃和四川北部等地较为严重，青海更是泡型包虫病肆虐的重灾区。泡球蚴在早期寄生于中间宿主肝内，致局部肝组织病变、增生、肝纤维化、萎缩、变性和坏死，而临床症状不明显；晚期似肝癌样转移能转移至肺、脑、乳腺等脏器，即使进行肝部分或半叶切除治疗，术后复发率也很高，故临床有“虫癌”之称。据统计未经治疗的ae患者10年病死率高达94%。ae是棘球蚴病的特殊类型，是青海省三江源地区的特色地方病，具有发病范围广、恶性程度高、预后效果差的特点，广大人民群众饱受多房棘球蚴的危害，被列为重点防治寄生虫病之一。棘球蚴可寄生于人、畜的任何部位，因为体积大、生命力强，不但使周围组织受到高压力而萎缩，也易产生继发性感染，如果蚴体破裂，后果尤为严重。目前，ae治疗以外科手术为主，药物治疗为辅，但手术对人体损伤大且复发率高，服用阿苯达唑和甲苯咪唑会产生严重的不良反应。近来发明的亚单位疫苗相对于其他疫苗具有安全性高、产量高、纯度高、稳定性好等优点，但与传统疫苗相比免疫效果差，需要特殊的结构设计、特殊的递送系统或佐剂来提高其免疫原性。因此，目前没有效果理想的药物及疫苗可以用于临床预防和治疗泡型包虫病。技术实现要素：本发明的第一个目的在于提供一种针对多房棘球蚴的亚单位疫苗。本发明的第二个目的在于提供一种多房棘球蚴亚单位疫苗的制备方法。本发明的第三个目的在于提供多房棘球蚴亚单位疫苗的用途。为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：一种多房棘球蚴亚单位疫苗ltb-emy162，该多房棘球蚴亚单位疫苗主要由大肠杆菌不耐热性肠毒素（ltb）和emy162构成，多房棘球蚴亚单位疫苗ltb-emy162的整体氨基酸序列如序列1所示，emy162的氨基酸序列如列3所示；多房棘球蚴亚单位疫苗ltb-emy162的核苷酸序列如序列2所示，多房棘球蚴抗原蛋白emy162的核苷酸序列如序列4所示，还包括核苷酸序列的表达载体、转基因细胞系及宿主菌。大肠杆菌不耐热毒素b亚基（ltb）和多房棘球蚴抗原蛋白emy162之间的间隔序列为dprvpss。本发明的第二个目的是提供多房棘球蚴亚单位疫苗的制备方法，其技术路线详述如下：（1）新型多房棘球蚴亚单位疫苗抗原分子的结构设计：多房棘球蚴抗原蛋白emy162与黏膜免疫佐剂大肠杆菌不耐热性肠毒素（ltb）相偶联设计出一个科学合理、结构新颖的多房棘球蚴亚单位疫苗ltb-emy162。（2）重组表达质粒pczn1-ltb-emy162（含有融合基因ltb-emy162）的构建：采用基于pas(pcr-basedaccuratesynthesis)的方法合成基因ltb-emy162，通过双酶切连接至pczn1载体的ndei和xbai之间，获得的重组质粒pczn1-ltb-emy162。（3）融合蛋白ltb-emy162的原核表达及纯化：将重组表达载体pczn1-ltb-emy162转化进大肠杆菌arcticexpress中，构建重组基因工程菌株arcticexpress/pczn1-ltb-emy162。利用iptg诱导表达，并通过ni-ida镍离子亲和层析获得电泳纯度的融合蛋白ltb-emy162，即为多房棘球蚴亚单位疫苗ltb-emy162。本发明第三个目的是提供多房棘球蚴亚单位疫苗ltb-emy162的用途。多房棘球蚴亚单位疫苗ltb-emy162可用于预防和治疗多房棘球蚴感染相关性疾病。本发明公开的多房棘球蚴亚单位疫苗ltb-emy162具有以下优点：（1）emy162是多房棘球蚴表面抗原，被公认为是多房棘球蚴疫苗的理想候选抗原能够取得良好的保护作用。（2）多房棘球蚴亚单位疫苗ltb-emy162将emy162抗原蛋白和黏膜免疫佐剂ltb科学合理地整合在一起，可激发针对多房棘球蚴抗原emy162的t细胞免疫应答和特异性体液免疫应答。（3）多房棘球蚴亚单位基因工程疫苗ltb-emy162，安全性高、产量高、纯度高、稳定性强。（4）ltb-emy162具有较强的免疫原性，能够诱发针对多房棘球蚴抗原蛋白emy162及总蛋白高滴度的特异性抗体产生。本发明选用亚单位疫苗，亚单位疫苗相对于其他疫苗的安全性高、产量高、纯度高、稳定性好，但免疫效果较差，需要特殊的结构设计、特殊的递送系统或佐剂来提高其免疫原性，所以采用了ltb作为分子内佐剂来提高其免疫原性。研究发现emy162具有很强的免疫作用，并稳定表达于棘球蚴生命周期的各阶段（原头结、培养的棘球蚴、未成熟成虫与成熟成虫），在棘球蚴的粘附及运动生理学中发挥重要的作用。本发明通过采用分子克隆技术通过对抗原表位的连接顺序、间隔序列和多重拷贝数的分析设计泡型包虫亚单位疫苗；并经原核系统表达并纯化获得重组蛋白ltb-emy162；继而将亚单位疫苗ltb-emy162免疫小鼠后经elisa、小鼠脾淋巴细胞增殖实验、gm1特异性elisa等技术考察亚单位疫苗ltb-emy162的免疫原性及生物活性。附图说明图1：多房棘球蚴亚单位疫苗ltb-emy162的分子结构设计特点；图2：重组表达载体pczn1-ltb-emy162的双酶切鉴定，泳道m：dnamarker；泳道1：pczn1-ltb-emy162酶切前质粒；泳道2：pczn1-ltb-emy162/ndei+xbai；图3：重组表达载体pczn1-ltb-emy162载体构建图谱；图4：多房棘球蚴多表位肽融合蛋白ltb-emy162的原核表达，泳道m：蛋白质marker；泳道1：未加iptg诱导菌液蛋白；泳道2：加iptg诱导后菌液蛋白；泳道3：加入0.5mmiptg37℃诱导后菌液离心后上清；泳道4：加入0.5mmiptg37℃诱导菌液离心后沉淀；图5：多房棘球蚴多表位肽融合蛋白ltb-emy162的ni-ida亲和层析纯化，泳道m：蛋白质marker；泳道1：ltb-emy162未纯化蛋白；泳道2：20mm咪唑洗脱的杂蛋白和部分目的蛋白；泳道3：纯化后的ltb-emy162蛋白样品；图6：多房棘球蚴亚单位疫苗ltb-emy162诱发抗emy162igg抗体的检测，多房棘球蚴亚单位疫苗ltb-emy162能诱发产生一定滴度抗emy162的igg抗体，并具有较高的抗体效价，而rltb不能引起抗emy162的igg抗体；图7：多房棘球蚴亚单位疫苗ltb-emy162诱发抗多房棘球蚴总蛋白igg抗体的检测；多房棘球蚴亚单位疫苗ltb-emy162能够产生一定滴度抗多房棘球蚴总蛋白的igg抗体；图8：多房棘球蚴亚单位疫苗ltb-emy162致敏小鼠脾脏淋巴细胞对抗原刺激的增殖反应；图9：多房棘球蚴亚单位疫苗ltb-emy162免疫特异性的免疫印迹（westernblot）鉴定；图10：多房棘球蚴亚单位疫苗ltb-emy162与神经节苷脂gm1的结合活性检测。具体实施方式材料：1、iptg溶液：称取1.2giptg置于50ml离心管中，加入40ml无菌水，充分混匀溶解后，定容至50ml，用0.22μm滤器过滤除菌，小份分装，-20℃保存。2、氨苄青霉素（amp）贮液（100mg/ml）：称取100mg氨苄青霉素（amp）溶于1ml无菌水，制得浓度为100mg/ml的贮存液，通过0.22µm细菌滤器过滤除菌，溶液分装保存于-20℃冰箱中。3、培养基：（1）lb液体培养基：称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和5gnacl，加蒸馏水至1000ml，调整ph至7.4，高压蒸气灭菌。（2）lb固体培养基：1.5g琼脂粉/100mllb培养液，高压灭菌后，倾倒平板。4、dna电泳缓冲液（50xtae）：称取242gtris、37.2gna2edta·2h2o和57.1ml冰乙酸，加水至1000ml，使用时稀释50倍。5、sds-page电泳缓冲液（5x）：称取tris粉末15.1g、甘氨酸94g、sds5.0g；加入约800ml的去离子水，搅拌溶解；加去离子水定容至1l，室温保存；注意：加水时应让水延着壁缓缓流下，以避免由于sds的原因产生很多泡沫。6、考马斯亮蓝蛋白染色试剂：（1）考马斯亮蓝g-250染液（蛋白质定量用）：考马斯亮蓝g-250100mg溶解在50ml95%乙醇中，然后加入86%磷酸100ml，用蒸馏水稀释至1000ml。（2）脱色液：250ml乙醇、80ml冰醋酸用蒸馏水稀释至1000ml。8、实验动物：balb/c小鼠：为spf级，雄性，6～8周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：scxk（京）2012-0001。9、elisa试剂：（1）包被液：1.6gna2co3，2.9gnahco3，0.2gnan3，加双蒸水至1l，调ph值至9.6。（2）洗涤液：分别称取0.2gkh2po4，2.9gna2hpo4∙12h2o，8.0gnacl，0.2gkcl，0.5mltween-20，加入ddh2o定容至1000ml（pbst）。（3）封闭液：称取3.0gbsa溶解于100ml洗涤缓冲液中，过滤除菌后4℃保存。（4）底物液：可溶性单组份tmb底物溶液。（5）终止液：量取蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸21.7ml（1mh2so4）。10、淋巴细胞增殖实验主要试剂（1）小鼠脾脏淋巴细胞分离液（购于cedarlane公司，cl5031）（2）rpmi-1640完全培养液：在rpmi-1640基础培养液加入10%胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素。（3）rpmi-1640不完全培养液：称取10.4grpmi-1640干粉、2.4ghepes、0.75gnahco3，加去离子水至1000ml，ph7.4，超滤除菌，分装。实施例1：多房棘球蚴亚单位疫苗ltb-emy162的分子结构设计在多房棘球蚴亚单位疫苗的设计中，本发明选择emy162抗原，将大肠杆菌不耐热肠毒素b亚基（ltb）作为分子内免疫佐剂，融合在emy162的n端，增强emy162的免疫原性。结果：多房棘球蚴亚单位疫苗ltb-emy162的分子结构设计特点和思路如图1所示。实施例2：重组表达载体pczn1-ltb-emy162（含有融合基因ltb-emy162）的构建将前期设计的多表位肽ltb-emy162的氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏爱性原则转化成相应的核苷酸序列，采用基于pas(pcr-basedaccuratesynthesis)的方法，设计全长拼接引物，在引物的两端各设计了保护性碱基合成基因ltb-emy162，通过克隆位点ndei和xbai连入表达载体pczn1。结果：利用ndei和xbai双酶切待检重组质粒pczn1-ltb-emy162，37℃反应2h，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，发现双酶切的dna片段约为750bp，与融合基因ltb-emy162的理论大小一致，如图2所示。重组表达载体pczn1-ltb-emy162的载体构建图谱如图3所示。将获得的重组质粒pczn1-ltb-emy162转入top10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序，测序结果与预期序列完全一致，且无移码突变。实施例3：多表位肽融合蛋白ltb-emy162的原核表达将验证正确的重组表达质粒pczn1-ltb-emy162转入到大肠杆菌arcticexpress菌株中。在预先制备好的含50μg/mlamp的lb平板上，接种环划线基因工程菌株pczn1-ltb-emy162/arcticexpress，倒置于37℃培养箱，过夜培养后，挑取单个菌落，接种于含50µg/mlamp的lb培养基中，37℃，220rpm，培养过夜。以2%接种量分别接种重组菌于含50µg/mlamplb培养基中，37℃，220rpm，培养至至菌体od600为0.6-0.8(约2h)，加入iptg使终浓度达到1mmol/l，37℃，220rpm诱导表达4h，以未加iptg诱导的载体菌pczn1-ltb-emy162/arcticexpress作为阴性对照。结果：与对照菌株对比，基因工程重组菌株pczn1-ltb-emy162/arcticexpress在约29kd处出现目的蛋白条带，与多表位肽融合蛋白ltb-emy162的理论大小相符合图4，多表位肽融合蛋白ltb-emy162在包涵体蛋白中存在。实施例4：多表位肽融合蛋白ltb-emy162的纯化（1）包涵体蛋白的变复性将菌体沉淀重悬于20mllysisbuffer(20mmtris-hclcontaining1mmpmsfandbacteriaproteaseinhibitorcocktail,ph8.0)，超声破碎(功率400w，工作4sec，间歇8sec，共20min)；将超声破碎的细胞裂解液4℃10000g离心20min，收集沉淀；使用包涵体洗涤液(20mmtris，1mmedta，2m尿素，1mnacl，1％tritonx-100，ph8.0)洗涤包涵体3次；用溶解缓冲液(20mmtris，5mmdtt，8m尿素ph8.0)，按一定比例溶解包涵体，4℃放置过夜；室温，15000rpm离心15min；将上述溶液滴加20mmtris-hcl5mmedtabufferph7.8缓冲液中，逐步成倍梯度稀释缓慢搅拌，将蛋白溶液装入透析袋于pbsph7.4溶液中透析过夜。（2）ni-ida镍离子亲和层析柱的纯化利用低压层析系统，蛋白溶液以0.5ml/min流速上样至ni-idabinding-buffer预平衡的ni-ida-sepharosecl-6b亲和层析柱；用ni-idabinding-buffer以0.5ml/min流速冲洗，至流出液od280值到达基线；用ni-idawashing-buffer(20mmtris-hcl，20mm咪唑，0.15mnacl，ph8.0)以1ml/min流速冲洗，至流出液od280值到达基线；用ni-idaelution-buffer(20mmtris-hcl，250mm咪唑，0.15mnacl，ph8.0)以1ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用pbs（ph7.4）进行透析过夜。结果：经ni-ida镍离子亲和层析柱的纯化后，收集各个蛋白峰进行sds-page分析，可以发现目的蛋白集中在250mm咪唑洗脱产生的蛋白峰。通过凝胶成像检测仪分析在250mm咪唑洗脱的目的蛋白纯度可达电泳纯，如图5所示。实施例5：亚单位疫苗ltb-emy162的免疫原性和免疫特异性研究（1）balb/c小鼠的免疫实验分组：将spf级balb/c小鼠随机分为3组，分别为多表位融合蛋白ltb-emy162免疫组、重组霍乱毒素b亚基（rltb）免疫组和pbs免疫组。每组6只balb/c小鼠，共18只，详细分组如下图所示：表1：spf级balb/c小鼠分组及免疫方案实验组数目免疫方式免疫次数免疫剂量免疫佐剂ltb-emy1626腹腔注射3次50μg/只弗氏佐剂rltb6腹腔注射3次50μg/只弗氏佐剂pbs6腹腔注射3次50μg/只弗氏佐剂免疫方式：用75%酒精对小鼠腹部消毒，然后腹部多点皮下注射表位融合蛋白ltb-emy162和弗氏完全佐剂的混合乳化剂；每隔一周加强免疫一次，第2、3周加弗氏不完全佐剂，第4周直接注射表位融合蛋白溶液加强免疫。抗血清的采集：在末次免疫后第五天，摘小鼠眼球采血，收集血液，放置待血清完全分离，3000rpm离心5分钟分装血清，－80℃冻存备用。（2）抗血清中特异性抗体的elisa检测将抗原（emy162和多房棘球蚴总蛋白）分别用包被液稀释成10μg/ml，100μl/孔包被elisa板，4℃过夜。用洗涤液洗4次后，每孔加入300μl封闭液，37℃封闭2h。用洗涤液洗4次后，将抗血清（鼠抗ltb-emy162抗血清和鼠抗rltb抗血清）和小鼠阴性血清倍比稀释后加入elisa板，100μl/孔，在37℃下孵育60min。用洗涤液洗4次后，加入hrp标记的羊抗鼠igg（1:10000），100μl/孔，在37℃下孵育1h。用洗涤液洗4次后，加入100μl/孔tmb底物显色液，室温避光反应10min，加50μl终止液终止反应。用酶标仪测定各孔od450值。结果：emy162的包被浓度为10μg/ml，通过elisa检测，多房棘球蚴亚单位疫苗ltb-emy162能够产生针对emy162的特异性igg抗体，而rltb免疫组不能产生抗emy162抗体，如图6；多房棘球蚴总蛋白的包被浓度为10μg/ml，通过elisa检测，亚单位疫苗ltb-emy162能够产生抗多房棘球蚴总蛋白的抗体，而pbs免疫组不能产生抗多房棘球蚴总蛋白的特异性igg抗体，如图7。（3）小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验将经抗原免疫的小鼠脱臼处死，泡75%酒精5min后，移入超净工作台。用剪刀小心剪开小鼠的腹部外皮，再剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠脾脏（暗红色）。在小平皿中放入2-3mllympholyte®-m淋巴细胞分离液；用镊子固定尼龙网，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中；把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约1ml的1640培养基；1000g-1500g离心20min。离心结束后淋巴细胞会在1640培养基下层悬浮。用含10%小牛血清的rpmi-1640培养基制备成一定浓度的细胞悬液（5x105/ml）。在96孔平底培养板中，每孔加入100μl细胞，同时加入ltb-emy162和emy162各20μg/ml、emy162抗原表位肽（emy16236-48和emy1627-13）、tsp3抗原表位肽（tsp333-42和tsp380-90）和生理盐水各100μl，终体积为200μl/孔，每组做3个平行孔。将加好的96孔平底培养板放置37℃5%co2培养箱中培养60h后，向各孔中加入mts溶液40μl，继续培养2h后用酶标仪读取od570值。刺激指数（si）≥2时，判断为阳性；刺激指数计算公式如下：结果：亚单位疫苗ltb-emy162致敏过的小鼠脾脏淋巴细胞经ltb-emy162、emy162、emy162抗原表位肽（emy16236-48和emy1627-13）刺激均能够发生明显的淋巴细胞增殖反应，而pbs免疫组的小鼠脾脏淋巴细胞接受上述抗原刺激时均未发生淋巴细胞增殖反应，说明多房棘球蚴亚单位疫苗ltb-emy162中emy162抗原表位肽均保持有其免疫学特性，能够刺激机体产生针对各自th抗原表位的细胞免疫应答，如图8。（4）蛋白免疫印迹（westernblot）取蛋白样品ltb-emy162进行15%sds-page电泳。用半干式电转移法将凝胶上的蛋白质转移到pvdf膜上，恒流1ma/cm2，2h；将pvdf膜洗净后用10%脱脂牛奶封闭液28℃摇床封闭2h；pbst洗膜3次，每次10min。分别加入按1:2500倍数稀释好的抗血清（鼠抗ltb-emy162血清），4℃过夜；第二天用pbst洗膜3次，每次10min。加入按1:10000倍数稀释好的二抗（hrp酶标羊抗鼠igg），28℃摇床孵育1h；用pbst洗膜3次，每次10min。在暗室(允许红色光源)中，将pvdf膜蛋白面朝上，放在保鲜膜上，吸水纸吸掉多余的pbst溶液，向膜上均匀滴加事先混合好的ecl发光液，反应1min；将pdvf膜包裹在保鲜膜中，剪下一块等大的x光胶片（胶片也作剪角处理以区分条带顺序），放置夹片盒曝光0.5~30min；取出x光胶片，在显影剂中漂至条带出现，放到停影液（1.5%冰醋酸）中停影1min，用流水冲洗1min后在定影剂中漂至背景部分透明，最后流水冲洗20min固定影像。结果：鼠抗ltb-emy162血清能够与纯化的ltb-emy162蛋白发生结合反应，说明多房棘球蚴亚单位疫苗ltb-emy162，能够激发机体产生针对ltb-emy162的高特异性抗体，如图9。实施例5：gm1-elisa检测亚单位疫苗ltb-emy162中ltb组分的分子免疫佐剂活性将神经节苷脂gm1或者牛血清白蛋白（bsa）用包被液稀释至10μg/ml，100μl/孔，包被elisa板，4℃过夜。用pbst洗涤4次；每孔加入300μl封闭液，37℃封闭2h；用洗涤液pbst洗4次后，4℃保存。将多表位肽融合蛋白ltb-emy162和重组霍乱毒素b亚基（rltb）按照一定比例稀释（100μg/ml到0.78μg/ml），加入100μl/孔，37℃放置60min。用洗涤液pbst洗4次，加入鼠抗ltb多克隆抗体（1:1000），100μl/孔，37℃温育60min。洗涤4次；加入hrp标记羊抗鼠igg（1:10000），100μl/孔，37℃放置30min。洗涤4次后，加入100μl/孔tmb底物显色液，37℃孵育10min，50μl终止液终止反应。用酶标仪检测各孔od450值。结果：通过gm1-elisa检测多表位肽融合蛋白ltb-emy162和rltb是否具有形成五聚体和神经节苷脂gm1结合的活性。多表位肽融合蛋白ltb-emy162和rltb的od450都显著高于阴性对照组（包被bsa），证明多表位肽融合蛋白ltb-emy162和rltb均具有形成五聚体和神经节苷脂gm1结合的活性，也说明新型亚单位疫苗ltb-emy162和rltb组分具有较好的分子免疫佐剂活性，如图10。序列表序列1<110>青海大学<120>一种多房棘球蚴亚单位ltb-emy162的设计、制备方法和应用<130>1<160>4<170>patentinversion3.3<210>1<211>250<212>prt<213>人工序列<400>1metthralaproglnthrilethrgluleucysserglutyrargasn151015thrglniletyrthrileasnasplysileleusertyrthrgluser202530metalaglylysargglumetvalileilethrphelysserglyglu354045thrpheglnvalgluvalproglyserglnhisileaspserglnlys505560lysalailegluargmetlysaspthrleuargilethrtyrleuthr65707580gluthrlysileasplysleucysvaltrpasnasnlysthrproasn859095serilealaalailesermetgluasnaspproargvalproserser100105110metglugluvalglyvalaspprogluleuilealalysleuthrlys115120125lysleuglnthrthrleuprogluhispheargtrpilehisvalgly130135140serargserleugluleuglytrpasnalathrglyleualaasnleu145150155160hisalaasphisilelysleuthralaasnleutyrthrthrtyrval165170175serpheargtyrargasnvalproilegluargglnlysleuthrleu180185190gluglyleulysproserthrphetyrgluvalvalvalglnalaleu195200205lysglyaspsergluvaltyrlystyrthrglypheileargthrleu210215220alaproglygluaspglyalaaspargalaglyglyphealaleuile225230235240phealametalaglyleuleuleuleuthr245250序列2<210>2<211>750<212>dna<213>人工序列<400>2atgacagcacctcagacgattaccgaattgtgtagcgaatatcgcaatacccagatctat60actatcaatgacaaaattctcagctacac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