高良姜素在治疗糖尿病脑病药物中的应用的制作方法

本发明涉及高良姜素新的药理作用及其作用机制，尤其是高良姜素对糖尿病脑病的防治作用。

背景技术：

糖尿病脑病（diabetic encephalopathy，DE）是指糖尿病（diabetes mellitus，DM）久病患者渐进发生的以智能减退和大脑神经生理及结构改变为主要特征的精神功能紊乱性疾病，是糖尿病在中枢神经系统中最常见的并发症。在糖尿病状态下，脑的结构改变主要是海马及皮质萎缩，功能改变主要是认知功能损害，大量的研究报道肯定了糖尿病引起认知功能障碍的事实。在2006 年，专门术语糖尿病认知功能障碍（diabetes-associated cognitive decline,DACD）的提出进一步增强了人们对这种功能紊乱的认识，并成为糖尿病脑病研究的焦点。据估计全世界现有约3.47 亿成年人罹患糖尿病，其中40% 生活在中国和印度。广泛的流行病学调查研究以及基于流行病学调查的前瞻性研究表明：糖尿病是与年龄相关的认知功能下降和痴呆的一个危险因素，相对于非糖尿病患者，认知功能下降的速度在糖尿病患者中增加了1.5-2.0 倍；同样地，对于阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD) 的发病率，DM 患者是非DM 患者的2 倍。多数研究结果表明，糖尿病脑病是一种大脑加速老化的过程，因而国外学者de la Monte SM 研究组提出AD 是Ⅲ型DM 的观点。因此，糖尿病脑病正在成为本世纪全世界医药界重要的研究课题之一。

高良姜素 ，别名：高良姜黄素；3,5,7-三羟基黄酮，英文名称Galangin，主要存在于姜科植物及蜂胶中，已知的其具有抗病毒抗肿瘤作用。结构是如下：

技术实现要素：

1. 发明目的

本发明的目的在于发现了高良姜素新的药理作用，即高良姜素对糖尿病脑病的防治作用。实际上，本发明涉及高良姜素对糖尿病认知功能损害的防治作用及其可能的作用机制。

2. 技术方案

高良姜素对糖尿病脑病等糖尿病并发症具有防治作用，尤其是高良姜素对糖尿病引起的学习、记忆能力损害具有明显的改善作用；高良姜素是通过降低贝塔淀粉样肽前体蛋白β-位裂解酶1（BACE1） 的功能、抑制晚期糖基化终末化产物（AGEs/RAGE）轴、抗炎、抗氧化应激等实现上述作用。

3. 有益效果

以上药理试验结果表明本发明具有以下优点：

（1）本发明对高良姜素发现了新的药理作用以及新的医药用途，开拓了一个新的应用领域。

（2）本发明表明高良姜素防治糖尿病脑病药理效果好，作用强，预示着有良好的药用前景。

（3）在Morris 水迷宫试验中，高良姜素可明显降低DM 大鼠的逃避潜伏期、增加平台穿越次数以及在平台所在象限的停留时间的百分比，说明高良姜素具有明显改善DM 大鼠的学习、记忆能力。

（4）本发明表明高良姜素具有明显降低DM 大鼠海马中AGEs 水平的作用，说明高良姜素可明显抑制AGEs/RAGE 轴介导蛋白糖化作用。

（5）本发明表明高良姜素具有显著降低 DM 大鼠大脑皮质中 BACE1 活性、表达的作用，提示出高良姜素可明显降低脑内神经细胞毒剂 Aβ 的生成及其对中枢神经系统的损伤。

（6）高良姜素明显降低DM 大鼠海马中IL-1β 和TNF-α 水平，表明高良姜素具有强大的抗炎作用。

（7）高良姜素明显增加血清中GSH 水平，增强血清中SOD 活性的作用，表明高良姜素具有很强的抗氧化作用。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1 高良姜素对训练1天和4天的DM 大鼠逃避潜伏期的影响

注 ：与正常对照组比较，P<0.01；与模型组比较，*P<0.05。

图 2 高良姜素对 DM 大鼠平台穿越次数的影响

注 ：与正常对照组比较，P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

图 3 高良姜素对 DM 大鼠平台所在象限的停留时间的影响

注 ：与正常对照组比较，P<0.01；与模型组比较，*P<0.05。

图 4 高良姜素对 DM 大鼠空腹血糖的影响

注 ：与正常对照组比较，P<0.01；

图 5 高良姜素对 DM 大鼠海马中 AGEs 含量的影响

注 ：与正常对照组比较，P<0.01；与模型组比较， **P<0.01。

图 6 高良姜素对 DM 大鼠大脑皮质中 BACE1 活性的影响

注 ：与正常对照组比较，P<0.01；与模型组比较，*P<0.05。

图 7 高良姜素对 DM 大鼠大脑皮质中 BACE1 蛋白表达的影响

注 ：与正常对照组比较，P<0.01；与模型组比较，**P<0.01。

图 8 高良姜素对 DM 大鼠海马中IL-1β水平的影响

注 ：与正常对照组比较，P<0.01；与模型组比较， **P<0.01。

图 9 高良姜素对 DM 大鼠海马中TNF-α 水平的影响

注 ：与正常对照组比较，P<0.01；与模型组比较， **P<0.01。

图 10 高良姜素对 DM 大鼠血清中SOD 活性的影响

注 ：与正常对照组比较，P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

图 11 高良姜素对 DM 大鼠血清中GSH 水平的影响

注 ：与正常对照组比较，P<0.01；与模型组比较，*P<0.05。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，但绝不是对本发明范围的限制。下面参照实施例进一步详细阐述本发明，但是本领域技术人员应当理解，本发明并不限于这些实施例以及使用的制备方法。而且，本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行等同替换、组合、改良或修饰，但这些都将包括在本发明的范围内。

实施例1：高良姜素对DM 大鼠认知功能的影响

1 材料与方法

1.1 实验动物雄性SD 品系大鼠，8-9 周龄，190-220g，海南医学院实验动物中心。

1.2 药品与试剂高良姜素购自上海融禾医药科技发展有限公司（HPLC纯度>98%），STZ 购自sigma 公司，葡萄糖测试盒购自南京建成生物工程研究所。

1.3 方法

1.3.1 模型建立雄性SD 大鼠禁食不禁水12h 以上，按55mg/kg 一次性腹腔注射STZ（临用前溶于0.1mol/L 柠檬酸钠缓冲液，pH4.4）进行造模，造模三天后，眶静脉丛取血约0.2ml，25℃、3000rpm 离心10min，分离血清。用葡萄糖试剂盒检测空腹血糖（FBG），取FBG值大于250mg/dl(13.9mmol/L) 和小于600mg/dl（33.3mmol/L）的大鼠作为成功的糖尿病大鼠。

1.3.2 分组及给药将造模成功的糖尿病大鼠按照血糖值随机分为3 组，分别为糖尿病模型组、高良姜素高、低剂量组，每组10 只大鼠。另设一组正常对照组，每组10 只大鼠。高良姜素高、低剂量组分别按15，30mg/kg 灌胃（按10ml/kg 体积）给予高良姜素（用水制成混悬液），每天一次，连续9 周。正常对照组和模型组给同体积生理盐水。每周监测一次体重，调整给药体积，每月监测一次空腹血糖。

1.3.3 指标测定给药8 周后，各组大鼠进行Morris 水迷宫测试，观察学习、记忆功能，记录大鼠的逃避潜伏期、平台穿越次数以及在平台所在象限的停留时间的百分比。之后，各组大鼠股静脉取血，分离血清，低温保存，备用；即刻处死，取脑，分离海马和皮质，-80℃保存。

1.4多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t 检验进行统计学分析，P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高良姜素对DM 大鼠学习、记忆功能的影响

在Morris 水迷宫测试中，与正常组大鼠比较，在5 天的训练中DM 大鼠的逃避潜伏期均显著增加（P<0.01），平台穿越次数（P<0.01）以及在平台所在象限的停留时间的百分比显著减少（P<0.01）。高良姜素低剂量在训练的第5 天显著降低DM 大鼠的逃避潜伏期（P<0.05），高剂量在第1、4天均显著降低DM 大鼠的逃避潜伏期（P<0.05）；高良姜素高、低剂量均可显著增加在平台所在象限的停留时间的百分比（P<0.05 或P<0.01），而只有高剂量显著增加平台穿越次数（P<0.05）。结果见图1、图2、图3。

2.2 高良姜素对 DM 大鼠血糖和体重的影响

在整个实验过程中，DM 大鼠的 FBG 一直处于高水平状态，显著高于正常大鼠（P<0.01）。DM 大鼠给予高良姜素高、低剂量 4 及 9 周后，FBG 仍然处于高水平状态，与未给药 DM大鼠比较，无统计学差异（见图4）。在开始给药后，DM 大鼠的体重显著低于正常大鼠的体重（P<0.01），高良姜素高剂量在给药5和9周后，显著增加DM大鼠的体重（P<0.05），其他两个剂量在给药期间均对 DM 大鼠的体重无显著影响（见表 4）。

表 1 高良姜素对 DM 大鼠体重的影响

注 ：与正常对照组比较，P<0.01；与模型组比较，*P<0.05。

实施例 2 ：高良姜素对 DM 大鼠海马中 AGEs 水平的影响

1 材料与方法

1.1 实验动物同实施例 1。

1.2 药品与试剂兔抗 RAGE 抗体购自美国 Santa Cruz 公司，兔抗 GAPDH 抗体购自美国Bioworld公司，Ⅰ型胶原酶购自美国sigma公司，碱性磷酸酶二抗、苯甲基磺酰氟化物（PMSF）和 BCA 蛋白质测试盒购自江苏碧云天生物公司，Na₃VO₄和 NaF 购自国药集团（上海）化学试剂有限公司。

1.3 方法

荧光分光光度法检测 AGEs 水平。将保存的海马标本，称重后按 10 倍量（w/v）加入 100mM 的 PBS（pH7.4）缓冲液，4℃下超声匀浆。匀浆液于 4℃下 10000rpm 离心 15min后，上清液用于总蛋白质含量及其他相关指标测定。取沉淀，以双蒸水洗涤 3 次，在沉淀中加入氯仿 / 甲醇 (1:1)1.0ml，振荡过夜。再加入甲醇 / 水 (4:1)0.5ml，4℃下 4000rpm 离心5min。沉淀以甲醇 1.0ml 洗涤 2 次，双蒸水洗涤 2 次，再用 pH7.5,0.02mol/LHepes 缓冲液（含 0.1mol/L CaCl₂）洗 2 次。沉淀于 1.0ml Hepes 缓冲液中 4℃下过夜。离心去除缓冲液，将颗粒悬浮于 1.0ml 含Ⅰ型胶原酶（290U）的 Hepes 缓冲液中，加入甲苯和氯仿各 2.0μl。以只含 Hepes 缓冲液和胶原酶的空白管为标准，37℃振荡 24h，将消化液离心，留取上清液。用荧光分光光度法检测上清液中的荧光强度（反映 AGEs 的含量），激发波长为 370nm, 吸收波长为 440nm。AGEs 的含量以 U/mg 海马蛋白表示。

2 结果

DM 大鼠海马中 AGEs 含量显著增加，与正常大鼠海马中的比较有统计学意义（P<0.01）。高良姜素高剂量可显著降低DM大鼠海马中的AGEs含量（P<0.01），结果见图5。

实施例 3 ：高良姜素对 DM 大鼠大脑皮质中 BACE1 活性、蛋白表达及 mRNA 水平的影响

1 材料与方法

1.1 实验动物 同实施例 1。

1.2 药品与试剂

兔抗 BACE1 抗体购自英国 abcam 公司，兔抗 GAPDH 抗体购自美国Bioworld 公司，BACE1 的人工合成的荧光底物（货号 ES004）购自美国 R&D System 公司。大鼠 Bace1 和 β-actin 引物由上海生工生物工程公司合成，TRIzol 购自 Invitrogen 中国公司。

1.3 方法

1.3.1 BACE1 活性测定

荧光分光光度法测定 BACE1 活性。在测定 AGEs 水平时制备的大脑皮质匀浆液，离心所得的上清作为 BACE1 活性测定的样本。BCA 法测定总蛋白浓度后，在荧光底物终浓度为 10μM 的 100 μl 反应体系中加入 50-70 μg 蛋白，在 37℃反应 10 min，加入 20 μl 二甲基亚砜（DMSO）终止反应，采用荧光仪器测定反应体系的荧光强度（FSU），反映 BACE1 活性。BACE1 活性的大小表示为正常组产物生成量的百分比。

1.3.2 BACE1 蛋白表达测定

Western blotting 法测定 BACE1 蛋白表达。取分装保存的大脑皮质组织浆液，电泳分离样品，转膜（硝酸纤维素膜），洗膜，封闭，一抗反应，二抗反应，显色，扫描或拍照，Image J 软件分析 蛋白表达水平的变化。采用 GAPDH 作为内参。

1.4 统计学处理 同实施例 1。

2 结果

2.1 高良姜素对 DM 大鼠大脑皮质中 BACE1 活性的影响

DM 大鼠大脑皮质中 BACE1 活性显著增加，为正常大鼠大脑皮质的 129%，两组间比较有统计学意义（P<0.05）；高良姜素可显著降低 DM 大鼠大脑皮质中 BACE1 活性（P<0.05），结果见图6。

2.2 高良姜素对 DM 大鼠大脑皮质中 BACE1 蛋白表达的影响

DM 大鼠大脑皮质中 BACE1 蛋白的相对表达显著增加，与正常大鼠大脑皮质中的比较有统计学意义（P<0.01）；高良姜素可显著降低 DM 大鼠大脑皮质中的 BACE1 蛋白表达（P<0.01），结果见图7。

实施例 4 ：高良姜素对 DM 大鼠海马中 IL-1β和 TNF-α水平的影响

1 材料与方法

1.1 实验动物同实施例 1。

1.2 药品与试剂 IL-1β 和 TNF-α 的 ELISA 试剂盒购自上海依科赛生物制品有限公司，BCA 蛋白质测试盒购自江苏碧云天生物公司。

1.3 方法

酶联免疫吸附分析（ELISA）法测定 IL-1β 和 TNF-α 水平。取 BACE1 活性测定的样本，测定海马中 IL-1β 和 TNF-α 水平。IL-1β 和 TNF-α 水平测定严格按照各自试剂盒的操作步骤进行。

1.4 统计学处理同实施例 1。

2 结果

DM 大鼠海马中 IL-1β 和 TNF-α 水平显著增加，比正常大鼠海马中的分别增加了2.9 倍和 48.6%，两组间比较均有统计学意义（均 P<0.01）。高良姜素低、中、高剂量均可显著降低 DM 大鼠海马中的 IL-1β 和 TNF-α 水平（均 P<0.01），结果见图8、图9。

实施例 5 ：高良姜素对 DM 大鼠血清中 SOD 活性和 GSH 水平的影响

1 材料与方法

1.1 实验动物同实施例 1。

1.2 药品与试剂 SOD 和 GSH 试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.3 方法

分光光度法测定 SOD 活性和 GSH 水平。取保存的血清样本，测定 SOD 活性和 GSH 水平，严格按照各自试剂盒的操作步骤进行。

1.4 统计学处理同实施例 1。

2 结果

DM 大鼠血清中 SOD 活性和 GSH 水平显著降低，比正常大鼠血清中的分别降低了16.2% 和 38.4%，两组间比较均有统计学意义（均 P<0.01）；高良姜素高、低剂量均可显著增强 DM 大鼠血清中的 SOD 活性（P<0.05 或 P<0.01）；高良姜素高剂量可显著增加 DM 大鼠血清中的 GSH 水平（P<0.05），结果见图10、图11。

最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。