五羟基黄酮类化合物在制备具有3C蛋白酶活性抑制作用的药物中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及五羟基黄酮类化合物在制备具有3C蛋白酶活性抑制作用的药物中的应用。

背景技术：

3C蛋白酶是催化小RNA病毒前体蛋白中非结构蛋白裂解的关键蛋白酶，具有高度的酶切特异性，在病毒的生命周期中起着举足轻重的作用，抑制其催化功能可有效抑制病毒前体蛋白的切割，阻断病毒复制，是小RNA病毒药物治疗研究的靶点之一。3C蛋白酶的识别位点为Leu Glu Val Leu Phe Gln↓GlyPro，而切割位点在Gln—G1y之间，称为Q-G位点。3C蛋白酶具有典型的半胱氨酸蛋白酶特征。基序Gly-X-Cys-Gly，通过氢键网络将具有催化活性的氨基酸Cys、His、Asp或Glu连接形成活性催化基团；同时该催化基团按照Cys-His-Glu/Asp次序依次发挥催化酶解功能。

3C蛋白酶基因还具有高度的保守性，因此3C蛋白酶可以作为一个理想的药物作用靶点。以3C蛋白酶为靶点设计合成的化合物AG7088及其类似物，是鼻病毒3C蛋白酶的有效抑制剂，也是目前为止最有前景的抗小RNA病毒的化合物。

天然黄酮类化合物存在于高等植物及以植物为原料的食品中，是一类在植物界广泛分布的多酚化合物，具有众多生物活性和很高的药用价值。五羟基黄酮类化合物或衍生物槲皮素(Quecertin)是众多黄酮类化合物中活性最高的化合物之一。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种具有如下结构式的五羟基黄酮类化合物或衍生物作为唯一药效原料在制备具有3C蛋白酶活性抑制作用的药物中的应用，

式中R₁可以为氧代基、C_1-6烷基氨基、苯基，以及含有N、S或O的杂原子5或6元杂环基，所述的苯基和杂环基可以各自任意被羟基、氨基和其它烷基取代；R₂选自氢、羟基、氨基、巯基、硝基、C_1-6烷基氨基。

进一步地，本发明提供的式(I)的化合物中R₁为羟基、氧代基、羟基取代的含有氧杂环基；R₂选择氢、羟基、氨基。

进一步地，本发明提供的式(I)的化合物为槲皮素(Quecertin)、槲皮苷(Quercitrin)和芦丁(Rutin)。

本发明的另一目的是提供式I所示的五羟基黄酮类化合物或衍生物在制备通过抑制3C蛋白酶活性来治疗EV71病毒感染的药物中的应用。

本发明通过五羟基黄酮类化合物或衍生物在体外可以有效抑制EV71 3C蛋白酶活性，且实验证明五羟基黄酮类化合物或衍生物可以有效抑制EV71在RD细胞中的复制，因此可以作为预防和/或治疗手足口病的潜在药物进行深入的研究和开发。

本发明首次提出五羟基黄酮类化合物或衍生物作为3C蛋白酶抑制剂在制备预防和/或治疗由EV71和CVB3感染引起的手足口病的药物中的应用。

附图说明

图1不同浓度的Quercetin对RD细胞的毒性；

图2不同浓度的Quercetin抗EV71的活性；

图3不同浓度的Quercetin抑制EV71 3C蛋白酶活性；

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

下列实施例主要以Quercetin为例，所用到的主要材料和试剂如下：

槲皮素(Quecertin)购自Calbiochem公司，3C蛋白酶荧光底物Dabcyl-RTATVQGPSLDFE-Edans由上海凯靖生物科技有限公司合成，EV71毒株EV71/wuhan/3018/2010由本实验室保存。人横纹肌瘤细胞(RD)、大肠杆菌DH5α、BL21均由本实验室保藏。载体pET-28a由华中师范大学生命科学学院刘德立教授赠送。150i二氧化碳细胞培养箱购自Thermo Scientific，ELX800酶标仪购自BioTek，96孔板购自Roche，二甲基亚砜(DMSO)购自BD，DMEM(Dulbecco modified Eagle mediuM)购自Gibco，其它常规使用的无机盐和有机溶剂都购自国药集团化学试剂有限公司。

【实施例1】Quercetin抗EV71活性研究

实验方案：将培养好的RD细胞接入96孔板，待细胞密度达到80％-90％时，抗病毒组加入7X10⁵EV71感染细胞，1.5h后弃掉病毒液，与药毒组同时加入用2％FBS的DMEM配制的Quercetin，浓度分别为0μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM、200μM(由于Quercetin溶解性限制，最高药物毒性和抗病毒活性均只做到200μM)，作用48h后显微镜目测细胞的存活状况。使用MTT法测细胞存活率，移除96孔板培养液，每孔使用100μl PBS洗涤细胞2次；每孔加入30μl 5mg/ml的MTT，置于37℃培养箱孵育2-4h；移除MTT尽可能干净，加入40μl DMSO溶解混匀；在酶标仪490nm处读取吸光值。

实验结果：图1表明在200μM范围内Quercetin对RD细胞有微弱毒性，细胞存活率均在80％以上，不具备浓度依赖性，CC50大于200μM。图2表明Quercetin能显著抑制EV71在RD细胞中的增殖，提高细胞存活率，并且具有浓度依赖性，EC50为15μM。治疗指数SI(CC50/EC50)大于13.3。

【实施例2】Quercetin体外抑制EV71 3C蛋白酶活性

本发明利用荧光共振能量转移原理，先合成一段荧光多肽Dabcyl-RTATVQGPSLDFE-Edans作为3C蛋白酶底物，其中QG是3C蛋白酶切割位点。在100μl反应体系中，50mM Tris-HCl、200mM NaCl、2mM DTT、1μM3C蛋白酶、一定梯度浓度的化合物Quercetin，本发明使用浓度梯度为200μM、100μM、50μM、10μM、5μM、1μM，室温孵育4-6h后，加入50μM的荧光底物混匀后立即在多功能酶标仪进行荧光检测。理论上若化合物能抑制3C蛋白酶的活性，那么加入化合物后在反应的初始阶段荧光产生的速率会降低，反应初始阶段作为一级反应处其起荧光强度在一定时间范围内呈线性关系，根据不同浓度的化合物处理后荧光产生的速率即斜率可以计算抑制率，再根据不同浓度化合物的抑制率可求得该化合物的IC50。

本发明实施例2所用方法可分为以下步骤：

1、引物设计

通过NCBI数据库查询EV71/wuhan/3018/2010毒株3C蛋白酶基因序列，使用Primer 5软件设计N端带有his标签的3C蛋白酶引物，序列如下：F 5，-CGCCCATGGGGCCCAGCTTAGACTTCG-3，；R 5，-CCCAAGCTTT TATTG CTCGCTGGC AAAATAAC-3，，酶切位点为Nco I和Hind III。引物由华大基因公司合成。

2、重组质粒构建

EV71感染RD细胞48h后，提取总RNA进行反转录，收获cDNA作为PCR模板。对目的片段进行PCR扩增，根据引物TM值以及目的片段的长度确定PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s，共30个循环，72℃延伸5min。PCR产物和载体pET-28a分别经Nco I与Hind III37℃酶切4h后，T4连接酶4℃连接过夜。连接产物转化DH5α，涂布于含卡纳青霉素的LB平板，挑取阳性克隆富集培养，提取质粒后经PCR和酶切鉴定，送往华大基因公司测序。

3、3C蛋白酶原核表达与纯化

将重组质粒pET28a-3C转化BL21，涂布于含卡纳青霉素的LB平板，挑取单菌落于LB液体培养基37℃，220rpm震荡培养，待菌液OD600达到0.8时，加入终浓度0.5mM的IPTG于18℃诱导过夜。收集菌体，加入0.3倍体积的裂解液超声裂解30min，功率30％，工作5s间隔5s。菌体裂解液13000rmp，4℃离心20min，收集上清即为粗酶液。

装好Ni-NTA柱，加入2ml新鲜树脂，让柱中酒精在重力作用下自然流干，然后加入3倍柱体积的裂解缓冲液平衡柱子。柱平衡后注入粗酶液，控制流速为1mL/min左右，收集流出液，上样结束后加入含一定浓度咪唑的冲洗缓冲液冲洗杂蛋白，最后加入1倍柱体积的洗脱液将目的蛋白从柱子上洗脱下来，收集每次过滤的滤液。考马斯亮蓝法测纯化后蛋白浓度并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。

4、Quercetin对3C蛋白酶抑制作用

反应体系：50mM Tris-HCl、200mM NaCl、2mM DTT、1μM 3C蛋白酶、一定梯度的3C化合物室温孵育4-6h后，加入50μM荧光多肽底物，按以上反应体系配制反应液于酶标板，震荡混匀后立即在多功能酶标仪上检测，检测条件为：激发波长为340nm，发射波长为500nm，反应温度37℃，每隔30s读取一个数值，总时间为20min。以DMSO作为阴性对照，Rutin作为阳性对照，将得到的数据做成荧光强度与时间的散点图并求出斜率，抑制率＝(阴性对照组斜率-化合物组斜率)/阴性对照组斜率*100％。通过SPSS软件求出化合物半数抑制浓度。

实验结果：图3表明在体外Quercetin能抑制EV71 3C蛋白酶活性，半数抑制浓度达18μM。

综上所述，以Quercetin为代表的五羟基黄酮类化合物具有较好的抗EV71活性和抑制3C蛋白酶的活性，为以3C蛋白酶为靶点的抗EV71药物设计和研发提供指导。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北工业大学

<120> 五羟基黄酮类化合物在制备具有3C蛋白酶活性抑制作用的药物中的应用

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<170> PatentIn version 3.3

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<213> 3C蛋白酶上游引物

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<212> DNA

<213> 3C蛋白酶下游引物

<400> 2

cccaagcttt tattgctcgc tggcaaaata ac 32