一种治疗脊髓损伤肌肉萎缩的药物及其使用方法与流程

本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种治疗脊髓损伤肌肉萎缩的药物及其使用方法。

背景技术：

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是一种严重的中枢系统疾患，导致不可逆的运动及感觉功能障碍。脊髓损伤导致的肌肉萎缩，是临床常见脊髓损伤后并发症，将会导致运动功能进一步丧失，影响康复治疗，降低恢复机会，增加卧床时间以及其他并发症发生概率。目前针对脊髓损伤后肌肉萎缩的治疗主要局限在恢复晚期的康复治疗，此时肌肉中的基因表达和蛋白表型往往已经发生改变，另外已经萎缩的肌肉往往进一步影响患者的康复进程，产生恶性循环，因此，找到一种早期可以在分子水平维持肌肉状态的药物是一种具有临床应用前景的修复策略，以往研究发现，血管紧张素II受体阻断剂能够缓解马凡综合征和杜氏肌营养不良以及由于废用导致的肌肉萎缩，因此本研究探讨血管紧张素II受体阻断剂能否缓解脊髓损伤导致的骨骼肌萎缩，以及探索其可能的作用机制。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种治疗脊髓损伤肌肉萎缩的药物及其使用方法，旨在解决血管紧张素II受体阻断剂能否缓解脊髓损伤导致的骨骼肌萎缩的问题。

本发明是这样实现的，一种治疗脊髓损伤肌肉萎缩的药物，所述治疗脊髓损伤肌肉萎缩的药物为氯沙坦。

本发明的另一目的在于提供一种所述治疗脊髓损伤肌肉萎缩的药物的使用方法，所述治疗脊髓损伤肌肉萎缩的药物的使用方法为氯沙坦激活IGF1/Akt/mTOR信号通路并抑制MAFbx和MuRF-1表达；血管紧张素II受体阻断剂通过激活IGF-1/Akt/mTOR通路和抑制泛素-蛋白酶体系统产生作用。

本发明提供的治疗脊髓损伤肌肉萎缩的药物及其使用方法，证实了氯沙坦可以激活IGF1/Akt/mTOR信号通路并抑制MAFbx和MuRF-1表达，一定程度上缓解肌肉萎缩，但无论肌肉重量还是肌纤维粗细均始终未能达到正常水平；未能观察到运动功能的明显改善。血管紧张素II受体阻断剂可以一定程度上改善大鼠脊髓损伤后骨骼肌萎缩并可能通过激活IGF-1/Akt/mTOR通路和抑制泛素-蛋白酶体系统产生作用，为后期临床应用和联合治疗提供了部分依据。通过脊髓损伤早期应用氯沙坦，可以帮助患者在脊髓损伤早期集中精力救治生命及处理致命的并发症的同时维持肌肉状态，避免萎缩，为后期的康复训练争取条件，避免进入“肌肉萎缩-康复训练困难-肌肉进一步萎缩”的恶性循环，最终为患者的临床神经功能改善创造条件。

附图说明

图1是本发明实施例提供的血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂治疗脊髓损伤肌肉萎缩的模型的构建方法流程图。

图2是本发明实施例提供的氯沙坦抑制脊髓损伤诱导的肌肉萎缩示意图；

图中：(A)脊髓损伤后14天腓肠肌重量相对损伤前的百分比(％of pre-operative body weight)；(B)HE染色示脊髓损伤后肌纤维变圆，变小，且异质性增加，而氯沙坦治疗后部分缓解；(C)最小Feret直径(minimal Feret’s diameter)示脊髓损伤后细肌纤维比例增加，而氯沙坦治疗后部分缓解；(D)平均值计算氯沙坦治疗组确实增加肌纤维最小Feret直径。Scale bars,200μm；

Sham空白对照组；SCI脊髓损伤组；SCI+LOS脊髓损伤联合氯沙坦治疗组；*相对Sham组P<0.05；#相对SCI组P<0.05。

图3是本发明实施例提供的BB评分对脊髓损伤后后肢行为学功能评价示意图；脊髓损伤后各组大鼠BBB评分均逐渐上升；从BBB评分上看，未反映氯沙坦治疗组运动功能得到明显改善；

Sham空白对照组；SCI脊髓损伤组；SCI+LOS脊髓损伤联合氯沙坦治疗组；*相对Sham组P<0.05；#相对SCI组P<0.05。

图4是本发明实施例提供的血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1)阻滞剂激活IGF1/Akt/mTOR信号通路在脊髓损伤诱导的大鼠骨骼肌中示意图；

图中：(A)IGF-1的mRNA在大鼠腓肠肌中的定量分析可见,氯沙坦显著增加IGF-1在大鼠腓肠肌中的表达；(B)Western blot分析提示氯沙坦激活IGF1/Akt/mTOR信号传递通路；(C和D)pAkt和p-mTOR的相对表达水平使用标准化后的单位(arbitrary units，AUs)评估示磷酸化比例增加，通路激活；

Sham空白对照组；SCI脊髓损伤组；SCI+LOS脊髓损伤联合氯沙坦治疗组；*相对Sham组P<0.05；#相对SCI组P<0.05。

图5是本发明实施例提供的氯沙坦下调腓肠肌中MAFbx和MuRF-1表达水平示意图；

图中：MAFbx(A)和MuRF-1(B)的表达水平在脊髓损伤后显著增加,而氯沙坦的治疗则显著降低其相应表达；Sham空白对照组；SCI脊髓损伤组；SCI+LOS脊髓损伤联合氯沙坦治疗组；*相对Sham组P<0.05；#相对SCI组P<0.05。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂治疗脊髓损伤肌肉萎缩的模型的构建方法包括以下步骤：

S101：体积分数10％水合氯醛腹腔麻醉后，大鼠取俯卧位固定于小动物手术台，以T10为中心背部正中纵行切口，逐层分离皮肤及皮下组织，暴露并咬除T10棘突及椎板，显露硬膜；

S102：Impactor Model II脊髓打击器制作中度打击模型(25mm，10g)，打击后实验动物出现鼠尾摆动和后肢痉挛，关闭伤后；

S103：手术后每日采用盲法使用BBB评分对大鼠后肢运动功能进行评估，早期运动功能明显偏离恢复曲线的大鼠视为造模失败并予以排除出组。

下面结合实验对本发明的应用原理作进一步的描述。

1材料和方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物

健康雌性Wistar成年大鼠30只，8周龄，体重(220±10)g，中国医学科学院放射医学研究所供。

1.1.2主要试剂及仪器

兔抗大鼠多克隆抗体(CST，美国)；辣根过氧化物标记山羊抗兔IgG(碧云天，中国)；Trizol reagent(Invitrogen，美国)；cDNA Synthesis Kit(BioRad，美国)；Impactor ModelⅡ打击器；恒温冰冻切片机(LEUCER，USA)。

1.2实验方法

1.2.1SCI动物模型的制备

体积分数10％水合氯醛腹腔麻醉满意后，大鼠取俯卧位固定于小动物手术台，以T10为中心背部正中纵行切口，逐层分离皮肤及皮下组织，暴露并咬除T10棘突及椎板，显露硬膜。Impactor Model II脊髓打击器制作中度打击模型(25mm，10g)，打击后实验动物出现鼠尾摆动和后肢痉挛，小心关闭伤后，手术后每日采用盲法使用BBB评分对大鼠后肢运动功能进行评估，早期运动功能明显偏离恢复曲线的大鼠视为造模失败并予以排除出组。

1.2.2实验动物分组

空白对照组(Sham group)采用仅行椎板去除暴露硬膜，不进行打击损伤；脊髓损伤组(SCI group)仅行脊髓打击，无药物干预；脊髓损伤联合氯沙坦治疗组(SCI+LOS group)与脊髓损伤造模后即每天给予氯沙坦(5mg/kg)饮用，每组实验动物10只。

1.2.3取材

术后14天脱颈处死大鼠，迅速暴露大鼠小腿后侧腓肠肌，小心暴露小腿近端内外侧头附着点及远端附着点，完整分离后去除腱性组织和周围附着软组织后称重，行形态学检查标本置入10％中性甲醛固定，其余标本迅速置入-80℃储存后准备下一步实验。

1.2.4HE染色

采用常规HE染色方法：标本固定完成后，常规脱水，石蜡包埋，取腓肠肌靠近中部位置，5μm厚度切片。切片完成后烘烤晾干，常规二甲苯、乙醇梯度脱蜡，清洗后苏木精染色，冲洗后乙醇梯度脱水伊红染色，脱水透明，中性树胶封片，显微镜观察形态。肌纤维横截大小采用最小Feret直径(minimal Feret’s diameter，MFD)作为检测指标以最小化切割角度等因素造成的误差。比较不同肌纤维横截面大小的分布以及计算均值，来评估和比较腓肠肌萎缩变化程度。

1.2.5Western blot检测

取冰冻标本，按比例加入细胞裂解液(50mM Tris，pH 7.4，150mM NaCl，1％Triton X-100，1％sodium deoxycholate，0.1％SDS)及蛋白酶和磷酸酶抑制剂。匀浆置于离心机12000转20分钟后收集上清，BCA法测定蛋白浓度并调一致，进行SDS凝胶电泳后转至硝酸纤维素膜。5％脱脂奶粉或5％BSA封闭，一抗4℃过夜，一抗包括：p-Akt(Ser473)，total Akt，p-mTOR(Ser2448)，total mTOR(CST，美国)，and total GAPDH(碧云天，中国)。二抗采用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔室温孵育。化学增强发光法(ECL)曝光显影定影，定量数据分析采用Image J软件(National Institutes of Health，美国)。

1.2.6Real-time PCR检测

Trizol冰上提取腓肠肌总RNA，检测确定RNA质量良好无降解，逆转录为cDNA。以大鼠GAPDH为内参分析IGF-1，MAFbx，MuRF-1。引物由Invitrogen公司合成，相对定量法2^-△△Ct计算各基因表达。各引物序列如下：

IGF-1(FW:5’-GCACTCTGCTTGCTCACCTTTA-3’，

REV:5’-TCCGAATGCTGGAGCCATA-3’)，

MAFbx(FW:5’-AGAAAAGCGGCACCTTCGT-3’，

REV:5’-CTTGGCTGCAACATCGTAGTTC-3’)，

MuRF-1(FW:5’-GAGAACCTGGAGAAGCAGCTCAT-3’，

REV:5’-CCGCGGTTGGTCCAGTAG-3’)，

GAPDH(FW:5’-TCACCACCATGGAGAAGGC-3’，

REV:5’-GCTAAGCAGTTGGTGGTGCA-3’)，

1.2.7统计学方法

采用SPSS 16.0软件包进行统计学分析。数据以均数±标准差表示，多组比较采用单因素方差分析，组间比较采用Student-Newman-Keuls方法，免疫组化染色的数字图像采用Image pro plus 6.0软件进行图像分析，设P<0.05差异有统计学意义。

2结果

2.1氯沙坦对脊髓损伤后肌肉萎缩的抑制作用

目前认为脊髓损伤后肌肉萎缩程度可能受肌纤维类型影响，因此作为探索性研究，我们选则快慢肌纤维构成比相对适中的腓肠肌作为研究对象。结果显示，脊髓损伤后腓肠肌萎缩程度较重，2周时可降低约27.7％-51.7％。而通过氯沙坦干预，能够一定程度恢复肌肉质量。而肌纤维横截面大小从HE染色上可见在脊髓损伤后2周时，腓肠肌肌纤维横截面部分变小变圆且变异程度变大，而氯沙坦治疗后形态有所恢复。通过不同肌纤维横截面分布分析，单纯脊髓损伤后较细的肌纤维所占比例增多，而统计学计算均值结果一致。尽管氯沙坦治疗后肌肉萎缩程度有所改善(P<0.05)，但未能恢复至空白对照组水平(P<0.05)。

2.2氯沙坦对脊髓损伤大鼠运动功能的作用

通过动态观察不同组之间BBB评分，大鼠脊髓损伤后，BBB评分在术后当天为0，此后逐渐恢复，至术后第14天，恢复至8左右水平，氯沙坦治疗组未能提高脊髓损伤大鼠行为学评分(P>0.05)。

2.3氯沙坦激活IGF1/Akt/mTOR信号通路

Real-time PCR的结果显示脊髓损伤后IGF-1水平在术后14天时，基本不变，而通过氯沙坦干预后表达显著上升(P<0.05)。而Western blot结果显示，氯沙坦治疗后腓肠肌中磷酸化Akt和mTOR蛋白表达明显增加，提示该通路激活。

2.4氯沙坦抑制MAFbx和MuRF-1表达

脊髓损伤后2周，MAFbx和MuRF-1表达明显上调，而联合氯沙坦治疗组，，MAFbx和MuRF-1则下调至接近正常水平，相比单纯脊髓损伤组差异具有统计学意义(P<0.05)。

本实验证实了氯沙坦可以激活IGF1/Akt/mTOR信号通路并抑制MAFbx和MuRF-1表达，一定程度上缓解肌肉萎缩，但无论肌肉重量还是肌纤维粗细均始终未能达到正常水平。本实验未能观察到运动功能的明显改善。

图2是本发明实施例提供的氯沙坦抑制脊髓损伤诱导的肌肉萎缩示意图；

图中：(A)脊髓损伤后14天腓肠肌重量相对损伤前的百分比(％of pre-operative body weight)；(B)HE染色示脊髓损伤后肌纤维变圆，变小，且异质性增加，而氯沙坦治疗后部分缓解；(C)最小Feret直径(minimal Feret’s diameter)示脊髓损伤后细肌纤维比例增加，而氯沙坦治疗后部分缓解；(D)平均值计算氯沙坦治疗组确实增加肌纤维最小Feret直径。Scale bars,200μm；

Sham空白对照组；SCI脊髓损伤组；SCI+LOS脊髓损伤联合氯沙坦治疗组；*相对Sham组P<0.05；#相对SCI组P<0.05。

图3是本发明实施例提供的BB评分对脊髓损伤后后肢行为学功能评价示意图；脊髓损伤后各组大鼠BBB评分均逐渐上升；从BBB评分上看，未反映氯沙坦治疗组运动功能得到明显改善；

Sham空白对照组；SCI脊髓损伤组；SCI+LOS脊髓损伤联合氯沙坦治疗组；*相对Sham组P<0.05；#相对SCI组P<0.05。

图4是本发明实施例提供的血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1)阻滞剂激活IGF1/Akt/mTOR信号通路在脊髓损伤诱导的大鼠骨骼肌中示意图；

图中：(A)IGF-1的mRNA在大鼠腓肠肌中的定量分析可见,氯沙坦显著增加IGF-1在大鼠腓肠肌中的表达；(B)Western blot分析提示氯沙坦激活IGF1/Akt/mTOR信号传递通路；(C和D)pAkt和p-mTOR的相对表达水平使用标准化后的单位(arbitrary units，AUs)评估示磷酸化比例增加，通路激活；

Sham空白对照组；SCI脊髓损伤组；SCI+LOS脊髓损伤联合氯沙坦治疗组；*相对Sham组P<0.05；#相对SCI组P<0.05。

图5是本发明实施例提供的氯沙坦下调腓肠肌中MAFbx和MuRF-1表达水平示意图；

图中：MAFbx(A)和MuRF-1(B)的表达水平在脊髓损伤后显著增加,而氯沙坦的治疗则显著降低其相应表达；Sham空白对照组；SCI脊髓损伤组；SCI+LOS脊髓损伤联合氯沙坦治疗组；*相对Sham组P<0.05；#相对SCI组P<0.05。

综上所述，血管紧张素II受体阻断剂可以一定程度上改善大鼠脊髓损伤后骨骼肌萎缩并可能通过激活IGF-1/Akt/mTOR通路和抑制泛素-蛋白酶体系统产生作用，为后期临床应用和联合治疗提供了部分依据。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。