一种胆绿素制剂及其在防治猪繁殖与呼吸综合征中的应用和检测方法与流程

本发明属于生物医药技术领域，本发明涉及一种胆绿素制剂及其应用和检测方法，具体涉及一种胆绿素制剂及其在抗PRRSV中的应用和检测方法。

背景技术：

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的对全球养猪业危害极大的猪重要传染病。PRRS主要引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎、弱仔以及各年龄段猪特别是仔猪呼吸道症状，特征性病变为间质性肺炎，死亡率极高。

PRRSV的防控是目前我国乃至世界的难题。PRRSV难于防控主要表现在以下几方面：

(1)嗜巨噬细胞性和免疫抑制性疾病，PRRSV主要感染猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophages,PAMs),PAMs是免疫细胞，破坏PAMs，从而破坏机体免疫系统，引起免疫抑制；

(2)抗原变异性，目前PRRSV变异较快，弱毒疫苗的使用是促使病毒变异的一个原因，疫苗没有交叉保护力；

(3)抗体依赖性增强，PRRSV的感染会刺激机体产生抗体，但低效价的抗体不但不能中和病毒，反而对病毒的增殖有促进作用；

(4)病毒持续性感染，PRRSV感染后，能够长时间在猪体内检测到病毒血症；

(5)混合感染，目前临床上混合感染，特别是圆环病毒、副猪嗜血杆菌等与PRRSV的混合感染使PRRSV防控难上加难。

因此，急需开发新的抗PRRSV感染的药物，有效防治猪蓝耳病的发生。

胆绿素的英文名称是Biliverdin，其结构式如式Ⅰ所示。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一种胆绿素制剂，以克服现有技术所存在的上述缺点和不足。本发明为了克服现有防控PRRSV的疫苗存在的问题，寻找一种对PRRSV有很好抗病毒效果的药物，以更好的防治猪蓝耳病。

本发明的目的在于，提供一种胆绿素制剂在防治猪繁殖与呼吸综合征中的应用。

本发明的目的在于，提供一种抗猪繁殖与呼吸综合征病毒药物制剂。

本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：

首先检测胆绿素对PRRSV感染Marc-145细胞的影响。不同浓度的胆绿素处理PRRSV感染后的Marc-145细胞，实时荧光定量PCR和western blot检测结果表明，胆绿素呈现浓度梯度依赖性的抑制PRRSV ORF7mRNA和核衣壳蛋白(N)表达。通过TCID₅₀检测了PRRSV感染后细胞培养上清中子代病毒滴度，结果表明，随着胆绿素浓度的升高，上清中PRRSV病毒滴度显著降低。

进一步，检测胆绿素对PRRSV感染PAM细胞的影响。采用western blot、TCID₅₀检测了胆绿素对PRRSV感染的影响。结果表明，胆绿素处理抑制了PRRSV核衣壳蛋白(N)的表达、显著的降低了细胞培养上清中PRRSV子代病毒滴度。

最后，采用间接免疫荧光(IFA)检测了其对PRRSV感染PAM细胞的影响。结果和前面的一致，表明胆绿素呈现浓度梯度依赖性的抑制PRRSV的复制。

综上所述，胆绿素对PRRSV感染有抑制活性，可开发成防治PRRSV感染的药物。从而为PRRS的防治提供了一个全新的思路，对实际生产有着重要的意义。

本发明的有益效果：

1、本发明采用了胆绿素生产工艺成熟，可以为抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的药物制备提供充足的原料。

2、胆绿素抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的效果明显，本发明通过体外实验发现，胆绿素能显著抑制PRRSV在Marc-145细胞和PAM细胞中复制与增殖。

3、本发明使用方便，药品为粉末制剂，2-8℃密封保存即可保存，易于运输，且即溶即用。

附图说明

图1为本发明的结构示意图。

图1为qPCR检测不同浓度胆绿素处理后PRRSV ORF7 mRNA表达。

图2为western blot检测不同浓度胆绿素处理对PRRSV感染Marc-145细胞的影响。

图3为不同浓度胆绿素处理后Marc-145细胞培养上清PRRSV TCID₅₀的测定。

图4为western blot检测不同浓度胆绿素处理对PRRSV感染PAM细胞的影响。

图5为不同浓度胆绿素处理后PAM细胞培养上清PRRSV TCID₅₀的测定。

图6位间接免疫荧光检测不同浓度胆绿素处理对PAM细胞中PRRSV N蛋白表达的影响

附图标记：图6为合并绿光和蓝光的结果，其中中间蓝色部分为细胞核部分，由DAPI染色；上面绿色荧光为标记了FITC的病毒N蛋白。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。除非特别说明，本发明采用的试验方法、试剂以及设备均为本技术领域常规方法、试剂和设备。

实施例1胆绿素的配制

将胆绿素(购自美国Sigma公司)溶解于0.1mol/L的NaOH，用1mol/L的HCL调pH值至7.4，再用PBS倍比稀释，用0.2μM的滤膜过滤除菌，分装后用锡箔纸包裹，贮存于-80℃备用。

实施例2胆绿素处理PRRSV感染的Marc-145细胞

Marc-145细胞以1×10⁵个细胞/ml的密度培养于含DMEM培养基(含青霉素100U/ml，链霉素50μg/ml，10％胎牛血清)的六孔细胞培养板中，37℃，5％CO₂的湿润培养箱中培养至70％～80％汇合度，弃去培养基。每孔接入0.1MOI的PRRSV，37℃孵育1h，弃去未吸附的病毒液，用1ml PBS/孔洗涤3次。每孔分别加入2ml含上述实施例1稀释好的不同浓度(10μM、20μM、50μM、100μM、150μM)胆绿素的培养基，置于37℃，5％CO₂的加湿培养箱中培养。病毒感染后48h，分别收集细胞上清和细胞。

实施例3qPCR检测不同浓度胆绿素处理后PRRSV ORF7 mRNA表达

胰酶消化实施例2处理的细胞后，收集于1.5ml的离心管内，4℃，500g，离心10min，弃去上清。每管加入1ml TRIzol(购自Invitrogen公司)，参照说明书抽提总RNA。用PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time试剂盒(购自TAKARA公司)将RNA反转录成cDNA。

最后应用SYBR GREEN试剂盒(购自Roche公司)和上述反转录的cDNA模版及设计好的PRRSV ORF7基因的上下游引物，在Applied Biosystems的StepOnePlus Real-Time PCR System上进行实时荧光定量PCR检测。

反应条件为：95℃10min进行变性；95℃15sec，60℃1min，反应40个循环；95℃15sec，60℃1min，95℃15sec进行溶解曲线分析。

图1结果表明，胆绿素以浓度梯度依赖性方式抑制PRRSV ORF7 mRNA表达。

实施例4Western blot检测不同浓度胆绿素处理对PRRSV感染Marc-145细胞的影响。

胰酶消化实施例2处理的细胞后，收集于1.5ml的离心管内，4℃，500g，离心10min，弃去上清。沉淀用200μl NP40裂解液冰上裂解30min；12000g离心10min，除去细胞碎片，取上清，5μl裂解样品+45μl PBS，Pierce BCA protein Assay Kit测定总蛋白浓度，进行western blot检测。每个泳道40μg总蛋白，在Bio-Lab电泳仪上以150V电压进行SDS-PAGE；转膜后，将膜小心取出，封闭液4℃封闭过夜；弃封闭液，用洗脱液洗膜，每次5min共洗4次；加入一抗：anti-N蛋白抗体，anti-α-tubulin抗体室温孵育2h；弃一抗，用PBST洗膜，5min×4次；加入二抗：HRP-Goat@Mouse IgG，室温孵育1h；弃二抗，用PBST洗膜，5min×4次；PBS洗膜，5min×4次；最后进行ECL发光显色。

如图2的检测结果表明，胆绿素呈现浓度梯度依赖性的抑制PRRSV N蛋白表达。

实施例5不同浓度胆绿素处理后Marc-145细胞培养上清PRRSV TCID₅₀的测定

将实施例2中收集的细胞培养上清，用无血清DMEM细胞培养基作10倍系列稀释10^-1至10^-8，接种在Marc-145细胞汇合度为70％～80％的96孔细胞培养板上，每稀释度接种8孔，每孔0.1ml，37℃孵育1h后每孔再加入175μl含3％FBS的DMEM维持液，37℃、5％CO₂培养箱中培养3-7d，每天观察细胞病变(CPE)。

PRRSV感染细胞所致的CPE表现为细胞表面粗燥，折光性强，最后细胞脱落。按Reed-Muench法计算病毒的TCID₅₀。

检测结果如图3所示，胆绿素呈现浓度梯度依赖性的降低Marc-145细胞培养上清中PRRSV的病毒滴度。

实施例6胆绿素处理PRRSV感染的PAM细胞

PAM以1×10⁶个细胞/ml的密度培养于含RPMI-1640培养基(含青霉素100U/ml，硫酸链霉素50μg/ml 10％胎牛血清)的六孔细胞培养板中，37℃孵育1h，吸弃病毒液，分别加入含有不同浓度胆绿素(20μM、50μM、100μM)的3％FBS的RPMI-1640维持液培养基于37℃，5％CO₂的加湿培养箱中培养，同时用不含胆绿素的3％FBS的RPMI-1640培养基作为对照，24hpi收集细胞及上清。

实施例7Western blot检测不同浓度胆绿素处理对PRRSV感染PAM细胞的影响

Western blot检测样品来自实施例6所收集的细胞样品。

Western blot检测方法同实施例4中所描述的方法。

Western blot检测结果如图4所示，与未经胆绿素处理对照组相比，胆绿素以浓度依赖性方式抑制PRRSV N蛋白表达。

实施例8不同浓度胆绿素处理后PAM细胞培养上清PRRSV TCID₅₀的测定

TCID₅₀测定上清样品来自实施例6所收集的细胞培养上清。

TCID₅₀测定方法同实施例5中所描述的方法。

TCID₅₀测定结果如图5所示，胆绿素浓度梯度依赖性降低PAM细胞培养上清中子代病毒滴度。

实施例9间接免疫荧光检测不同浓度胆绿素处理对PAM细胞中PRRSV N蛋白表达的影响

(1)铺板：将PAM细胞以1×10⁶个细胞/ml的密度加到24孔细胞培养板上，每孔500μl，大约24h达到80％汇合度。

(2)接毒：PRRSV接毒量为0.1MOI，37℃孵育1h，弃掉病毒液，1×PBS洗3次，加入含不同浓度胆绿素的3％FBS+RPMI-1640维持液后继续培养。

(3)固定：培养约24h等细胞稍出现CPE现象，将毒液弃掉，加入400μl/孔的75％乙醇(需事先放在-20℃预冷)，4℃固定30min。

(4)洗板：弃掉固定液，400μl/孔PBS洗5min/次×4次，在生物安全柜中将24孔板吹干。

(5)孵育一抗：每孔加入150μl用PBS稀释好的抗PRRSV N蛋白的单抗6D10(1:300稀释)，37℃孵育1h。

(6)洗板：400μl/孔PBS洗5min/次×4次。

(7)孵育二抗：每孔加入150μl用PBS稀释好的FITC标记的羊抗鼠IgG荧光二抗(1:300稀释)，37℃避光孵育1h。

(8)染细胞核：在荧光二抗孵育将要结束的最后5min，加入100μl/孔的4’,6’-diamidino-2-phenylindole(DAPI)，染色细胞核(DAPI用PBS按1:10000比例稀释)。

(9)洗板：400μl/孔PBS洗5min/次×4次。

(10)观察荧光：加入一定量PBS后直接镜检。

从图6可以看出，随着胆绿素浓度的增加，标记了FITC的N蛋白表达(绿色荧光)在减少，且呈剂量依赖性。从而更加确认胆绿素在PRRSV感染PAM细胞过程中可以发挥抗病毒作用。

以上对本发明的具体实施方式进行了说明，但本发明并不以此为限，只要不脱离本发明的宗旨，本发明还可以有各种变化。