白藜芦醇在制备人类免疫缺陷病毒糖蛋白120诱导神经病理痛药物中的应用的制作方法

本发明涉及HIV gp120诱导神经病理痛药物用途发明领域，尤其是涉及白藜芦醇可用于在制备降低HIV gp120诱导的神经病理痛的药物中的应用，其作用机理涉及抑制背根神经节嘌呤2X(P2X)₇受体介导的痛觉信息传递。

背景技术：

人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染常常引起各种神经系统相关疾病，导致神经系统功能障碍，严重威胁生命。伴随着疾病的发展，HIV感染患者常常伴有外周神经病变，包括末梢感觉功能障碍，进一步可丧失行走功能。研究表明可能是背根神经节(dorsal root ganglia,DRG)的损伤导致HIV感染并发周围神经病变。糖蛋白(glucoprotein120,gp120)是暴露在HIV病毒表面的一种结构蛋白。已证实gp120与HIV感染所致相关病变有关，还可引起DRG神经细胞和Schwann细胞凋亡。HIV外层的gp120识别并且浸染宿主细胞，可通过小胶质细胞和巨噬细胞释放神经毒素和炎性因子，损伤神经元。gp120直接兴奋初级感觉传入神经元，导致痛觉过敏。短暂置gp120于坐骨神经或鞘内注射重组gp120导致动物机械痛和热痛过敏。

疼痛它是人类共有而个体差异很大的一种不愉快的感觉，它伴随着大多数疾病。根据疼痛时程可将疼痛分为急性痛(生理性痛)和慢性痛(病理性痛)，其中慢性痛包括炎症痛、神经病理痛(neuropathic pain,NPP)、癌症痛。由于慢性痛的发病机制尚未阐明，导致其很难治愈。HIV感染并发的神经病理痛有自发痛和诱发痛。HIV并发外周神经病理性损伤常常表现为感觉神经病变，30％的艾滋病感染者收其影响。发病率高、发病制剂不明确导致HIV感染并发神经病理痛治疗极为困难，所以亟待解决。

三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate,ATP)是重要能量物质。Burnstock在上世纪70年代初提出“嘌呤能神经学说”后，作为神经递质的ATP研究工作倍受关注。嘌呤类物质包括三磷酸腺苷(ATP)及代谢产物二磷酸腺苷/一磷酸腺苷(ADP/AMP)和腺苷等均参与信息传递。目前普遍认为ATP是外周和中枢神经系统的递质。根据对腺苷和ATP的选择性亲和力不同将“嘌呤受体”(purinoceptor)区分为P1和P2受体两大类型。P2嘌呤受体又分为配体门控离子通道型(P2X)和G-蛋白偶联代谢型(P2Y)受体。已有7种P2X受体亚型(分别是P2X₁、P2X₂、P2X₃、P2X₄、P2X₅、P2X₆、P2X₇)，和9种哺乳动物的P2Y受体亚型(分别是P2Y₁、P2Y₂、P2Y₄、P2Y₆、P2Y₁₁、P2Y₁₂、P2Y₁₃、P2Y₁₄、P2Y₁₅)被克隆出来。研究表明P2X₇受体涉及神经病理性痛。损伤神经时可释放出大量的细胞炎性因子，ATP可激活P2X₇受体，与细胞炎性因子和其它炎症介质共同作用介导神经病理痛。

白藜芦醇(Resveratrol，Res)是一类主要存在于葡萄皮、百合科、蓼科、豆科、花生和多种药用植物中的一种多酚类化合物。白藜芦醇(Res)化学名为3,5,4'-三羟基二苯乙烯(3,5,4'-trihydroxystilbene)，是一种植物天然活性成分。白藜芦醇具有广泛的药理作用，可抗菌、抗肿瘤、抗炎、抗过敏、降血抗氧化、调节免疫以及保护心血管等，是一种重要的植物抗毒素。白藜芦醇对多种疾病状态下的损害可产生保护作用，已广泛地应用于医药、保健品、食品、化妆品等领域。

本实验通过HIV gp120诱导神经病理痛大鼠模型，观察白藜芦醇处理后HIV gp120诱导神经病理痛大鼠痛行为的变化，以及与介导神经病理痛的P2X₇受体表达变化的关系，为白藜芦醇用于HIV gp120诱导神经病理痛的预防和治疗提供帮助。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供白藜芦醇的第一个新用途，即白藜芦醇在制备防治HIV gp120诱导神经病理痛疾病药物中的应用。

本发明的第二个目的在于提供白藜芦醇的第二个新用途，即白藜芦醇在制备HIVgp120并发神经损伤疾病的药物中的应用。

本发明证实白藜芦醇可降低糖蛋白120神经病理痛大鼠背根神经节卫星胶质细胞P2X₇受体的表达，降低细胞炎性因子—肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β的表达，增加白细胞介素-10的表达，降低细胞外调节蛋白激酶的磷酸化以及胶质纤维酸性蛋白与P2X₇受体的共表达，抑制背根神经节的伤害性信息传递，减轻神经损伤及炎性物质的伤害剌激，减轻糖蛋白120神经病理痛大鼠的痛行为，可应用于制备人类免疫缺陷病毒糖蛋白120相关神经病理痛、人类免疫缺陷病毒糖蛋白120神经损伤相关疾病的药物。

附图说明

图1为HIV gp120诱导神经病理痛大鼠制模过程中的机械缩足反射阈值变化图。白藜芦醇能抑制HIV gp120诱导神经病理痛大鼠的机械痛行为。实验分组：对照组；HIV gp120大鼠模型组；HIV gp120大鼠模型+白藜芦醇处理组。其中^*p<0.05，^**p<0.01表示和对照组比较，^#p<0.05，^##p<0.01表示与HIV gp120大鼠模型组比较。

图2为HIV gp120诱导神经病理痛大鼠DRG的P2X₇受体real-time PCR检测结果图。白藜芦醇可降低HIV gp120诱导神经病理痛大鼠DRG上调的P2X₇mRNA表达水平。实验分组：对照组；HIV gp120大鼠模型组；HIV gp120大鼠模型+白藜芦醇处理组。其中^**p<0.01表示和对照组比较，^##p<0.01表示与HIV gp120大鼠模型组比较。

图3为HIV gp120诱导神经病理痛大鼠DRG的P2X₇受体蛋白印迹检测结果图。白藜芦醇处理后可降低HIV gp120诱导神经病理痛大鼠DRG上调的P2X₇受体蛋白表达水平。实验分组：对照组；HIV gp120大鼠模型组；HIV gp120大鼠模型+白藜芦醇处理组。图3(a)为蛋白印迹实验结果图，图3(b)为实验数据分析比较柱状图，其中^**p<0.01表示和对照组比较，^##p<0.01表示与HIV gp120大鼠模型组比较。

图4为HIV gp120诱导神经病理痛大鼠DRG的P2X₇受体与卫星胶质细胞标志物GFAP的免疫荧光双标结果图。大鼠手术侧背根神经节P2X₇受体和GFAP存在共表达。白藜芦醇处理后可降低HIV gp120诱导神经病理痛大鼠DRG上调的P2X₇受体与GFAP共表达水平。实验分组：对照组；HIV gp120大鼠模型组；HIV gp120大鼠模型+白藜芦醇处理组。标尺为100μm。

图5为HIV gp120诱导神经病理痛大鼠DRG的TNF-α受体蛋白印迹检测结果图。白藜芦醇处理后可降低HIV gp120诱导神经病理痛大鼠DRG上调的TNF-α受体水平。实验分组：对照组；HIV gp120大鼠模型组；HIV gp120大鼠模型+白藜芦醇处理组。图5(a)为蛋白印迹实验结果图，图5(b)为实验数据分析比较柱状图，其中^**p<0.01表示和对照组比较，^##p<0.01表示与HIV gp120大鼠模型组比较。

图6为HIV gp120诱导神经病理痛大鼠DRG的IL-1β蛋白印迹检测结果图。白藜芦醇处理后可降低HIV gp120诱导神经病理痛大鼠DRG上调的IL-1β表达水平。实验分组：对照组；HIV gp120大鼠模型组；HIV gp120大鼠模型+白藜芦醇处理组。图6(a)为蛋白印迹实验结果图，图6(b)为实验数据分析比较柱状图，其中^**p<0.01表示和对照组比较，^##p<0.01表示与HIV gp120大鼠模型组比较。

图7为HIV gp120诱导神经病理痛大鼠DRG的IL-10蛋白印迹检测结果图。白藜芦醇处理后可升高HIV gp120诱导神经病理痛大鼠DRG下调的IL-10表达水平。实验分组：对照组；HIV gp120大鼠模型组；HIV gp120大鼠模型+白藜芦醇处理组。图7(a)为蛋白印迹实验结果图，图7(b)为实验数据分析比较柱状图，其中^**p<0.01表示和对照组比较，^##p<0.01表示与HIV gp120大鼠模型组比较。

图8为HIV gp120诱导神经病理痛大鼠DRG的ERK1/2蛋白印迹检测结果图。白藜芦醇处理后可降低HIV gp120诱导神经病理痛大鼠DRG上调的ERK1/2磷酸化水平。实验分组：对照组；HIV gp120大鼠模型组；HIV gp120大鼠模型+白藜芦醇处理组。图8(a)为蛋白印迹实验结果图，图8(b)(c)为实验数据分析比较柱状图，其中^**p<0.01表示和对照组比较，^##p<0.01表示与HIV gp120大鼠模型组比较。

图9为白藜芦醇对HEK293细胞转染的P2X₇受体ATP激活电流影响结果图。白藜芦醇可以抑制HEK293细胞转染的P2X₇受体ATP激活电流。实验分组：ATP对照组；ATP+白藜芦醇处理组。图9(a)分ATP、ATP+白藜芦醇处理激活电流实验结果图，图9(b)为白藜芦醇抑制浓度效应曲线，其中^*p<0.05表示和单独用ATP比较。

具体实施方式

下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。

实施例1。

用本技术领域公知的方法，制成适用于HIV gp120诱导神经病理痛治疗的口服或注射的白藜芦醇制剂。

实施例2。

用本技术领域公知的方法，制成适用于涉及HIV gp120并发神经损伤相关疾病治疗的口服或注射的白藜芦醇制剂。

实施例3。

用本技术领域公知的方法，制成适用于涉及HIV gp120并发感觉神经炎性相关疾病治疗的口服或注射的白藜芦醇制剂。

总之，白藜芦醇以口服、注射、含片或其它局部或全身用药剂型药物进行上述疾病防治。

为了更好地理解本发明的实质，下面以白藜芦醇对P2X₇受体介导的相关疾病治疗作用研究的实验和结果来证明白藜芦醇的用途。

一、材料和方法。

1.动物和分组。

南昌大学医学院实验动物科学部提供30只200g Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠。适应一周后随机分为3组，每组10只：假手术对照组；HIV gp120模型组；HIV gp120模型+白藜芦醇处理组，分别标记，自由饮食饮水。建立应用gp120于坐骨神经的神经病理痛模型：(1)用10％水合氯醛麻醉大鼠；(2)备皮，消毒，切开左侧腿弯凹陷皮肤，使坐骨神经暴露，注意不要损伤到神经；(3)将2×6mm的氧化纤维素膜浸泡于250μl浓度为0.1％的大鼠血清白蛋白(Rat Serum Albumin，RSA)生理盐水溶液中，其中含有200ng gp120，对于假手术对照组，则在浓度为0.1％的RSA生理盐水溶液中浸泡；(4)将浸泡过的纤维素膜宽松的缠绕坐骨神经三根分叉部，约有3-4mm的神经被缠绕，注意不要压迫神经；(5)缝合肌肉和皮肤切口，用碘伏消毒伤口。

从手术后第1天到手术后两周，每天向HIV gp120+白藜芦醇组腹腔注射白藜芦醇(30mg/kg)。同时，对照组和HIV gp120模型组在注射相同体积生理盐水。保持每次给药时间一致。两周后处死大鼠取标本(L4-L6段背根神经节)。

2.药物与试剂。

白藜芦醇(南京泽朗公司)，兔源性P2X₇、TNF-α、IL-1β、IL-10抗体(Abcam公司)，兔源性ERK1/2、p-ERK1/2抗体(CST公司)，小鼠源性GFAP抗体(Millipore公司)。

3.主要仪器。

消毒纱布、手巾、棉签等，碘酒及75％酒精，手术器械包：剪刀、眼科小弯镊、血管钳、丝线、有齿镊等。

4.大鼠行为学测定。

分别于第0，1，4，7，10，12，14天测量各组大鼠机械缩足反射阈值(MWT)，每次测量的时间及其他条件保持一致。

机械痛敏阈值变化的检测方法：

机械缩足反射阈值的检测：采用的装置为BME-404电子机械刺激器(中国医学科学院生物医学工程研究所,天津,中国)。该设备的主要参数如下：尖端直径测试针0.6mm，压力测量范围0.1-50g和压力测量分辨率0.05g。大鼠放入规格为25cm×15cm×25cm以小孔铁丝网为底的无色透明亚克力盒中，静置30分钟以上使之达到稳定的静息状态，此装置稍高于操作平台，以便看清大鼠足底，方便操作。手术侧(左侧)后肢足底表面垂直接触测试针，直到大鼠抬起左下肢，压力值被电脑软件自动记录。每只大鼠测量5次(间隔时间≥5分钟)，所测的平均值即为机械痛敏阈值。

5、实时定量-聚合酶链式反应(Real-time PCR)。

(1)提取总RNA并逆转录成cDNA：所有器械均经DEPC处理。在第14天取材，分别取各组大鼠背根神经节，用DEPC处理过的PBS冲洗，置于RNA Store液中﹣20℃保存，提取RNA时将神经节取出移至加有1ml Trizol匀浆器中，研磨后转移到1.5ml的无核酶离心管中，加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，静置3min,，低温离心12000g×15min,收集上层无色液相，加入与液相等体积的异丙醇，混匀，常温静置25min，沉淀RNA，之后4℃离心12000g×10min，弃上清，在管底可见少许白色沉淀为RNA，加入1ml无核酶水配置的75％乙醇，充分洗涤RNA。4℃离心5000g×3min后，吸弃上清液，倒置2分钟，略干燥(切勿过分干燥，否则RNA不溶于水)，加20μl无RNase水溶解沉淀。采用50μl逆转录反应体系：无核酶水11.75μl，5×buffer 10μl，dNTP 3μl，Olig DT 2μl，MMLV 2μl，Rnasin 1.25μl，RNA样本20μl，共50μl，离心，恒温37℃水浴1小时。

(2)设计引物：参考文献设计P2X₇受体引物序列。本发明选用β-actin作为标准内参，引物序列分别为：

(3)实时定量-聚合酶链式反应反应体系(共20μl)：

(4)聚合酶链式反应反应条件：

(5)分析数据。用β-actin作为内参对P2X₇受体表达进行标化处理。

6、蛋白印迹。

(1)蛋白提取：将DRG置于加有200μl组织裂解液(含蛋白酶抑制剂)的1ml匀浆器中，于冰上研磨充分。冰上静止30min，将匀浆样品转移到1.5ml EP管中，4℃，14000g离心15min，取上清，按比例加入6×loading buffer，混匀后煮沸5min，使蛋白变性，-20℃保存，备用。

(2)十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。

制备SDS-PAGE凝胶，所用试剂如下表：

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳构成(ml)

(3)上样及电泳：每孔上样量为25μl(蛋白含量约为20μg)，样本两边加3μl蛋白Marker。浓缩胶恒压60V，分离胶90V，待溴酚蓝迁移至胶的下缘时停止电泳。

(4)转膜：根据蛋白Marker的指示和目的蛋白的分子量准备合适大小的PVDF膜和2张4层的滤纸，PVDF膜用甲醇激活后，放入转膜缓冲液中(滤纸置于转膜缓冲液中)浸泡以备用。电泳完毕后转膜，300mA转膜2个小时。

(5)免疫反应。

A)封闭：将膜置于含5％脱脂牛奶的TBST封闭液中，水平摇床室温作用2h。

B)一抗结合：将膜放入用5％脱脂牛奶配制的一抗(兔来源的P2X₇、TNF-α、IL-1β、IL-10、ERK1/2、p-ERK1/2稀释比例1:1000，小鼠抗β-actin单抗稀释比例1:800)中，4℃过夜，或室温平摇3h，TBST洗膜3次。

C)二抗结合：将膜用IgG-HRP二抗反应液(P2X₇、TNF-α、IL-1β、IL-10、ERK1/2、p-ERK1/2二抗为山羊抗兔，按1:2000溶于封闭液，β-actin为山羊抗小鼠，按1：2000溶于封闭液)孵育，室温平摇1.5h后，TBST洗膜10min×3次。

D)免疫复合物的检测：膜加ECL发光剂反应3min后，用保鲜膜包裹，置于X线暗盒，暗室中剪大小合适X线胶片，曝光10s～10min，显影、定影，

(6)半定量分析：胶片扫描后，通过Image图像分析软件分析目的条带在的光密度值，以各组β-actin条带的光密度值标化其相应组P2X₇、TNF-α、IL-1β、IL-10、ERK1/2、p-ERK1/2的蛋白表达量。

7、免疫荧光双标。

从大鼠分离的背根神经节(DRG)用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤后用4％多聚甲醛(PFA)固定24小时，20％蔗糖4℃过夜脱水。用冰冻切片机将神经节切位厚度为10μm的切片。用PBS洗涤后三次，将切片在37℃下用10％正常山羊血清预孵育40分钟，然后孵育兔源性抗体P2X₇(1:500)和鸡抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)(1：500，Abcam)在PBS中稀释过夜4℃。在PBS中漂洗三次后，孵育切片用山羊抗鸡FITC和山羊抗兔TRITC荧光二抗(1:200)37℃孵育40分钟。在PBS中洗涤三次后，切片用甘油固定并用荧光显微镜检测。对于阴性对照组，正常山羊血清和PBS代替一抗。

8、HEK293细胞转染。

HEK 293细胞用含有10％FBS、1％青霉素和链霉素的DMEM培养基培养于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中。根据Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂说明书对人源性的pcDNA3.0-EGFP-P2X₇质粒进行转染。当HEK293细胞长满70-80％时，转染前2小时将细胞培养基更换为Opti-MEM无血清培养基。转染步骤如下：(a)将4μg质粒DNA稀释到终体积为250μl Opti-MEM中；(b)10μl Lipofectimine2000加入终体积为250μl的Opti-MEM中；(c)将含有Lipofectamine的溶液与含质粒的溶液混合，并在室温下孵育20分钟。随后，向每个孔中加入cDNA/Lipofectamine混合溶液。细胞在37℃，5％CO₂下孵育6小时。孵育后，细胞培养基换成含有10％FBS的DMEM并孵育24-48小时。GFP荧光检测转染效率。全细胞膜片钳记录转染后1-2天进行。

9、电生理电流记录。

应用全细胞膜片钮技术记录全细胞电流。所用微电极用两步拉制法制成，微电极充灌电极液后电阻在2-10MΩ之间。电流信号经Axopatch 200B膜片甜放大器、Digidata 1440A及Clampex10.3采集和分析。调节微操纵器使微电极尖端接近细胞表面，并对微电极内施加一负压，形成高阻封接(1-10GΩ)，置钳制电压于-60mV，吸破细胞膜。移动微操纵器上的加药装置排管，不同药物的传送依赖于重力流的作用，每管直径(I.D)为0.2mm，管口距记录细胞100μm左右，然后分别加入需要的药物。表达绿色荧光的单个HEK293细胞表明其表达P2X₇受体。电极内液成分为(mM)：K gluconate 145，EGTA 0.75，HEPES 10，CaCl₂ 0.1，MgATP 2，Na₃GTP 0.3。用KOH调节pH到7.2。细胞外液成分为(mM)：NaCl 126，KCl 2.5，glucose 10，MgCl₂ 1.2，CaCl₂ 2.4，NaHCO₃ 18。用NaOH调节pH到7.4。

10、统计学方法。

应用SPSS统计软件对实验数据进行分析,结果以均数±标准差表示，各组之间差异性采用方差分析，组间比较采用LSD法，p<0.05表示有显著性差异，p<0.01为极显著差异。

二、结果。

(一)行为学结果。

各组大鼠造模中均未见肢体运动障碍和自残现象。造模前测定各组间机械缩足反射阈值的基础值差异无显著性(p>0.05)。

机械痛敏(MWT)测定结果。

Gp120大鼠神经病理痛模型的机械缩足反射潜伏期测定结果显示，在术后4天到14天，模型组与对照组相比，手术侧机械痛反应阈值明显降低(p<0.05)，其中术后7天到14天降低更明显(p<0.01)。模型+白藜芦醇处理组与模型组相比，手术侧机械痛反应阈值明显升高(p<0.05)，其中术后12天到14天升高更明显。(见图1)。

(二)实时定量-聚合酶链式反应(Real-time PCR)。

P2X₇受体表达。

P2X₇的Real-time PCR结果表明：gp120模型组DRG中P2X₇受体mRNA表达水平明显高于对照组(p<0.01)，gp120模型+白藜芦醇处理组明显低于模型组(p<0.01)。(见图2)。

(三)蛋白印迹。

1、P2X₇蛋白印迹结果。

P2X₇蛋白印迹结果表明：gp120模型组DRG中P2X₇受体表达水平较对照组明显增加(p<0.01)；gp120模型组+白藜芦醇处理组P2X₇受体蛋白的表达低于模型组(p<0.01)(见图3)。

2、TNF-α蛋白印迹结果。

TNF-α蛋白印迹结果表明：gp120模型组DRG中TNF-α受体表达水平高于对照组(p<0.01)；gp120模型组+白藜芦醇处理组TNF-α受体蛋白的表达低于模型组(p<0.01)(见图5)。

3、IL-1β蛋白印迹结果。

IL-1β蛋白印迹结果表明：gp120模型组DRG中IL-1β表达水平较对照组明显增加(p<0.01)；gp120模型组+白藜芦醇处理组IL-1β蛋白的表达低于模型组(p<0.01)(见图6)。

4、IL-10蛋白印迹结果。

IL-10蛋白印迹结果表明：gp120模型组DRG中IL-10表达水平较对照组明显降低(p<0.01)；gp120模型组+白藜芦醇处理组IL-10蛋白的表达高于模型组(p<0.01)(见图7)。

5、ERK1/2蛋白印迹结果。

ERK1/2蛋白印迹结果表明：gp120模型组DRG中ERK1/2磷酸化水平较对照组明显增加(p<0.01)；gp120模型组+白藜芦醇处理组ERK1/2磷酸化水平低于模型组(p<0.01)(见图8)。

(四)免疫荧光双标。

免疫荧光双标结果表明：gp120模型组DRG中P2X₇受体与GFAP的共表达水平与对照组比较明显着升高。P2X₇受体与GFAP的共表达水平在gp120模型组+白藜芦醇处理组明显低于模型组。标尺100μm(见图4)。

(四)全细胞膜片钳。

全细胞膜片钳结果表明：白藜芦醇可浓度依赖性抑制HEK293细胞P2X₇受体ATP激活电流(见图9)。

发明人研究发现白藜芦醇可降低HIV gp120模型组DRG中P2X₇的表达水平，同时观察到白藜芦醇升高HIV gp120模型组大鼠的机械痛阈值，表明白藜芦醇可缓解HIV gp120模型组神经病理大鼠的痛行为。白藜芦醇处理后下调HIV gp120模型组大鼠背根神经节P2X₇受体表达的同时，还降低细胞炎性因子—肿瘤坏死因子(TNF-α)和白细胞介素(IL-1β)的含量，增加抗细胞炎性因子—白细胞介素(IL-10)的含量，降低ERK1/2磷酸化水平。因此，白藜芦醇可能是通过减少TNF-α、IL-1β的释放，增加IL-10的释放，降低ERK1/2磷酸化水平，降低HIV gp120神经病理大鼠背根神经节P2X₇受体的表达，抑制背根神经节P2X₇受体介导的伤害性信息传递，减轻HIV gp120神经病理痛大鼠的痛行为。