一种EV71-VP1手足口病多肽疫苗及其制备方法与应用与流程

本发明属于免疫生物医学领域，具体涉及一种ev71-vp1手足口病多肽疫苗及其制备方法与应用。

背景技术：

肠道病毒71型（ev71）是引起婴幼儿手足口病的主要病原体之一，目前，尚无针对ev71的抗病毒药物，主要是对症治疗。在抗病毒药物的研究方面，体外实验证明吡啶基咪唑啉二酮衍生物可有效的抑制ev71的复制，是目前较为有前景的候选药物。ev71病毒的全病毒灭活疫苗以全病毒作为抗原，但从安全角度考虑，尤其是在免疫力较差的个体中，可能产生对人体有害作用，因此，近年来亚单位疫苗成为研究的焦点。

多肽疫苗是用化学合成法或基因工程手段合成病原微生物的保护性多肽或表位并将其连接到大分子载体上，再加入佐剂制成的疫苗。相对于常规疫苗和基因重组疫苗，多肽/表位疫苗不含有对动物构成潜在威胁的病毒基因组信息，不存在发生病毒基因与宿主细胞基因的整合或重组，不会对动物或人类构成潜在的威胁，是一种安全的疫苗。大量的研究表明，ev71受感人群及动物免疫实验产生的中和抗体具有抗ev71病毒作用，且能够形成一定的保护效果，体外实验证实产生的中和抗体具有病毒中和活性。目前在研究的ev71疫苗大多是病毒灭活疫苗，刚进入i期临床试验阶段。亚单位疫苗在安全性上明显优于传统疫苗，寻找有效的抗原蛋白是基因工程重组疫苗成功的关键。vp1是研究最多的衣壳蛋白，被认为是ev71中和抗原决定簇最为集中的区域。

本发明将人手足口病病毒分离，全基因组测序分析，得到的ev71病毒vp1结构蛋白，将其氨基酸分成20组，每组15个氨基酸加上上游的5个氨基酸，每组为20个氨基酸的多肽，最后一组为12个氨基酸，通过化学合成这些多肽片段。收集病愈2-3个月的健康患儿的血清。将合成的多肽片段包被固相载体elisa96孔板，加入患儿血清孵育，洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，底物显色测定吸光度，筛选能与血清免疫结合的多肽片段。然后将筛选的多肽通过动物体内免疫及相关病理检查深入研究多肽抗原的特性。为进一步深入了解ev71四种衣壳蛋白的相关性质，为今后的多肽疫苗候选抗原的筛选提供了重要依据。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种ev71-vp1手足口病多肽疫苗及其制备方法与应用。

本发明涉及一种多肽，其氨基酸序列如序列表中seqidno.1-20中任一序列所示：

为达到本发明目的，其技术方案主要涉及如下：

首先，将人手足口病病毒分离，并对其进行全基因组测序分析，得到的ev71病毒vp1结构蛋白。将以上分离得到的vp1结构蛋白的氨基酸序列分成20组，每组15个氨基酸，加上上游的5个氨基酸，每组为20个氨基酸的多肽，最后一组为12个氨基酸，通过化学合成这些多肽片段（由吉尔生化有限公司合成），具体多肽序列见序列表中seqidno.1-20中任一序列所示。

作为优选的，收集病愈2-3个月的健康患儿的血清。

作为优选的，将合成的多肽片段包被固相载体elisa96孔板（购于上海联科生物科技有限公司），加入患儿血清孵育，洗涤后加入辣根过氧化物酶（hrp）标记的二抗igg（兔抗人，购于青岛捷世康生物科技有限公司）孵育，底物显色测定吸光度，筛选出能与血清免疫结合的多肽片段。

vp1结构蛋白分段并合成多肽与多肽免疫效果的检测，更为具体的方法如下：

分离得到的ev71病毒vp1蛋白，将其氨基酸分成20组，每组15个氨基酸，加上下游的5个氨基酸，每组分为20个氨基酸的多肽，最后一组为12个氨基酸，直接合成多肽片段（由吉尔生化有限公司合成）。

进一步检测康复患儿血清抗体浓度并优选含ev71病毒抗体浓度最高的血清作为一抗进行后续多肽抗原的筛选样本。更为具体的所述方法如下：

临床患儿血清样本采集信息分别取自：刘哲瀚、刘玥玥、吴林蔓、高俊豪、陈亦轩、周雨彤。采用人肠道病毒ev71型iggelisa试剂盒（上海雅吉生物科技有限公司）检测血清抗体浓度。

在此基础上，进一步合成多肽包被elisa板，加入一抗（刘玥玥血清样本），多肽抗原与一抗免疫反应基础上继续加入二抗igg（兔抗人），并对其免疫效果进行检测，优选出免疫效果较好的多肽作为候选抗原疫苗进行动物（小鼠）的免疫试验。

进一步优选地进行动物试验，建立免疫动物模型，通过病理检查检测多肽疫苗的体内免疫效果，进一步确认候选的多肽疫苗。

本发明的有益效果是：①首次将vp1蛋白作为靶向抗原研制抗手足口病ev71疫苗；②本发明分离得到ev71病毒，并对其进行了全基因组测序分析，成功得到的ev71病毒vp1结构蛋白。将其氨基酸分成20组，每组15个氨基酸，加上下游的5个氨基酸，每组分为20个氨基酸的多肽，最后一组为12个氨基酸，直接合成多肽片段；③本发明通过收集临床具有代表性的手足口康复患儿的血清，采用人肠道病毒ev71型iggelisa试剂盒进行检测血清抗体浓度，筛选出目标一抗；④通过体外免疫反应测定多肽的免疫效应，初步筛选出了候选多肽疫苗，进一步通过多肽免疫系列动物模型优选可被推广应用于临床预防和/或治疗手足口病的多肽疫苗；⑤为进一步深入了解ev71四种衣壳蛋白的相关性质，为今后的多肽疫苗候选抗原的筛选提供重要依据。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1（a组）：表示2号多肽组小鼠的骨骼肌、小肠和大脑病理切片图。

图2（b组）：表示4号多肽组小鼠的骨骼肌、小肠和大脑病理切片图。

图3（c组）：表示8号多肽组小鼠的骨骼肌、小肠和大脑病理切片图。

图4（d组）：表示正常子鼠组骨骼肌、小肠和大脑病理切片图。

图5（e组）：表示多肽小鼠新生鼠组（多肽免疫后分别将雌鼠2只、雄鼠1只合笼进行配种所得多肽小鼠新生鼠，不给病毒）骨骼肌、小肠和大脑病理切片图。

图6（f组）：表正常小鼠新生鼠组（给病毒）骨骼肌、小肠和大脑病理切片图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，j.萨姆布鲁克等著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1康复患儿血清抗体检测

收集临床患儿血清样本信息：刘哲瀚、刘玥玥、吴林蔓、高俊豪、陈亦轩、周雨彤。采用人肠道病毒ev71型iggelisa试剂盒检测血清抗体浓度，具体操作方法如下：

操作步骤：

1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100ul，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50ul，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100ul分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50ul，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50ul弃掉，再各取50ul分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50ul分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀后从第七、第八孔中分别取50ul加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50ul，混匀后从第九第十孔中各取50ul弃掉。（稀释后各孔加样量均为50ul，浓度分别为30ng/l，20ng/l，10ng/l，5ng/l，2.5ng/l）。

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40ul，然后再加待测样品10ul（样品最终稀释度为5倍）。将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。

5.洗涤：小心揭开封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50ul，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂a50ul，再加入显色剂b50ul，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。

10.终止：每孔加终止液50ul，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11.测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（od值）。

通过上述标准曲线，折合计算待测血清样本中的抗体浓度，参照测定结果，选取临床样本刘玥玥血清作为一抗进行后续免疫实验。

实施例2合成多肽包被elisa板及多肽免疫效果的评价与筛选

1.缓冲液配制如下：

①包被液：0.05mol/l碳酸盐缓冲液(ph9.6)

0.75g碳酸钠、1.46g碳酸氢钠、加去离子水定容至500ml。

②0.02mol/l磷酸盐缓冲液(ph7.4)

0.2g磷酸二氢钾，2.90g磷酸氢二钠，8g氯化钠，加去离子水定容到1000ml。

③抗体稀释液：0.02mol/lpbs(ph7.4)+0.2%bsa

0.2gbsa加配好的0.02mol/l磷酸盐缓冲液溶解定量至100g。

④封闭液：0.05mol/l碳酸盐缓冲液(ph9.6)+2.0%bsa

2.0gbsa加配好的0.05mol/l碳酸盐缓冲液溶解定量至100g。

⑤洗涤液：0.02mol/lpbs(ph7.4)+0.05%tween-20

将50ultween-20溶入100ml0.02mol/l磷酸盐缓冲液中，震荡混匀。

⑥显色液：tmb-过氧化氢尿素溶液

a液(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，tmb)：称取tmb20mg溶于10ml无水乙醇中，完全溶解后，加双蒸水至100ml。

b液(0.1mol/l柠檬酸-0.2mol/l磷酸氢二钠缓冲液，ph5.0-5.4)：称取na2hpo4·12h2o14.34g，柠檬酸1.87g溶于180ml双蒸水，加0.75%过氧化氢尿素1.28ml，定容至200ml，调ph至5.0-5.4。

将a液和b液按1：l混合后即成tmb-过氧化氢尿素应用液。

⑦终止液：2mol/lh2so4溶液

10ml98%浓硫酸加入60ml双蒸水中，定容至100ml，室温保存。

⑧酶标二抗：hrp标记的igg（兔抗人），应用时用抗体稀释液稀释3000倍

2.操作步骤如下：

①抗原包被

用包被液(0.05mol/l的碳酸盐缓冲液，ph9.6)把多肽稀释为0.01mg/ml，将稀释好的多肽液于每个酶标板孔中加入100ul，1-20号多肽，每条多肽4个重复孔。把酶标板置入湿盒内，于4℃包被过夜。

②洗板

弃去包被液，用洗涤液加满所有酶标孔，用纱布和卫生纸包住扣干。

③封闭

在酶联板上每孔加入250ul封闭液(ph9.6，0.05mol/l碳酸盐缓冲液含2.0%bsa)，将酶联板置于湿盒内，4℃孵育过夜。也可37℃孵育2h。

④弃去封闭液，洗涤1次同上。

⑤加一抗(刘玥玥血清样本)

将刘玥玥血清10ul加到990ul的抗体稀释液中制成1:100的抗血清(于1.5ml的ep管中操作)。给酶标板上1号多肽4个复孔，分别加100ul的1:100、1:200、1:400、1:800的血清。同样方式，给酶标板上2-20号多肽包被的孔中均加入100ul稀释抗体血清，加完后将酶连板放在湿盒内37℃孵育1h。

⑥洗涤同上。

⑦加酶标二抗

各孔加入稀释倍数为1:3000的酶标二抗（兔抗人）100ul，37℃湿盒内孵育1h。

⑧洗涤同上。

⑨显色

每孔各加a，b液50ul后将酶连板放入湿盒内避光30min左右，当阴性对照孔显蓝绿色时终止。终止时每孔加入50ul的2mol/l浓硫酸，多肽免疫效果评价结果见表1，nc表示pbs取代血清对照，kc表示空白板对照。

测定结果表明，2、4、8号多肽免疫效果较好，因此，选取2、4和8号多肽作为疫苗免疫小鼠。

实施例3体内试验进一步验证和评价多肽的免疫效果

1.免疫小鼠（中国科学院上海实验动物中心）模型构建

将得到的2号多肽，4号多肽，8号多肽分别用0.9%氯化钠溶液溶解，使之终浓度为1mg/ml，并与同体积的弗氏完全佐剂（购于罗氏制药）混合，制成多肽疫苗。balb/c小鼠（购于中国科学院上海实验动物中心）采用6-8周雌性balb/c健康小鼠12只，分为4只一组（2号多肽组，4号多肽组，8号多肽组）分别将上述多肽溶液经腹腔注射0.1ml，一周后重复免疫一次，热灭活病毒作为阳性对照，乙肝病毒表面抗原为阴性对照。免疫后分别将雌鼠2只、雄鼠1只合笼进行配种。

（1）取材

小鼠出生当天腹腔接种5×107tcid50的ev71病毒颗粒，1天后处死小鼠收获骨骼肌样本、小肠样本和大脑样本。

骨骼肌取材：用弯镊夹住新生鼠颈部，断颈处死新生鼠，剪开小鼠腿部皮肤，暴露骨骼肌进行取材，一份用4%多聚甲醛固定，用于后续检测。一份放于-80℃保存，用于后续检测。

小肠取材：打开小鼠腹腔，从消化道幽门至约1.5cm小肠处进行取材，用4%多聚甲醛固定，用于后续检测。

大脑取材：剪开新生鼠头部皮肤，剪开头骨与硬脑膜，对大脑进行取材，于-80℃保存，用于后续检测。

（2）多肽免疫效果

骨骼肌结果分析：

①d组正常子鼠和e组多肽小鼠新生鼠（不给病毒）的肌纤维形状较为一致，大小均匀，肌细胞正常；

②f组正常小鼠新生鼠（给病毒组）、a组2号多肽组、b组4号多肽组和c组8号多肽组均出现不同程度的骨骼肌炎症病理改变，尤其以f组炎症较多，部分出现肌细胞坏死、变性，炎性细胞浸润和肌纤维模糊，萎缩。

小肠组织结果分析：

①f组（给病毒后的正常小鼠新生鼠）与e（不给病毒后的正常小鼠新生鼠）组相比较，病灶较为明显；

②a（2号多肽组）、b（4号多肽组）、c（8号多肽组）组三个给药组与正常组d（正常子鼠）相比较，有一定程度的病灶，但是三组之间的差异不是太明显。

脑组织结果分析：

①f组（给病毒后的正常小鼠新生鼠）与e（不给病毒后的正常小鼠新生鼠）组相比较，病灶较为明显；

②a（2号多肽组）、b（4号多肽组）、c（8号多肽组）组三个给药组与正常组d（正常子鼠）相比较，未见明显变化，三组之间的也未见明显差异。

通过上述体内（病理切片he染色法）免疫效果的检测结果表明，2号多肽和8号多肽具有显著的免疫效果，8号多肽对模型balb/c小鼠的小肠、骨骼肌和大脑均具有较高的免疫效果，2号多肽对模型balb/c小鼠的骨骼肌具有较高的免疫效果，而4号多肽的免疫效果明显，因此，本发明证实2号和8号多肽可被作为今后ev71病毒多肽疫苗的候选抗原。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

<110>重庆高圣生物医药有限责任公司

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