含有HPV病毒的致癌基因表达抑制物质作为活性成分的癌细胞致敏用组合物的制作方法

本发明涉及含有hpv病毒的致癌基因表达抑制物质作为活性成分的癌细胞致敏用组合物，更具体来说涉及用于hpv感染诱发的癌症治疗中使用的放射线致敏用组合物，该组合物包括从序列号1至序列号10组合的群中选择的任意一种核酸序列的寡核苷酸作为活性成分。

背景技术：

本申请主张基于2015年5月12日韩国专利申请第10-2015-0066218号的优先权，同时，该说明书所有内容都作为本说明书的参考文献。

高危型(high-risk)人类乳头瘤病毒(humanpapillomavirus:以下简称hpv)16、18型是引起宫颈癌和宫颈不典型增生的主要原因，也是引起其他生殖器官癌症和头部及颈部鳞状细胞癌的原因。宫颈癌是女性恶性肿瘤中最常见的种类之一。浸润性宫颈癌的发病率在缓慢下降，但对于发展中国家的所有女性来说，仍是最频发的癌症，占女性癌症的25％。hpv是可以引起良性、恶性肿瘤的小dna病毒，包含大约8,000多个碱基序列。目前根据基因组的不同，确认了100多种hpv的亚型，其中大约90多种hpv的基因型已被完全分析出来。这些种类中，高危型(high-risk)hpvtype(如hpv-16、18、31、33、35、45、51、52、56)与近90％的宫颈癌有关。感染hpv的宫颈癌中，50％以上与hpv16型有关，其次与hpv18型(12％)、hpv45型(8％)、hpv31型(5％)有关。这些hpv将两种致癌性蛋白质e6和e7编码化。这些蛋白质都与由hpv介导的、细胞永生化与细胞特性转换有关。致癌性e6蛋白质与野生型p53肿瘤抑制蛋白质结合，通过泛素途径分解p53。

同时，e7蛋白质直接与rb结合进行过磷酸化。首先，e6与e3泛素-蛋白连接酶(ubiquitin-proteinligase)即e6-ap(e6-associatedprotein)形成复合体。然后，e6/e6-ap复合体与野生型p53结合进行泛素化，妨碍由p53介导的、对于dna损伤的细胞反应。p53肿瘤抑制蛋白质，主要以mdm2介导的泛素化调节，但对于感染hpv的宫颈癌细胞，p53的分解从mdm2介导被完全替换为以e6介导的泛素化。因此，与其他癌症不同，感染hpv的宫颈癌几乎都有野生型p53基因。但由于一直被e6蛋白质分解，因此p53蛋白质的表达水平很低。尤其，hpve6蛋白质作为只能杀死宫颈癌细胞的特定靶备受瞩目。以e6及e6/e6-ap复合体作为靶的战略包括多种治疗方法。

如细胞毒素药的使用、放出病毒的e6致癌性蛋白质的锌抑制剂、模拟e6-ap的模拟表位(mimotope)、抗-e6核酶、将病毒的e6致癌性蛋白质作为靶的肽适体、将病毒的e6致癌基因作为靶的sirna以及这些的并用处理等。最近，证明了sirna不仅在动物细胞内可以选择性地使内部基因沉默，还可以在病毒引起的疾病中选择性地使病毒基因沉默。sirna的特性转染引起rna干扰(rnai)作为新的治疗人类病毒感染的治疗方法登场。在hpv感染的宫颈癌细胞中，以e6和e7的基因作为靶的sirna可以引起p53和prb积累，由此可以引起细胞凋亡(apoptosis)或细胞老化。被hpv-16感染的宫颈癌细胞株和被hpv-18感染的宫颈癌细胞株中发现，以病毒的e6和e7的基因作为靶的rnai可以选择性地使其蛋白质表达沉默。

技术实现要素：

因此，本发明者们为了找到进行放射线疗法时可以同时处理从而达到提升效果的、对e6/e7具有特异性的sirna付出了努力，确认使用从序列号1到序列号10组合的群中选择的义寡核苷酸及与上述序列可互补结合的反义寡核苷酸进行杂交形成的sirna，在进行放射线疗法时并用治疗，显示出比单一治疗显著提升的效果，完成本发明。

因此本发明的目的是提供用于hpv(humanpapillomavirus)感染诱发的癌症放射线治疗的致敏用组合物，该组合物包括从序列号1至序列号10组合的群中选择的任意一种核酸序列的寡核苷酸作为活性成分。

本发明的另一个目的是，提供用于hpv(humanpapillomavirus)感染诱发的癌症放射线治疗的致敏剂，包括从序列号1至序列号10组合的群中选择的任意一种核酸序列的寡核苷酸作为活性成分。

本发明的另一个目的是，提供为了制备用于hpv(humanpapillomavirus)感染诱发的癌症放射线治疗的致敏制剂的、包括从序列号1至序列号10组合的群中选择的任意一种核酸序列的寡核苷酸的用途。

本发明的另一个目的是，提供hpv(humanpapillomavirus)感染诱发的癌症放射线治疗的致敏方法，其特征是把包含从序列号1至序列号10组合的群中选择的任意一种核酸序列的寡核苷酸的组合物按照有效量投入到需要的个体中。

本发明的另一个目的是提供hpv(humanpapillomavirus)感染诱发的癌症放射线治疗方法。包括:

a.把包含从序列号1至序列号10组合的群中选择的任意一种核酸序列的寡核苷酸的组合物按照有效量投入到需要的个体中的步骤；及

b.对所述个体进行放射线治疗的步骤。

为了达到本发明的目的，本发明提供用于hpv(humanpapillomavirus)感染诱发的癌症放射线治疗的致敏用组合物，该组合物包括从序列号1至序列号10组合的群中选择的任意一种核酸序列的寡核苷酸作为活性成分。

为了达到本发明的另一个目的，本发明提供用于hpv(humanpapillomavirus)感染诱发的癌症放射线治疗的致敏剂，包括从序列号1至序列号10组合的群中选择的任意一种核酸序列的寡核苷酸作为活性成分。

为了达到本发明的另一个目的，本发明提供为了制备用于hpv(humanpapillomavirus)感染诱发的癌症放射线治疗的致敏制剂的、包括从序列号1至序列号10组合的群中选择的任意一种核酸序列的寡核苷酸的用途。

为了达到本发明的另一个目的，本发明提供hpv(humanpapillomavirus)感染诱发的癌症放射线治疗的致敏方法，其特征是把包含从序列号1至序列号10组合的群中选择的任意一种核酸序列的寡核苷酸的组合物按照有效量投入到需要的个体中。

为了达到本发明的另一个目的，本发明提供hpv(humanpapillomavirus)感染诱发的癌症放射线治疗方法。包括:

a.把包含从序列号1至序列号10组合的群中选择的任意一种核酸序列的寡核苷酸的组合物按照有效量投入到需要的个体中的步骤；及

b.对所述个体进行放射线治疗的步骤。

下面将对本发明进行详细说明。

本发明提供用于hpv(humanpapillomavirus)感染诱发的癌症放射线治疗的致敏用组合物(sensitizingcomposition)，该组合物包括从序列号1至序列号10组合的群中选择的任意一种核酸序列的寡核苷酸作为活性成分。

本发明还提供用于hpv(humanpapillomavirus)感染诱发的癌症放射线治疗的致敏剂，包括从序列号1至序列号10组合的群中选择的任意一种核酸序列的寡核苷酸作为活性成分。

所述放射线致敏用组合物或致敏剂是指治疗癌症时可以提高癌细胞对放射线的损伤敏感度从而提高治疗效果的组合物。即，抑制癌细胞对放射线的耐性，使放射线的癌细胞凋亡诱导更容易发生的组合物或制剂。

本发明中所述hpv感染诱发的癌症的特征是从宫颈癌、阴道癌(vaginacancer)、外阴癌(vulvacancer)、肛门癌(analcancer)、阴茎癌(peniscancer)、扁桃体癌(tonsilcancer)、喉咽癌(pharynxcancer)、喉癌(larynxcancer)、头颈(head&neck)癌、肺腺癌(lungadenocarcinoma)组合的群中选择，优选是宫颈癌，但不局限于此。

本发明中，所述寡核苷酸是以义寡核苷酸及与其互补的反义寡核苷酸进行互补杂交的sirna(smallinterferingrna)为特征，但不局限于此。本发明的所述sirna，正义链与反义链互相位于相反位置，形成双链结构。同时，本发明的sirna分子，可以是有自补(self-complementary)义链与反义链的单一链结构。

优选地，本发明提供的组合物其特征是所述寡核苷酸是以义寡核苷酸及与其互补的反义寡核苷酸进行互补杂交的sirna(smallinterferingrna)。

本发明中的所述寡核苷酸可以抑制hpv病毒的肿瘤性蛋白质e6及e7的表达。本发明的发明者在本发明之前，曾开发出可以与高危型(high-risk)人类乳头瘤病毒(humanpapillomavirus:以下简称hpv)16、18型的两种致癌性(oncogenic)蛋白质e6及e7特异性结合的sirna(参照韩国专利注册第10-1197627号)。

同时，伯特兰(bertrand)研究组表明，对于同一个靶基因，sirna与反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotide,aso)相比，体外和体内(invitro及invivo)的对mrna表达的抑制效果更加出色，可以较长时间持续维持效果(comparisonofantisenseoligonucleotidesandsirnasincellcultureandinvivo.biochem.biophys.res.commun.2002.296:1000-1004)。同时，sirna的作用机制是，与靶mrna互补结合，用序列特异方式来调节靶基因的表达，与原有的抗体基础的药品或化学物质(smallmoleculedrug)相比，可以适用的对象范围显著扩大(progresstowardsinvivouseofsirnas.moleculartherapy.200613(4):664-670)。

尽管sirna有所述出色的效果及多种适用范围，但sirna作为治疗制剂开发还存在需通过改善体内sirna的稳定性(stability)及改善细胞传达效率使sirna有效传达到靶细胞的课题(harnessinginvivosirnadeliveryfordrugdiscoveryandtherapeuticdevelopment.drugdiscovtoday.2006jan；11(1-2):67-73)。

为了解决所述问题，以改善体内稳定性为目的，把sirna的一部分核苷酸或骨架(backbone)变性使其具有核酸分解酵素抵抗性或利用载体如病毒性载体(viralvector)、脂质体、纳米颗粒(nanoparticle)等研究在积极开展中。

为了提高寡核苷酸在体内的稳定性，本发明提供赋予核酸分解酵素抵抗性及减少非特异性免疫反应的多种变性的(modification)寡核苷酸。所述寡核苷酸的变性指一个以上的核苷酸内糖结构的2′碳位置中oh基被置换为-ch3(甲基)、-och3(methoxy)、-nh2、-f(氟素)、-o-2-甲氧乙基、-o-丙基(propyl)、-o-2-硫乙基(methylthioethyl)、-o-3-氨丙基、-o-3-二甲基氨丙基、-o-n-甲基乙酰氨基或-o-二甲基氨基乙氧基的变性；核苷酸内糖(sugar)结构中氧被置换为硫；或核苷酸结合的硫代磷酸酯(phosphorothioate)、磷酸硼(boranophosphate)、甲基膦酸(methylphosphonate)结合的变性中选择的一种以上变性组合，也可使用pna(peptidenucleicacid)、lna(lockednucleicacid)或una(unlockednucleicacid)形态的变性(ann.rev.med.55,61-652004；us5,660,985；us5,958,691；us6,531,584；us5,808,023；us6,326,358；us6,175,001；bioorg.med.chem.lett.14:1139-1143,2003；rna,9:1034-1048,2003；nucleicacidres.31:589-595,2003；nucleicacidsresearch,38(17)5761？5773,2010；nucleicacidsresearch,39(5)1823？1832,2011)。优选地，本发明中的变性的碱基包括甲基化(methylation)、糖基化(glycosylation)及卤化(halogenation)组成的群中选择的一种以上的变性。更优先地，本发明中变性的碱基为2’-o甲基化(methylation)或2’-氟化(fluorination)的碱基。

2’-o甲基化表示与rna分子的核糖(ribose)的2号碳素结合的羟基被甲基化，变性为2’-甲氧基，2’-氟化表示与rna分子的核糖的2号碳素结合的羟基被置换为氟基，变性为2’-氟基。

根据本发明的优选实施例，本发明的核苷酸中2’-o甲基化(methylation)的碱基是u或者g。

根据本发明的优选实施例，本发明的核苷酸中2’-氟化(fluorination)的碱基是c。

根据本发明的实施例，本发明者们在之前发表的韩国注册专利第10-1197627号揭示的寡核苷酸上，转染2’-ome及/或者2’-f变性，制备了变性的sirnas。

根据本发明的一个实施例，对hpv18型阳性宫颈癌细胞株hela细胞及hpv16型阳性宫颈癌细胞株siha细胞，用化学变性的sirna进行处理，评价肿瘤细胞增殖抑制性和tp53、e6及e7蛋白质表达抑制性，结果显示本发明中的sirna都具有优秀的肿瘤细胞增殖抑制性，以及阻碍e6及e7蛋白质表达和增加tp53蛋白质表达的效果(实施例3到5)。同时，所述变性体的血清稳定性也非常优秀(实施例6)。

本发明的另一实施例中，评价了作为放射线疗法的致敏剂所述变性的sirna的效果。即并用含有序列号1到10的核酸序列的sirna与放射线疗法治疗宫颈癌细胞株，与单独使用放射线疗法相比，表现出更优秀的肿瘤细胞增殖抑制性、tp53蛋白质表达的诱导效果以及e7蛋白质表达抑制效果、细胞凋亡(apoptosis)诱发效果及细胞老化促进效果。通过这些结果可以确认，所述sirna变性体对于hpv病毒感染诱发的癌症治疗来说，作为放射线疗法的致敏剂，显示出了优秀的效果(实施例7到10)。

本发明中的含有序列号1到序列号10的核酸序列的寡核苷酸用于hpv感染诱发的癌症治疗的放射线疗法的并用疗法，它作为可以对放射线疗法的治疗效果极大化的致敏剂，发挥出优秀的效果。所述并用疗法是指，与放射线疗法依次或同时投入本发明中的放射线致敏用组合物的方法，所述依次是指放射线照射后投入致敏用组合物或投入致敏用组合物后进行放射线照射。也可以是在放射线照射1日后及2日后分两次投入致敏用组合物的方法，但不局限于此。

因此，本发明提供用于放射线治疗的致敏用组合物，其特征是与放射线治疗依次或同时投入。

本发明提供用于hpv(humanpapillomavirus)感染诱发的癌症的同步放化疗治疗(concurrentchemoradiationtherapy,ccrt)的致敏用组合物，该组合物包括从序列号1至序列号10组合的群中选择的任意一种核酸序列的寡核苷酸作为活性成分。

同步放化疗治疗(ccrt)与单纯放射线疗法相比总生存率和无病生存率提高，是局部宫颈癌的主要治疗方法。同步放化疗治疗具有可使放射线和抗癌剂的效果相互提升，可以缩短治疗时间，可以减少交叉耐性的可能性等优点。抗癌剂作为放射线致敏剂(radio-sensitiser)的作用较大，主要使用的药剂有cisplatin、5-fu及paclitaxel等。

本发明中的致敏用组合物，对于所述hpv感染诱发的癌症的同步放化疗治疗，显示出提高癌细胞对放射线及抗癌剂的损伤敏感度，使治疗效果极大化，同时还减少副作用的致敏效果。

本发明提供放射线致敏用组合物，其特征是包含序列号1和序列号2杂交的sirna分子以及序列号3和序列号4杂交的sirna分子。

本发明提供放射线致敏用组合物，其特征是包含序列号5和序列号6杂交的sirna分子、序列号7和序列号8杂交的sirna分子、以及序列号9和序列号10杂交的sirna分子。

以下对本发明的图表进行说明。

图1到图9显示含有序列号1到序列号10的核酸序列的、对hpv16型或18型的e6/e7具有特异性的、化学变性的sirna的活性及血清稳定性。具体来说，

a.图1及图2：trypanblue检测实验显示sirna426的2'-ome变性衍生物转染到细胞内的存活hela细胞数和sirna497的2'-ome变性衍生物转染到细胞内的存活siha细胞数。gfp-特异性sirna(对照sirna)作为对照组使用。

b.图3及图4:对于e7表达和tp53表达变化的2’-ome变性sirna衍生物的沉默(silencing)效率利用免疫印迹(westernblot)确认。β-actin作为加载控制使用。

c.图5及图6：e6及cdkn1amrna表达的qrt-pcr结果。

d.图9：凝胶电泳分析结果显示2’-ome变性sirna衍生物的血清内稳定性(serumstability)。未变性的sirna(lane0)及变性的sirna426衍生物或sirna497衍生物通过15％聚丙烯酰胺胶条件的电泳进行分析。

图10到图13显示出对宫颈癌细胞，使用对hpv16型或18型的e6/e7具有特异性的、化学性变性的sirna进行处理以及并用放射线疗法时的提升效果。即hela细胞被20nm的从序列号1至序列号10组合的群中选择的sirna变性体双链或10nm的sirnapool(sp)细胞内特性转染(transfection)，追加并行γ线照射(γ-irradiation)。类似地，siha细胞也被20nm的从序列号1至序列号10组合的群中选择的sirna变性体双链或7nm的sirnapool(sp)细胞内特性转染(transfection)，追加并行γ线照射(γ-irradiation)。癌细胞的数量分别按sirna单独处理(non-ir)或并行γ线照射的sirna来确定。细胞内未转染(transfection)的细胞和被转染对照sirna的细胞作为对照组使用。更具体来说，

a.图10：trypanblue检测实验显示sirnapool被转染(transfection)到细胞内的细胞、sirna单独处理、并行放射线-sirna条件下存活的细胞。

b.图11：显示tp53和hpve7蛋白质表达的免疫印迹分析结果。(m,mock；c,controlsirna；sp,sirnapool.)

c.图12：annexin-v及pi结合的检测试验结果，显示出筛选的sirna衍生物转染(transfection)到细胞内的凋亡细胞的百分比比例。

d.图13：显示hpve6/e7-特异性sirna对细胞老化的效果。

本发明提供为了制备用于hpv(humanpapillomavirus)感染诱发的癌症放射线治疗的致敏制剂的，包括从序列号1至序列号10组合的群中选择的任意一种核酸序列的寡核苷酸的用途。

本发明提供hpv(humanpapillomavirus)感染诱发的癌症放射线治疗的致敏方法，其特征是把包含从序列号1至序列号10组合的群中选择的任意一种核酸序列的寡核苷酸的组合物按照有效量投入到需要的个体中。

本发明提供hpv(humanpapillomavirus)感染诱发的癌症放射线治疗方法。包括:

a.把包含从序列号1至序列号10组合的群中选择的任意一种核酸序列的寡核苷酸的组合物按照有效量投入到需要的个体中的步骤；及

b.对所述个体进行放射线治疗的步骤。

本发明中的“有效量”是投入到个体中时，可以提高癌症治疗效果的量的统称，可包括治愈癌症、实质性预防、改善状态等。所述“个体”是指动物，更优选为哺乳动物，尤其是包括人类的动物，也可以是来自动物的细胞、组织、器官。所述个体也可以是需要治疗的患者(patient)。

本发明的所述“治疗”是改善由于癌症导致的症状的统称，它包括治愈癌症、实质性预防和改善状态等，即包括缓解、治愈、预防由于癌症引起的一种或大部分症状，但不限于此。

本发明中的“致敏”是指使用放射线或抗癌剂治疗癌症时，提高放射线或抗癌剂对癌细胞的感受性，提高放射线或抗癌剂的治疗效果。优选地，提高hpv感染诱发的癌细胞的对放射线及抗癌剂的感受性。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明的寡核苷酸是具有出色效果的致敏剂，它可以抑制hpv病毒的致癌性蛋白质e6及e7的表达，抑制肿瘤细胞的增殖，增强肿瘤细胞对放射线的敏感度，可以把细胞凋亡效果极大化。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1是确认使用本发明中的sirna处理时hpv18型或16型病毒感染的宫颈癌细胞株的细胞增殖抑制效果的图面

(图1a:感染hpv18型的hela细胞株的效果，比较例(1、2、3、4、6及7号)，用序列号1和2杂交的sirna426(5号)

图1b:感染hpv16型的siha细胞株的效果，比较例(1、3及4号)，用序列号9和10杂交的sirna497(2号))；

图2显示使用本发明中的sirna处理时，hpv18型或16型病毒感染的宫颈癌细胞株中tp53及e7蛋白质的表达变化的评价结果(图2a:感染hpv18型的hela细胞株的效果，图2b:感染hpv16型的siha细胞株的效果)；

图3显示使用本发明中的sirna处理时，hpv18型或16型病毒感染的宫颈癌细胞株中e6mrna的表达变化的评价结果(图3a:感染hpv18型的hela细胞株的效果，图3b:感染hpv16型的siha细胞株的效果)；

图4显示使用本发明中的sirna处理时，hpv18型或16型病毒感染的宫颈癌细胞株中cdkn1amrna的表达变化的评价结果(图4a:感染hpv18型的hela细胞株的效果，图4b:感染hpv16型的siha细胞株的效果)；

图5显示本发明的sirna的血浆稳定性的评价结果(图5a:426sirna,图5b:497sirna)；

图6显示本发明中的sirna和放射线并用处理时，hpv18型或16型病毒感染的宫颈癌细胞株的细胞增殖抑制效果的图面(图6a:感染hpv18型的hela细胞株的效果，图6b:感染hpv16型的siha细胞株的效果)；

图7显示本发明中的sirna和放射线并用处理时，hpv18型或16型病毒感染的宫颈癌细胞株的tp53及e7蛋白质的表达变化的评价结果(图7a:感染hpv18型的hela细胞株的效果，图7b:感染hpv16型的siha细胞株的效果)；

图8显示本发明中的sirna和放射线并用处理时，hpv18型或16型病毒感染的宫颈癌细胞株的细胞凋亡(apoptosis)诱导效果的评价结果(图8a:感染hpv18型的hela细胞株的效果，图8b:感染hpv16型的siha细胞株的效果)；

图9显示本发明中的sirna和放射线并用处理时，hpv18型或16型病毒感染的宫颈癌细胞株的细胞老化诱导效果的评价结果(图9a:感染hpv18型的hela细胞株的效果，图9b:感染hpv16型的siha细胞株的效果)。

具体实施方式

以下对本发明进行详细说明。

但下述实施例仅为演示本发明使用，本发明的内容并不限于这些实施例。

<实验方法>

1.细胞株及免疫印迹

hela细胞是hpv18-阳性的人类子宫癌细胞株。hela-luc(来源于hela细胞株，特性被稳定转染的生物发光的人类肿瘤细胞株)从xenogencorp(alameda,ca,usa)购入。hpv16-阳性的人类子宫癌细胞株siha从americantypeculturecollection(manassas,va,usa)购入,通过短碱基序列的反复，进行验收。细胞对支原体已完成一般性实验。

whole-celllysate通过ripa缓冲液(10mmtris(ph.4)、0.15mnacl、5mmedta、1％tritonx-100、0.5％deoxycholicacidsodiumsalt及0.1％sds)提取。圆心分离后，上层液的蛋白质浓度用bca蛋白检测试剂盒(thermofisherscientificinc)测量。为了使蛋白质样本完全变性(denaturation)，放入样本缓冲液中煮5分钟。之后，样本适用6％、10％或15％聚丙烯酰胺凝胶，用0.4μmpvdfmembrane(milipore,bilerica)转换。转换后，利用5％脱脂乳把membrane阻断，添加强烈浓度的tp53、e7、β-actin的一次抗体及horseradishperoxidase-conjugatedigg，进行培养。最后用ecl溶液检测蛋白质表达程度。

2.sirna细胞内转染(transfection)及γ线照射(γ-irradiation)

对hpv18e6/e7(426,450)、hpv16e6/e7(366,448,497)的sirna及对照sirna在bioneer(dae-joen,korea)合成。sirna细胞内转染(transfection)用dharmafect(dharmacon,lafayette,co,usa)进行，按照生产商的说明进行。化学性变性(通过2'-ome,2-f'的2'-sugarmodification)的sirna双工衍生物(sirnaduplexderivatives)在bioneer(dae-jeon,korea)设计并合成。所有sirna用depc处理的水稀释，最终浓度为5μg/μl。为了放射线照射，细胞用5×10⁵cells/100mmdish的密度培养。24小时后，细胞通过gc3000elaniraadiator(mdsnordion,canada)被暴露在2-3gy的γ线。第二天，细胞用胰蛋白酶处理，用3×10⁵cell/100mmdish的密度对细胞重新分配(re-plate)。

3.flowcytometry分析及senescence-associatedβ-galactosidase(sa-β-gal)检测实验

细胞凋亡用annexinv-fluorescenceisothiocyanate(fitc)及propidiumiodide(bdpharmingen,sandiego,ca,usa)，按照生产商的说明进行染色，用flowcytometry定量测量。为了进行老化分析(senesenceanalysis)，细胞用2％甲醛/0.2％戊二醛固定，为了老化分析(senesenceanalysis)，细胞利用x-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-galactopyranoside)在ph6.0条件下染色。sa-β-gal阳性细胞在threerepresentativefields测量细胞数。

4.quantitativereal-timepcr分析

总rna用trizolrna分离方法(invitrogen,carlsbad,ca,usa)从细胞提取，之后利用oligo-dtprimer反转录。pcr的引物和探针在tibmolbiol(berlin,germany)制作。qrt-pcr用lightcyclerreal-timepcr检测系统(rochediagnostics,basel,switzerland)进行。细胞及组织内mrna的表达程度分别在530nm及705nm测定。pcr条件如下:在95℃条件下10分钟,95℃条件下以10秒反复45个循环,55℃条件下30秒,最后40℃条件下30秒。

5.血清稳定性

sirna双链(9μg)在37℃温度条件下，在10％人类血清90μl中保存。按照时间(0、1、2、3、4、24h)取标本12μl，立刻在-70℃冷冻保管。rna用不产生变性的条件即利用15％polyacrylamide-tbe进行分离，进行etbr染色后用紫外凝胶成像仪(uv-transilluminator)拍摄。

<实施例1>制备hpv16型及18型的e6/e7的sirna

本发明的发明者们制备了hpv16型及18型的e6/e7肿瘤性蛋白质的sirna，如下表所述。下表中用‘m’标示的sirna序列表示碱基残基与甲基结合的，被2'-o-me变性核苷酸置换的碱基。即2'-o-me变性的u时用‘mu’表示，2'-o-me变性的g时用‘mg’表示。

表1hpv16型及18型的sirna

<比较例>制备hpv16型及18型的e6/e7的sirna

本发明的发明者们制备了其他碱基发生化学变性的sirna，如下表2，与所述实施例1制备的hpv18型sirna426及hpv16型sirna497进行效果比较。

下表中用‘m’标示的sirna序列表示碱基残基与甲基结合的，被2'-o-me变性核苷酸置换的碱基,用‘f’标示的sirna序列表示2'-氟化(fluorination)的碱基。即2'-o-me变性的u时用‘mu’表示，2'-o-me变性的时用‘mg’表示，2'-氟化(fluorination)的c时用‘fc’表示。

表2hpv16型及18型的sirna变性体

<实施例2>细胞培养及sirna特性转染

把宫颈癌细胞和hpv18型病毒感染的hela(hela；atccccl-2)宫颈癌细胞株、hpv16型病毒感染的siha(siha；atcchtb-35)宫颈癌细胞株在6孔板上按照5×10⁴或1×10⁵细胞数分配，在37℃、二氧化碳5％条件下在rpmi1640或dmem培养基里分别培养24小时。sirna在细胞内转染(transfection)用dharmafect(dharmacon,lafayette,co,usa)进行，按照生产商的说明进行。

<实施例3>sirna的细胞增殖抑制效果的评价

把所述实施例1的、以hpv18型或16型的e6/e7为靶的sirna，用所述实施例2的方法，特性转染到hpv18型病毒感染的hela或hpv16型病毒感染的siha宫颈癌细胞株，增加一天的培养后，再用实施例2的方法用sirna进行特性转染。特性转染后培养3天，测量细胞数。对照组使用gfpsirna。

结果在图1中显示。

如图1a所示，hpv18型病毒感染的hela细胞株中序列号1及2杂交的sirna426显示出优秀的细胞增殖抑制效果(图1a的5号)。其效果与比较例制备的序列号11及12杂交的sirna(图1a的1号)、序列号13及14杂交的sirna(图1a的2号)、序列号15及16杂交的sirna(图1a的3号)、序列号17及18杂交的sirna(图1a的4号)、序列号19及20杂交的sirna(图1a的6号)、序列号21及22杂交的sirna(图1a的7号)相比，其效果最优秀。

如图1b所示，hpv16型病毒感染的siha细胞株中序列号9及10杂交的sirna497显示出优秀的细胞增殖抑制效果(图1b的2号)。其效果与比较例制备的序列号23及24杂交的sirna(图1b的1号)、序列号25及26杂交的sirna(图1b的3号)、序列号27及28杂交的sirna(图1a的4号)相比，其效果最优秀。

<实施例4>对tp53及e7蛋白质表达的影响

被hpv编码的e6和e7肿瘤蛋白质对宫颈癌发病起着重要的作用。大部分hpv相关的子宫癌与其他癌不同，有野生型tp53基因，子宫癌中的tp53蛋白质水平维持显著较低的水平。原因为，它是e6病毒蛋白质的靶标而被持续分解。因此，通过免疫印迹确认本发明的e6/e7sirna处理的感染hpv18型或16型的宫颈癌细胞株中tp53及e7蛋白质的表达变化。

结果在图2中显示。

如图2所示，可以确认感染hpv18型病毒的hela细胞株中序列号1及2杂交的sirna426、感染hpv16型病毒的siha细胞株中序列号9及10杂交的sirna497，增强了tp53蛋白质的诱导，同时抑制了e7蛋白质的表达。所述效果与比较例制备的sirna相比，显示出显著优秀的效果。

<实施例5>对e6及cdkn1amrna表达的影响

本发明确认了本发明中的sirna在感染hpv宫颈癌细胞株中，对e6及cdkn1amrna表达的影响。cdkn1a的表达通过肿瘤抑制基因p53蛋白质来调节，所述cdkn1a与细胞的p53-依存性g1phasecellcyclearrest密切相关。所述e6及cdkn1amrna表达程度利用taqmanquantitativereal-timepcr(qrt-pcr)进行分析。

结果在图3、图4中显示。

如图3、图4所示，可以确认感染hpv18型病毒的hela细胞株中序列号1及2杂交的sirna426、感染hpv16型病毒的siha细胞株中序列号9及10杂交的sirna497，能够最有效地抑制e6mrna的表达，并最有效地诱导cdkn1amrna的表达。

<实施例6>sirna的血清稳定性评价

如图5所示，可以确认序列号1及2杂交的sirna426、序列号9及10杂交的sirna497，血清稳定性与未进行化学变性的sirna(序列号11及12杂交的sirna/图5a中的1号及序列号23及24杂交的sirna/图5b中的1号)相比更加优秀。

<实施例7>sirna与放射线并用处理时细胞增殖抑制效果

为了确认具有序列号1到10的核酸序列的sirna作为放射线并用疗法的致敏剂是否显示其效果，进行相关实验。用与实施例3相同的方法，把序列号1到10的sirna分别特性转染到hela细胞或siha细胞，照射放射线，评价并用疗法的效果。

结果在图6中显示。

如图6a所示，在感染hpv18型病毒的hela细胞中进行sirna426(图6a的426_d5)或sirna450(图6a的450_d4)处理同时并用放射线照射的组，与单独进行sirna426或sirna450处理的组相比，显示出提高两倍以上的细胞增殖抑制效果。同时，与单独进行放射线照射的mock对照组相比，进行sirna426或sirna450处理同时并用放射线照射的组显示出两倍以上更优秀的细胞增殖抑制效果，由此可以确认sirna426或sirna450显示出对放射线疗法的优秀的致敏效果。

如图6b所示，与对感染hpv16型病毒的siha细胞单独进行放射线照射的mock对照组相比，进行sirna366(图6b的366_d2)、sirna448(图6b的448_d2)及sirna497(图6b的497_d2)处理同时并用放射线照射的组显示出两倍以上更优秀的细胞增殖抑制效果，由此可以确认sirna366、sirna448及sirna497显示出对放射线疗法的优秀的致敏效果。

<实施例8>sirna与放射线并用处理时tp53及e7蛋白质表达的变化

用与所示实施例4相同的方法，评价sirna与放射线并用处理时tp53及e7蛋白质表达的变化。

结果在图7中显示。

如图7所示，sirna426、sirna450、sirna366、sirna448或sirna497与放射线并用处理的组tp53蛋白质的表达显著增加，e7蛋白质的表达显著减少，由此可以确认sirna426、sirna450、sirna366、sirna448及sirna497对放射线疗法具有优秀的致敏效果。

<实施例9>sirna与放射线并用处理时细胞凋亡(apoptosis)诱导效果

使用与上述方法相同的方法，在hela细胞或siha细胞中单独转染sirna，或并用放射线疗法后培养一天。利用细胞凋亡检测试剂盒(bd,usa)，使用annexinv和pi(propidiumiodide)染料进行染色，在常温下反应30分钟，利用流式细胞分析器确认细胞的凋亡。

结果在图8中显示。

如图8所示，sirna426、sirna450、sirna366、sirna448或sirna497与放射线并用处理的组与单独进行放射线照射的mock对照组相比，膜联蛋白-v-阳性的凋亡细胞显著增加，确认了本发明中的sirna作为对放射线疗法的、增加癌细胞的细胞凋亡效果的致敏剂是有效果的。

<实施例10>sirna与放射线并用处理时细胞老化诱导效果

使用与上述方法相同的方法，在hela细胞或siha细胞株中单独转染sirna，或并用放射线疗法后培养一天。为了进行老化分析(senesenceanalysis)，细胞用2％甲醛/0.2％戊二醛固定，细胞按照以前的方法，利用x-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-galactopyranoside)在ph6.0条件下染色。sa-β-gal阳性细胞在threerepresentativefields测量细胞数。

结果在图9中显示。

如图9所示，sirna426、sirna450、sirna366、sirna448或sirna497和放射线并用处理的组与单独进行放射线照射的mock对照组相比，显示出sa-βgal活性增加10～20倍，由此可以确认本发明中的sirna变性体对放射线疗法具有优秀的致敏效果。

<实施例11>sirna混合群(sirnapool,sp)的放射线致敏效果评价

大自然中，通过dicer产生的sirnas，显示出使基因表达沉默功能的sirnaspool。用这样的方式获得的sirnaspool既是有效率的沉默者(silencers)，又具有较小的药物副作用(off-targeteffect)。本发明者评价了使用所述sirna的10nm的hpv18型sirna混合群(sp)和7nm及10nm的hpv16型sirna混合群(sp)的细胞凋亡效果。

如图6到图9所示，sirna混合群(sp)与sirna单独处理的群相比，显示出优秀的细胞增殖抑制效果、tp53蛋白质表达诱导效果、e7蛋白质表达抑制效果、细胞凋亡诱导效果及细胞老化诱导效果，这些效果可以通过并用放射线疗法被极大化。

因此，可以推定，混合本发明中的各个sirna变性体的sirna混合群既可以显示出较小的副作用又可以显示出优秀的放射线致敏作用。

本发明中的寡核苷酸作为致敏剂具有优秀的效果，可以抑制hpv病毒的致癌性蛋白质e6及e7的表达，从而抑制肿瘤细胞的增殖，增强肿瘤细胞对放射线的敏感度，从而使细胞凋亡效果极大化，因此产业利用可能性高。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

<110>瑷备恩有限公司

<120>含有hpv病毒的致癌基因表达抑制物质作为活性成分的癌细胞致敏用组合物

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