专利名称：：一种化合物及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种从杨树胶中分离出来的化合物"假胶素A"，即"4-甲氧基-2，6-二羟基-2-节基-[2,3-二氢-苯并呋喃-3-酮]"，其分子式是d讽405，化学结构式是HO，及其分离方法和其在测定蜂胶中杨树胶掺入量的应用。
背景技术：
：蜂胶(Propolis)是西方蜜蜂(々&膨〃^ra)从胶源植物的芽苞上采集的树脂，与其自身分泌物如蜂蜡等混合而成的一种胶状固体。蜂胶所含成分十分复杂，多达300余种，除蜂蜡外，还含有高良姜素、乔松素和槲皮素等数十种黄酮类物质及各种萜烯类、有机酸、氨基酸和矿物元素等。由于这些成分的协同作用，使蜂胶具有较好的抗菌、抗病毒、抗氧化、增强免疫和辅助降血糖、降血脂、抗肿瘤等医疗保健功能。蜂胶对心脑血管病、癌症、糖尿病具有较好辅助治疗作用，能够提高人体的免疫功能，抑制肿瘤细胞生长。同时，蜂胶还具有消炎、镇痛以及促使细胞再生的能力，对多种微生物感染引起的疾患，具有较好疗效。目前，国内外已经开发出蜂胶口服液、蜂胶胶囊、蜂胶软胶囊、蜂胶气雾<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>剂、蜂胶药皂、蜂胶洗液等多种产品。由于蜂胶的良好市场效果，一些不法商贩制假售假。市场上最常见的制假售假方法，就是以杨树芽加热熬制，压滤制成杨树胶。早期杨树胶外观较硬，气味与蜂胶相近似，比较容易用外观鉴别；发展至今，杨树胶与正宗的蜂胶经常相互掺杂在一起出售，也有人对杨树胶进一步提纯精制。由于杨树胶和蜂胶的化学成分非常相似，在蜂胶中掺入杨树胶成为一种常见的蜂胶掺假手段。而目前用于鉴别蜂胶真假的有效方法很少，蜂胶的两个标准一个是商业部颁发的标准代号为SB/T10096-92的蜂胶，另一个是国家农业部颁发的标准代号为NY/5136-2002的无公害食品蜂胶。用这两个标准都无法鉴别蜂胶与杨树胶，因为标准中的胶含量、总黄酮、氧化指标等项目，杨树胶基本上能够达到要求。CN1719247A公开了一种利用液相指纹图谱鉴别蜂胶真假的方法，但确无法准确的测定蜂胶中杨树胶的掺入量。因此国内外都没有能够建立一种用于测定蜂胶中杨树胶掺入量的有效方法，其主要困难是需要找到一种在天然蜂胶中不存在，而在杨树胶中普遍稳定存在的标志性化合物作为检测对象。
发明内容本发明涉及一种从杨树胶中分离出来的化合物"假胶素A"，即"4-甲氧基-2,6-二羟基-2-苄基-[2,3-二氢-苯并呋喃-3-酮]"，其分子式是^讽405，化学结构式是<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>该化合物在本发明之前未见文献报道，是由发明人首次从杨树胶中分离获得的新化合物，命名为"假胶素A"。该化合物具有以下物化特征1)外观白色片状结晶(结晶溶剂甲醇)；熔点大于21()GC(分解)。2)溶解度易溶于甲醇、丙酮，微溶于水、氯仿。3)质谱数据EI-MSm/z(%):286(3),268(2),258(1),225(1),195(57),167(100),152(8),124(7)，91(27)。其中分子离子峰M+是m/z(%)286(3)。4)紫外光谱数据UVMe0Hnm(logs):219.2(4.08),294.4(4.22)，324.8(4.13)。5)红外光谱数据IR(v,cm"):3402,3085，3028,2981,1678,1601，1506,1495,1474,1454,1441,1383,1356,1325，1302,1204,1165，1120，1076,984，835和696。6)核磁共振氢谱和碳谱，以及碳氢远程相关谱数据，如下表表l假胶素A的"CNMR(125MHz)、^NMR(S00MHz)和HMBC数据(溶剂DMSO-d6，单位ppm)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>另一方面，本发明涉及一种假胶素A的分离和纯化方法，其特征在于该方法包括以下步骤a.以杨树胶为原料进行分离；b.使用乙醇初步提纯杨树胶；C.使用聚酰胺柱层析分离；d.使用硅胶柱层析分离；e.使用葡聚糖凝胶LH-20纯化；f.甲醇重结晶。(1)假胶素A的分离原料是杨树胶。杨树(Poplar)是杨柳科(Salicaceae)杨属(Populus)植物落叶乔木的通称。杨树胶是用杨树的树芽熬制压滤所得到的树胶，是目前市场上非常容易买到的常见的假蜂胶。本案所使用的杨树胶的样品现存于两个申请单位的冷冻库中。(2)将杨树胶和蜂胶的高效液相(HPLC)色谱图进行对比，在杨树胶和蜂胶样品的图谱中，对应于保留时间12.5min处，杨树胶图谱中多一个色谱峰。色谱工作条件BWAICLC98II系统，P98II泵，UV98I紫外检测器，Kromasil5微米C18柱，4.6x250mm,甲醇:水:磷酸(50:50:0.25v/v/v)，检测波长296nm，流速1.0mL/min。见图1-2:(3)假胶素A的分离和结构鉴定。对500克杨树胶用乙醇初步提纯，除去机械杂质，回收乙醇；初提物进行聚酰胺柱层析(80-100目，2千克，水/甲醇梯度洗脱)，每次1L收集洗脱液，用HPLC分析跟踪化合物A所在的部分，合并，回收溶剂；得到的含化合物A的部分用硅胶柱层析(100-120目，l千克，氯仿/甲醇梯度洗脱)分离，用HPLC分析跟踪化合物A所在的部分，合并，回收溶齐[J;得到化合物A约100mg;用葡聚糖凝胶(LH-20，200克，甲醇洗脱)纯化，用HPLC分析跟踪化合物A所在的部分，合并回收溶剂；甲醇重结晶，得到纯的化合物A约50mg。根据化合物A的紫外光谱、红外光谱、质谱和核磁共振等光谱分析，化合物的结构获得鉴定，如上图1所示。文献检索证实，该化合物未经报道，为新化合物，命名为假胶素A。另外，本发明还涉及假胶素A在测定蜂胶中杨树胶掺入量的应用。本发明建立了可实施的具体技术方法，使得上述技术问题得到完全解决。技术方法的要点是使用化学分析的方法，尤其首选高效液相分析的方法。首先测定假胶素A在杨树胶中的平均含量，然后测定其在掺假蜂胶中的含量，就可以计算出蜂胶中杨树胶的掺入量。最后，本发明还涉及一种测定蜂胶中杨树胶掺入量的方法，其特征在于通过化学分析，优选高效液相分析，分别测定假胶素A在杨树胶中的平均含量，和其在掺假蜂胶中的含量，就可以计算出蜂胶中杨树胶的掺入量。本发明通过详细的指纹图谱对比研究，终于发现并分离纯化鉴定了假胶素A。研究证实假胶素A在天然蜂胶中不存在，而在杨树胶中普遍稳定存在，含量为1.25%左右。因此假胶素A可以作为标志性化合物，通过测定其在掺假蜂胶中的含量，就可以计算出杨树胶的掺入量。图1为蜂胶HPLC图谱。图2为杨树胶的HPLC图谱。图3为对照品(A)、杨树胶一ltf(B)、蜂胶(YD004，北京顺义)(C)的HPLC色谱图具体实施例方式下面的实施例主要介绍一种最常用的技术实施方案，使得本领域的专业人员更好地理解本发明的实际应用。但是具体可实施的方案可以有多种，不受本实施例的限定。实施例HPLC法测定蜂胶、杨树胶和掺假蜂胶中假胶素A的含量1)材料与方法1.1材料1.1.1假胶素A对照品用杨树胶经柱色谱分离、纯化、重结晶得到。1.1.2被测样品10份蜂胶样品来源见表2;2份杨树胶、4份掺假蜂胶由农业部蜂产品检测(北京)中心提供。1.2主要仪器与试剂1.2.1仪器。高效液相色谱仪(BWAICLC98II系统，P98II泵，UV98I紫外检测器)；KromasilC18(4.6mmX250mm5um);超声波清洗仪(KQ-100B)。1.2.2试剂。甲醇，色谱纯(天津四友)；分析纯(北京化工厂)；水(娃哈哈纯净水)1.3色谱条件流动相为甲醇:水:磷酸(50:50:0.25v/v/v);流速1mL/min，检测波长296nm，外标法定量分析。1.4溶液的制备1.4.1对照品溶液。精确称取假胶素A对照品1.08mg，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解，摇匀，配制成含假胶素A浓度为108ug/mL的对照品溶液。1.4.2样品溶液。准确称取蜂胶样品O.lg，置于10mL容量瓶中，加入适量甲醇超声提取40min，用甲醇定容，摇匀后精密量取lmL置于10mL容量瓶中，定容摇匀。取lmL用O.45nm微孔滤膜过滤，得样品溶液。2)结果与分析2.1线性关系实验精密量取125uL、100uL、75uL、50uL、25uL、2uL分别定容至lmL，并编号为l，2，3，4，5，6待测。按1.3色谱条件，取对照品10uL平行3次进样分析，保留时间在12.5min。取其面积平均值得到面积平均值S与进样量X的方程S二1991937X-923.782R2=0.9999，表明对照品假胶素A的进样量在0.00216ug—O.135tig范围内时，线性关系良好。2.2精密度试验精确吸取假胶素A对照品溶液10uL进样，重复6次，测得化合物A峰面积相对标准偏差(RSD)为O.79%(n二6)，说明方法和仪器精密度良好。2.3方法重现性试验取同一批蜂胶样品5份，按"1.4"方法制备样品溶液，吸取10uL进样分析，测得假胶素A的峰面积RSD为1.16X(r^5)，说明重现性好。2.4稳定性试验精确吸取假胶素A对照品溶液10uL进样分析，然后分别于0、2、4、8h时重复l次，测得假胶素A的峰面积的RSD为0.99X，表明样品溶液在8h内稳定。2.5加样回收率试验准确称取已知含量的样品溶液五份，每份100uL，加入到lmL定量瓶内；再取对照品溶液五份(浓度10.8ug/mL)，每份100wL分别加入，上述各瓶内，精密定溶至lmL，按选定的色谱条件测定，计算回收率，结果为103.6%，RSD为1.37X。2.6样品测定取不同的杨树胶、掺假胶、不同地区的蜂胶样品，按"1.4"方法配制样品溶液，精确吸取10uL进样分析，平行3次，测定样品中假胶素A的峰表2不同种蜂胶假胶素A含量样品名称产地假胶素A含量(％)RSD(%)杨树胶一1#1.3310.32杨树胶一2#1.1740.33掺假蜂胶一1#0.68280.76掺假蜂胶一2#0.48180.41掺假蜂胶一3#0.36970.38掺假蜂胶一賴0.1350.10蜂胶YD001吉林集安蜂胶YD002北京昌平蜂胶YD003河北保定蜂胶YD004北京顺义蜂胶YD005吉林辽源蜂胶YD006河北地区蜂胶YD007辽宁西部蜂胶YD008山东中部蜂胶YD009河南南部蜂胶YDOIO山东高唐3)测定结果讨论采用RP-HPLC法，以甲醇:水:磷酸(50:50:0.25v/v/v)为流动相，外标法测定蜂胶中假胶素A含量，方法简便、快速、可靠，可作为蜂胶中假胶素A含量的定量分析方法。含量测定结果表明蜂胶与杨树胶中的假胶素A物质含量差异很大。杨树胶中假胶素A的平均含量大约在1.25%左右；正品纯蜂胶中假胶素A的含量都不在检测限度内，也就是不可检出。对上述测定结果，以下面第4)条中所列的公式进行计算，可以判定掺假蜂胶一1#、掺假蜂胶一2#、掺假蜂胶_3#和掺假蜂胶一4#中分别被掺入54.6%、38.5%、29.6%和10.8%的杨树胶。4)掺假蜂胶中杨树胶掺入量(重量百分比)的计算公式X=(Z/Y)*100%其中X二掺假蜂胶中的杨树胶掺入量(重量百分比)Y二杨树胶中的假胶素A平均含量(重量百分比)Z一参假蜂胶中的假胶素A含量(重量百分比)权利要求1.一种从杨树胶中分离出来的化合物4-甲氧基-2，6-二羟基-2-苄基-[2，3-二氢-苯并呋喃-3-酮]，其分子式是C16H14O5，化学结构式是2.—种分离纯化制备如权利要求1所述化合物的方法，其特征在于该方法包括以下步骤a.以杨树胶为原料进行分离；b.使用乙醇初步提纯杨树胶；c.使用聚酰胺柱层析分离；d.使用硅胶柱层析分离；e.使用葡聚糖凝胶LH-20纯化；f.甲醇重结晶。3.如权利要求1所述化合物在鉴定样品蜂胶中是否被掺入了杨树胶和确定杨树胶掺入量的应用，其特征在于通过测定掺假蜂胶中该化合物的含量，并与杨树胶中的该化合物的平均含量相比较，计算确定掺假蜂胶中杨树胶的掺入量。4.一种测定蜂胶中杨树胶掺入量的方法，其特征在于通过化学分析，分别测定如权利要求1所述的化合物在杨树胶中的平均含量，和其在掺假蜂胶中的含量，从而计算出蜂胶中杨树胶的掺入量。5.如权利要求4所述的测定蜂胶中杨树胶掺入量的方法，其特征在于其中的化学分析为高效液相分析。全文摘要本发明涉及一种从杨树胶中分离出来的化合物“假胶素A”，即“4-甲氧基-2，6-二羟基-2-苄基-[2，3-二氢-苯并呋喃-3-酮]”，其分子式是C<sub>16</sub>H<sub>14</sub>O<sub>5</sub>，化学结构式如图，及其分离方法和其在测定蜂胶中杨树胶掺入量的应用。文档编号G01N30/00GK101108841SQ20071011121公开日2008年1月23日申请日期2007年6月18日优先权日2007年6月18日发明者垚南,周立东,周金慧,孟庆伟,熠李,薛晓峰,静赵,伽郭申请人:中国农业科学院蜜蜂研究所;中国医学科学院药用植物研究所