本申请要求2015年11月12日递交的、申请号为62/254,700的美国临时专利申请的优先权及2016年1月8日递交的、申请号为62/276,715的美国临时专利申请的优先权，上述在先申请的全部公开内容均特此并入本申请中作参考。
本发明涉及用于替换或修复受损组织的工程化组织。
背景技术：
用于替换或修复受损组织的工程化生物组织通常是通过在合成支架上接种细胞并将细胞暴露在允许它们在支架上合成和分泌细胞外基质成分的条件下所产生的。不同的技术已被用于产生合成支架，包括纳米纤维组装、铸造、打印、物理喷射(例如，使用泵和注射器)、静电纺丝、静电雾化技术和其他技术用于沉积一种或多种天然或合成聚合物或纤维以形成一个具有合适形状和尺寸的支架，以用于可移植到受试对象(例如，人类受试对象，例如，需要工程化组织的器官或区域)中。
据估计，每年全世界有超过50万人被诊断为食管恶性肿瘤。先天性食管畸形(congenitalmalformationsoftheesophagus)，如食管闭锁(esophagealatresia)的平均患病率(prevalence)为2.44/每10000个新生儿。食管损伤后的慢性食管狭窄(chronicesophagealstricture)也是很常见的。虽然已经在最小化早期恶性疾病的食管切除范围，如内镜下黏膜切除术(endoscopicmucosalresection)，但许多食管疾病的主要治疗方法还是外科食管切除术。传统上，采集自体导管(例如胃、小肠、结肠)并将其绕道放入胸腔中(reroutedintothechest)以恢复胃肠道的连续性。许多患食管闭锁的儿童或者食管受创伤或腐蚀性损伤的患者都最终经受类似的重建。但这些治疗方法具有高发病率和死亡率。
由于食管结构复杂，通常使用自体导管(autologousconduits)。食管的层(layersoftheesophagus)是由复层鳞状上皮(stratifiedsquamousepithelium)、粘膜下层(submucosa)和外环肌层(outercircularmusclelayer)和纵肌层(longitudinalmusclelayer)组成，食管的这些多层结构为遏制口腔的摄入和从胃肠道外逸出的污染提供了一个屏障。而且，在食团(bolus)通过时，或者在吞咽或呕吐期间，该结合层提供了推进的生理机制，及应力管理。
有必要提供能够帮助(support)组织再生的结构及制造该结构的方法。
技术实现要素：
本发明公开了涉及能够产生胃肠道组织(例如，食管、胃、肠、结肠或其他中空胃肠道组织)的合成支架极其相关系统的实现方式。在一些实施方式中，支架为受试对象中胃肠道(例如食管)组织的生长和再生提供了指导。在一些实施方式中，所述再生的胃肠道组织包括肌肉组织、神经系统组织、或者肌肉组织和神经系统组织。在一些实施方式中，胃肠道(例如食管)组织在支架周围再生。在一些实施方式中，所述支架并没有融合到最终的再生组织中(例如，新的食管组织并没有将支架融合到再生的食管壁中)。因此，本公开的方面涉及引导的组织再生，其中支架提供了可促进宿主组织再生的支撑和/或信号，且无需将支架融合到再生的组织中(例如，在最终的再生组织中无需支架提供结构或功能上的支持)。
在一些实施方式中，胃肠道(如食管)支架包括可生物降解和/或可再吸收的材料，所述材料在胃肠道(如食管)组织再生开始后(例如，在功能性食管组织再生后)被再吸收。
在一些实施方式中，胃肠道(例如食管)支架包括一个或多个结构，所述结构可在胃肠道(例如食管)组织再生开始后(例如，在功能性食管组织再生之后)用于协助移除该支架。
在一些实施方式中，在支架植入之前，用一种或多种类型的细胞将支架进行细胞化。在一些实施方式中，所述细胞为自体细胞。在一些实施方式中，所述细胞为祖细胞或干细胞。在一些实施方式中，所述细胞是从骨髓、脂肪组织、食管组织或其他合适的组织所获得。在一些实施方式中，所述细胞可以从各种同种异体来源所获得，包括但不限于诸如羊水、脐带血等的来源。在一些实施方式中，所述细胞为间充质干细胞(mscs)。
在一些实施方式中，将支架植入到可提供足够的用于受试对象中组织再生的干细胞龛的部位(例如可提供干细胞龛的食管部位或其他胃肠道部位)。在一些实施例中，不希望受到理论的约束，所述支架和/或所述支架上提供的细胞，有助于促进来自支架植入部位处存在的宿主干细胞的胃肠道组织的生长和/或再生。
在一些方面，本公开涉及以下发现：通过合成支架的存在可以促进或增强食管组织生长，其中，所述合成支架可被改造成替换或修复病变或受损组织或器官的自然结构模式和/或功能特性，而无需该支架完全融合到最终的再生组织中。因此，在一些方面中，本公开提供了一种促进或增强胃肠道组织(例如食管)生长的方法，该方法包括：递送一合成支架到受试对象的胃肠道区域(例如食管)，其中，递送合成支架导致在受试对象的该区域生长出新的胃肠道(如食管)组织。在一些实施方式中，在植入该支架之前，移除(例如，手术地移除)病变或受损的胃肠道组织。在一些实施方式中，该支架为一个植入的近似管状的结构(例如，缝合到移除病变或受损组织后的剩余胃肠道组织的末端)。在一些实施方式中，所植入的支架比所移除的组织短(例如短5-50％)。在一些实施方式中，当组织附着(例如缝合)在支架的两端时，临近植入部位的剩余胃肠道组织被拉伸。在一些实施方式中，新的胃肠道(如食管)组织在植入的支架上再生，而不完全与支架融合。在一些实施方式中，尽管支架可以保留在再生组织的内腔(lumen)内，但再生组织的壁并不包括支架的壁。在一些实施方式中，可以在组织再生过程中的合适点将支架从再生组织形成的内腔中移除。
在一些实施方式中，新的胃肠道(如食管)组织的生长导致了功能性组织(例如，功能性食管)的形成，这就不需要该功能支架继续存在。
在一些实施方式中，所述合成支架在生理条件下是可吸收或溶解的。在一些实施方式中，在功能性食管形成后，将所述合成支架从受试对象的胃肠道区域(例如食管)移除。
在一些实施方式中，本文所描述的方法和组成也可用于气管和/或支气管组织的再生。
这些方面和其他方面将在本文中进行更详细的描述。
附图说明
结合附图阅读以下详细描述可以最好地理解本公开。需要强调的是，根据惯例，图中的各种特征不是按比例绘制的。相反，为清楚起见，各种特征的尺寸可被任意扩大或缩小。
图1a是本文所公开的合成支架的一种实施方式的透视图，其中部分呈现局部横截面；
图1b是本文所公开的合成支架的一种实施方式的管表面的显微照片；
图1c是本文所公开的合成支架的第二种实施方式的侧面透视图；
图2是食管的生物膜层的非限制性描述；
图3示出了与相应的天然组织比较的再生食管组织的一个非限制性实例；
图4a是本文所公开的合成支架的一种实施方式的外表面区域的sem显微照片，在放大倍数为5000x下经过7天生物反应后显示出细胞生长；
图4b是本文所公开的合成支架的一种实施方式的外表面区域的显微照片，经过7天生物反应后显示出细胞生长；
图5是本文所公开的再生方法的一种实施方式的流程图；
图6是本文所公开的方法的一种实施方式的整体研究流程，所述方法包括细胞化的支架的产生和后续植入；
图7a是根据本文所公开的一种实施方式的静电纺丝支架样品的sem图，sem图分别在放大倍数为1000x、2000x和5000x下拍摄；
图7b是根据本文所公开的静电纺丝支架植入前和植入后的代表性单轴力学试验加载的图示；
图7c是针对根据本文所公开的一种实施方式所制备的支架在植入前和植入后的单轴力学性能表；
图8是从脂肪组织中分离并增殖多达5代的mscs的流式细胞术的图示；
图9是根据本文所公开的一种实施方式的植入手术的概述；
图10是根据本文所公开的方法的一种实施方式的时间轴表示；
图11a至c为术后规定的时间间隔内，位于测试对象的食管切除部位处的再生管状组织内部的再生组织的照片；
图12a至e为术后规定的时间间隔内，位于测试对象的食管切除部位处的再生管状组织内部的再生组织的照片；
图13a至k为食管组织的组织学分析的照片；
图14a至k为在植入本文所公开的支架的一种实施方式2.5月后，来自猪食管的组织的组织学分析照片。
具体实施方式
本公开的方面部分涉及以下显著的发现：将合成支架插入到受试对象的食管区域，可以促进或增强受试对象中新的食管组织(例如，完整且功能性的食管)的再生，且无需将支架完全融合到再生组织中。因此，在一些实施方式中，本公开提供了一种促进或增强胃肠道组织(例如食管)生长的方法，该方法包括：递送一合成支架到受试对象的胃肠道区域(例如食管)，其中，递送合成支架导致在受试对象的该区域生长出新的胃肠道(如食管)组织。
使用本文所公开的方法可被再生的组织可以是任何胃肠道组织，例如食管、胃、肠、结肠、直肠或其他中空胃肠道组织。在一些方面，本公开在某种程度上是部分基于以下令人惊讶的发现：本文所描述的方法导致了包含肌肉组织、神经系统组织、或肌肉组织和神经系统组织的胃肠道组织的再生。
在一些实施方式中，所述合成支架在生理条件下(例如，在大致对应于组织再生所需时间的时间段内)是可再吸收的或可溶解的。在一些实施方式中，至少一部分的支架在合适的生理条件下是可再吸收的或可溶解的。
在一些实施方式中，在再生的功能组织(例如，食管或部分食管)形成后，将合成支架从受试对象中移除。
在一些实施方式中，支架被设计成可容易取回的，可通过具有a)一种或多种比缝合线更容易移除的可逆附件(reversibleattachment)来实现，例如在组织再生后帮助支架与周围组织(例如食管)分离；和/或b)具有可用于帮助取回该支架的一个或多个特征，例如在支架与周围组织(例如相邻食管组织)分离之后。
可逆附件的非限制性例子包括机械装置(例如钩和环、诸如支撑架(stents)的连接器，或可分离的其他机械附件)和/或化学机械装置(例如可生物降解或可吸收的附件和/或可通过化学手段或酶促手段被选择性去除的附件)。在一些实施方式中，可以使用可吸收钉(absorbablestaples)。在一些实施方式中，所述可吸收钉包含例如聚乳酸-聚乙交酯的共聚物或任何其他可吸收的材料共混物。
在一些实施方式中，支架的手术植入和/或取回可以在胸腔镜辅助下进行。
可帮助取回或移除支架(例如，在支架与周围胃肠道组织分离后)的结构特征的非限制性例子包括孔洞(holes)、锯齿(indents)、凸起(protrusions)或其他结构特征或其任何组合，这些结构特征仅位于支架的外表面上。可以使用这些结构特征中的一个或多个来帮助抓住或握住正用于取回支架的工具(例如抓紧器)。在一些实施方式中，这些结构特征中的一个或多个可以仅位于支架的一端(例如，位于靠近受试对象口腔的端部)。在一些实施方式中，这些结构特征中的一个或多个可以位于支架的两端或遍布整个支架长度。在一些实施方式中，这些结构特征中的一个或多个仅位于支架的外表面上。在一些实施方式中，这些结构特征中的一个或多个位于支架的外表面和内表面上。在一些实施方式中，在用于取回支架的一个或多个结构特征的位置处或附近加固支架(例如，使支架较厚和/或支架包括更坚固的材料)。
在一些实施方式中，分离的支架可以经由通向食管的气道腔而在内窥镜下去除。在一些实施方式中，分离的支架可以手术去除。
在一些实施方式中，所述受试对象具有需要被替换的病变胃肠道组织或受损胃肠道组织。在一些实施方式中，所述受试对象为人(例如，人类患者)。
在一些实施方式中，本公开提供了可用于替换或修复食管或部分食管的工程化支架。在一些实施方式中，本文所述的食管支架可用于促进组织再生(例如再生的食管或部分食管)以替换受试对象(例如人)中的组织。例如，患有某些癌症(例如食管癌)的受试对象(例如人)可以受益于受癌症影响的组织或器官的替换。不希望受到任何特定理论的束缚，本文所述的合成支架促进了受试对象中新组织(例如食管组织)的生长，并因此给受试对象提供了治疗益处。
在一些实施方式中，新的食管组织的生长引起在受试对象中形成功能性食管。在一些实施方式中，新的食管组织不会将支架融合到再生的食管壁中。在一些实施方式中，所述支架被设计和制造成在食管组织再生后是可吸收和/或容易回收的。在一些实施方式中，所支架被设计成至少部分可吸收的。
在一些实施方式中，合成支架的尺寸和形状与要被替换的病变或受损的胃肠道区域(例如食管)的尺寸和形状近似。
在一些实施方式中，支架将至少有两层。在某些实施方式中，该支架可以具有近似管状的结构。图1a示出了支架10的一个非限制性实施例，支架10具有近似管状的主体12，主体12具有外表面14和内表面16。在一些实施方式中，支架10的一个横截面大致为圆形。在一些实施方式中，横截面大致为“d”形。然而，可以使用具有其他横截面形状的支架10。根据再生的相应组织的大小，支架10可以具有任意合适的长度和直径，这取决于相应的再生组织的尺寸。在一些实施方式中，在某些实施例中，支架10的长度可以是约1-10厘米(例如3-6厘米，例如约4厘米)，或者在其他实施方式中长度为10-20厘米。然而，可以设想的是，根据具体应用、患者的需要和/或需要治疗的胃肠道的位置，可以使用更短或更长的支架10。在一些实施方式中，支架10可以具有0.5至5厘米的内径。然而，根据具体应用、患者的需要和/或需要治疗的胃肠道的位置，可以使用具有更小或更大内径的支架。
在一些实施方式中，支架10的长度可以比被替换的胃肠道(例如，食管)区域的长度短。在一些实施方式中，支架10的长度为被替换的组织长度的50-95％(例如，约50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、约80％、约85％、约90％或约95％)。不受任何理论的束缚，据信，相关胃肠道区域的某些区域能对施加在相关器官组织上的牵引力作出积极响应，导致产生能引发或促进组织生长和分化的某些生物-有机介导的信号。
在一些实施方式中，支架10的长度可以比被替换的胃肠道(例如，食管)区域的长度长。在一些实施方式中，支架10的长度为被替换的组织长度的100％-150％(例如，约100-110％、110-120％、120-130％、130-140％、约100％、约105％、约110％、或者约115％)。可以设想的是，支架的长度将是有效替换受影响区域所必需的长度。在某些情况下，可以设想支架10将具有比被替换的胃肠道区域更长的长度，以有效定位支架，减少或最小化受影响区域或相关区域中的创伤和缺血。
在一些实施方式中，支架10可以由单层合成材料组成。然而，支架10还可以包括多于一层的合成材料，这也在本公开的范围内。
因此，在一些实施方式中，合成支架10可以由多层(例如2层或更多层，例如2、3、4、5层或更多层)组成。在一些实施方式中，一层或多层是由相同的材料制成。在一些实施方式中，不同的层可由不同的材料(例如，不同的聚合物和/或不同的聚合物排布)制成。如本文所公开的合成支架10可以包含两种或更多种不同组件，当存在这些组件时可以将其组装形成所述支架(例如在细胞化和/或植入之前)。在一些实施方式中，合成支架10包括彼此接触的两层或更多层，例如通过用于制造支架10的合成技术使层彼此接触。在一些实施方式中，可以使用包含多个步骤的技术来合成支架10，该技术导致两层或更多层聚集在一起(例如，将静电纺丝材料层用到预先做成的支架的一部分上，例如，先前的静电雾化材料层(priorlayer)、先前的静电纺丝材料层、纳入到该支架中的不同部件(例如编织管或网状物)的表面中的一种或多种。
在如图1a所示的实施方式中，支架10包括至少一个外层18，外层18限定了支架主体12的外表面14。支架10包括至少一个额外的向内取向层20。在如图所示的实施方式中，所述至少一个额外的向内取向层20与外层18的一个内表面直接接触。在期望或需要的情况下，所述至少一个额外的向内取向层20可被配置成为相关的支架主体12提供结构支撑。在图1a中所描述的实施方式中，所述至少一个额外的向内取向层20可以被配置为合适的网状物或编织物，所述网状物或编织物被周向安置成围绕支架主体12的纵向长度的至少一部分。在其他实施方式中，可以设想，所述至少一个额外的向内取向层20可以由合适的聚合物层构成。在如图1a所示的实施方式中，支架10的主体12包括至少一个位于网状物20或编织物层20内部的层22。
在期望或需要的情况下，支架10可具有大致均匀的壁厚。然而，在一些实施方式中，壁厚可以在主体12的特定区域变化。在一些实施方式中，支架10的主体12的一个或两个端部24、26处的壁厚与支架10的中部28(未示出)的壁厚不同(例如端部24、26处的壁厚比中部28的壁厚更厚)。在一些实施方式中，当支架连接到周围的胃肠道组织时，较厚的壁区域较坚固，且能为连接到支架10的一个或两个端部24、26的缝合线提供较好的支撑。所述厚壁区域也可以包括有利于缝合的非连续结构(discreteconfigurations)。这种非连续结构的非限制性例子包括管、孔等。
在某些实施方式中，至少限定在外层18上的外表面14是可以由静电纺丝聚合物材料构成。在某些实施方式中，可以设想的是，外部取向的壁18可以由静电纺丝聚合物材料构成。在某些实施方式中，外部取向的静电纺丝层可以与合适的编织材料层20直接接触。
纤维取向
静电纺丝纤维可以是各向同性的或各向异性的。在一些实施方式中，不同层中的纤维可以具有不同的相对取向。在一些实施方式中，不同层中的纤维可以具有基本相同的取向。另外，纤维取向可以在复合支架或三明治式支架的每一层中改变。
在一些实施方式中，可以使用具有不同孔隙率的支架。在一些实施方式中，支架的一层或多层基本允许完全的细胞渗透和均匀接种。在一些实施方式中，可以构建一层或多层的支架，以防止一种或多种细胞类型的渗透，例如，通过密集包装纤维。由于孔隙率随纤维直径的变化而变化，控制纤维直径可用于改变支架孔隙率。可选地，可以将不同聚合物的共混物静电纺丝在一起，并优先溶解一种聚合物以增加支架孔隙率。可以控制纤维的性质以优化纤维直径、纤维间距或孔隙率、每种纤维的形态，如纤维的孔隙率或长径比(aspectratio)，将纤维的形状从圆形变为带状。在一些实施方式中，可以控制或优化每个纤维的机械性能，例如通过改变纤维组成和/或降解速率。
在某些实施方式中，静电纺丝纤维材料可以提供如图1b所示的起伏表面(contouredsurface)。在某些实施方式中，支架10中的至少一个静电纺丝层可以是聚合物纤维材料，例如聚碳酸酯型聚氨酯(polycarbonatepolyurethane)，聚碳酸酯型聚氨酯可以通过将聚碳酸酯-聚氨酯溶解在经旋转干燥后的合适溶剂，例如六氟异丙醇(hfip)中来制备。
静电纺丝纤维材料的间距和孔隙率可以是这样的：使得接种在支架表面上的细胞可以在各纤维之间以悬浮的层叠关系粘附，以允许接种的细胞材料在其上形成如图4a和4b所示的薄片。
合成支架的形成
本公开的方面涉及合成支架的生产方法。在一些实施方式中，可以在芯轴上(例如通过静电雾化和/或静电纺丝来沉积材料)生产管状合成支架(例如合成食管支架)。
在一些实施方式中，合成支架的一层或多层为支架提供了结构支撑，赋予支架想要的机械性能。在一些实施方式中，可以在支架的两个不同层之间插入编织材料(例如，编织管、例如镍钛诺编织物、pet编织物、或者其他金属或非金属材料的编织物)以提供结构支撑。可以通过控制编织物的经纬密度(pickcount)来控制编织材料的压力(例如，编织物可施加在下一层材料(例如材料的外层静电纺丝层)上的力)。在一些实施方式中，可以在有机溶剂中涂布(例如，通过浸渍或其他技术)编织物以帮助编织物附着到支架10的一个层或多个其它层。在一些实施方式中，编织物20的长度并没有延伸到支架主体12的端部。在一些实施方式中，支架10的一端或两端由两层或更多层材料构成且不具有编织层，而支架主体12的中部28包括附加的编织层。
在一些实施方式中，合成支架的一层或多层在支架中提供屏障，在内部空间(例如腔空间)与外部空间之间产生间隔(例如，相对不可渗透的间隔)。在一些实施方式中，屏障可以是静电雾化的聚氨酯(pu)层。
在一些实施方式中，支架10的不同的层可以包括一种或多种聚合物(例如，聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)、pu或其共混物)。在一些实施方式中，支架10可以包括夹在内部pu层(例如，静电雾化到或静电纺丝到芯轴上的内部pu层)和外部pu层(例如，静电雾化到编织材料上的外部pu层)之间的镍钛诺编织物。
在某些实施方式中，该支架10可以使用支架支撑件或芯轴形成。在一些实施方式中，在沉积一层或多层pu、pet或其组合材料之前，可以用材料(例如plga或其他聚合物)涂覆支架支撑件或芯轴。
在某些实施方式中，编织物层或网状物层中的材料可以由可吸收的聚合物材料组成。
支架生产-纤维材料
在一些实施方式中，支架的一层或多层可用纤维材料构建。在一些实施方式中，支架包含一种或多种类型的纤维(例如纳米纤维)。在一些实施方式中，支架包含一种或多种类型天然纤维、一种或多种合成纤维、一种或多种聚合物或其任何组合。应该重视的是，可以将不同材料(例如不同纤维)用在本文所述的方法和组成(即支架)中。在一些实施方式中，该材料是生物相容性的，因此它可以促进细胞生长。在一些实施方式中，该材料是永久性的、半永久性的(例如，在植入宿主中后持续数年)或可快速降解的(例如，在植入宿主中后数周或数月内被吸收)。
在一些实施方式中，该支架包含静电纺丝材料(例如，微米纤维或纳米纤维)或由其组成。在一些实施方式中，该静电纺丝材料包含pet(聚对苯二甲酸乙二醇酯(有时写成聚(对苯二甲酸乙二醇酯))或由其组成。在一些实施方式中，该静电纺丝材料包含聚氨酯(pu)或由其组成。在一些实施方式中，该静电纺丝材料包含pet和pu，或由pet和pu组成。
在一些实施方式中，人造支架可以由以下材料中的一种或多种组成或包括以下材料中的一种或多种：弹性聚合物(例如，一种或多种聚氨酯(pu)，例如聚碳酸酯和/或聚酯)、丙烯酰胺聚合物、尼龙、可吸收的聚砜类聚合物。在一些实施方式中，该支架可以由以下材料组成或包括以下材料：聚乙烯、聚丙烯、聚(氯乙烯)、聚甲基丙烯酸甲酯(和其它丙烯酸树脂)、聚苯乙烯及其共聚物(包括aba型嵌段共聚物)、聚(偏氟乙烯)、聚(偏二氯乙烯)、交联和非交联形式的、不同水解程度(例如87％-99.5％)的聚乙烯醇。在某些实施方式中，该聚合物还可以包括可增加该聚合物的亲水性的其他化合物或方法。在某些实施方式中，这可涉及引入诸如基于环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物的化合物。还可以设想，如果期望或需要的话，可以通过合适的等离子体处理来提高聚合物的亲水性。
在一些实施方式中，该支架可以由嵌段共聚物组成或包含嵌段共聚物。在一些实施方式中，诸如聚偏氟乙烯、间规聚苯乙烯、偏氟乙烯和六氟丙烯的共聚物、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯的加聚物(additionpolymers)，诸如聚丙烯腈及其与丙烯酸和甲基丙烯酸酯的共聚物、聚苯乙烯、聚(氯乙烯)及其各种共聚物、聚(甲基丙烯酸甲酯)及其各种共聚物、pet(聚对苯二甲酸乙二醇酯(有时书写成聚(对苯二甲酸乙二醇酯)))的无定形加聚物，可以进行溶液纺丝(solutionspun)或静电纺丝，并与本文所公开的任何其他材料组合以产生支架。在一些实施方式中，高度结晶的聚合物如聚乙烯和聚丙烯可以进行溶液纺丝或与本申请公开的任何其他材料组合以产生支架。
在一些实施方式中，在支架合成之后、但在支架细胞化和/或植入之前，可以对一种或多种聚合物进行改性，以降低其疏水性和/或增加其亲水性。
在某些实施方式中，该静电纺丝纤维可具有不超过10μm的直径。在某些实施方式中，该静电纺丝纤维可以具有3-10微米的直径。在某些实施方式中，该静电纺丝纤维可具有3-5微米的直径。
在某些实施方式中，可以设想，编织层中的材料可全部或部分地由诸如plga等的生物可吸收材料制成。还可以设想，在某些构造中，该编织材料可以是能促进和/或支撑组织生长和再生的负载材料和化合物。此类化合物和材料的非限制性例子包括以下物质的一种或多种：抗生素、生长因子等。
静电纺丝
在一些实施方式中，生产支架，该支架包括通过静电纺丝所产生的一个或多个层(例如，pu和/或pet)。静电纺丝材料可用于各种应用，包括作为组织工程的支架。静电纺丝聚合物的合适方法可以包括在以下文献中描述的那些方法：doshi和reneker.electrospinningprocessandapplicationofelectrospunfibers(电纺纤维的静电纺丝工艺及应用).jelectrostat.1995；35:151–60.；renekerdh,chuni.nanometerdiameterfibersofpolymerproducedbyelectrospinning(通过静电纺丝制备纳米直径的聚合物纤维).nanotechnology.1996；7:216–23；dzenisy.spinningcontinuousfibersfornanotechnology(用于纳米技术的连续纺丝纤维).science.2004；304:1917–19；或vasitaandkatti.nanofibersandtheirapplicationsintissueengineering(纳米纤维及其在组织工程中的应用).intj.nanomedicine.2006；1(1):15-30；其中涉及静电纺丝的内容通过引用的方式并入到本申请中。静电纺丝是一种可用于生产任意取向或排列的纤维的通用技术，纤维基本上具有从纳米尺度(例如，约15nm)到微米尺度(例如，约10微米)范围内的任何化学组成和直径。
在一些实施方式中，本文所使用的静电纺丝和静电雾化技术涉及使用高电压电场来给聚合物溶液(或熔液)充电，该聚合物溶液(或熔液)是通过喷嘴递送(例如作为聚合物溶液流)，且沉积到目标表面上。所述目标表面可以是一静电板的表面、一转筒(例如芯轴)的表面或者既导电又电接地的其他形式的收集器(collector)表面，使得带电聚合物溶液朝着所述表面移动。
在一些实施方式中，所采用的电场通常为几千伏的量级，并且喷嘴与目标表面之间的距离通常为几厘米或更远。所述聚合物溶液的溶剂在离开喷嘴和到达目标表面之间过程中蒸发(至少部分蒸发)。这导致聚合物纤维沉积在所述表面上。典型的纤维直径从几纳米到几微米不等。目标表面相对喷嘴的移动会影响纤维的相对取向。例如，如果目标表面是一旋转芯轴的表面，那么纤维将会沿旋转方向在所述表面上排列整齐(至少部分地排列整齐)。在某些情况下，喷嘴可以在旋转芯轴的两端之间来回扫描。
在一些实施方式中，聚合物纤维的尺寸和密度，纤维对齐的程度以及静电纺丝材料的其它物理特性会受到以下因素的影响，所述因素包括但不限于：聚合物溶液的性质、喷嘴的尺寸、电场、喷嘴与目标表面之间的距离、目标表面的性质、喷嘴与目标表面之间的相对运动(例如，距离和/或速度)以及可影响溶剂蒸发和聚合物沉积的其他因素。
静电纺丝和静电雾化工艺可以用来在芯轴上生产相互连接的聚合物纤维支架(例如，中空合成支架)。
支撑件/芯轴
在一些实施方式中，支架10(例如，具有两层或更多层的支架)可以使用可在其上形成支架10的支撑件(例如，实心的或中空的支撑件)来生产。例如，支撑件可以是静电纺丝收集器，例如芯轴、或管、或任何其他形状的支撑件。可以理解的是，所述支撑件可以具有任意尺寸或形状。然而，在一些实施方式中，支撑件的尺寸和形状被设计成用来产生支架，该支架将支撑与在宿主中被替换或补充的胃肠道组织(或其一部分)相同或相似尺寸的人造组织。可以理解的是，用来静电纺丝的芯轴应该具有导电的表面。在一些实施方式中，静电纺丝芯轴是由导电材料(例如，包括一种或多种金属的导电材料)制成。然而，在一些实施方式中，静电纺丝芯轴包括覆盖非导电的中心支撑件的导电涂层(例如，包括一种或多种金属的导电涂层)。
我们已经非常意外地发现，安置合适的编织材料以将其整合到所形成的支架10中靠近芯轴表面的位置处，可以用作帮助促进从与芯轴接触中移除所形成的支架10。
支架性能
应该理解的是，本申请的方面可用于增强任何支架(例如基于电纺丝和/或电喷涂纤维的支架)的物理特性和功能特性。在一些实施方式中，一种或多种支架部件可以是具有不同尺寸的薄片、圆柱体、厚肋拱状(thickribs)、实心块、分支网络等或其任何组合。在一些实施方式中，一体的和/或组装的支架的尺寸与被替换的组织或器官的尺寸相似或相同。在一些实施方式中，支架的各个部件或层具有较小的尺寸。例如，纳米纤维层的厚度可以是从几纳米到100纳米、1-1000微米、或甚至几毫米。然而，在一些实施方式中，一个或多个支架部件的尺寸可以约从1mm至50cm。然而，如本文所述，可以制造更大、更小或中等尺寸的结构。
在一些实施方式中，支架形成为管状结构，所述管状结构可以用细胞接种以形成管状组织区域(例如食管或其他管状区域)。可以理解的是，管状区域可以是具有均匀直径的圆柱体。然而，在一些实施方式中，管状区域可具有任何合适的管状形状(例如，包括沿着管状区域的长度方向具有不同直径的部分)。管状区域也可以包括一个分支或一系列分支。在一些实施方式中，制备了一端开口、两端开口或多端开口的(例如，在分支的支架情况下)管状支架。然而，管状支架可以在一端、两端或所有端封闭，本发明的各方面在此方面不受限制。还可以理解的是，由于本发明在此方面不受限制，因此本发明的方面可以用于生产任何类型或器官(包括中空和实体器官)的支架。在一些实施方式中，本发明的各方面可用于增强支架或其他结构的稳定性，所述其他结构包括非物理连接的两个或多个纤维区域或纤维层(例如静电纺丝纳米纤维)。
在一些实施方式中，支架被设计成具有多孔表面，所述多孔表面具有直径在约10nm至约100微米范围内的、能促进细胞化的孔。在一些实施方式中，孔的平均直径小于50微米、小于40微米、小于30微米、小于20微米或小于10微米(例如，约5微米、约10微米或约15微米)。在一些实施方式中，孔的平均直径在20-40微米。在一些实施方式中，对孔径进行选择以防止或减少受试对象中的免疫反应或其他不需要的宿主反应。可以使用计算技术和/或实验技术(例如使用水银孔隙仪法(porosimetry))来估计孔径。但是，可以理解的是，所述支架的多孔表面也可以包括其他尺寸的孔。
在一些实施方式中，使用纤维合成支架的表面层，所述纤维包含一种或多种可溶解的颗粒，所述颗粒可在合成期间或之后溶解(例如通过暴露于溶剂，水溶液，例如水或缓冲液)，留下可溶解颗粒尺寸大小的孔洞。在一些实施方式中，聚合物混合物中包含所述颗粒，所述聚合物混合物被泵送到静电纺丝装置的喷嘴中。结果，所述颗粒与所述纤维一起沉积。在一些实施方式中，所述静电纺丝过程被配置成沉积厚纤维(例如，具有数微米的平均直径，约10μm和更大的平均直径)。在一些实施方式中，如果纤维以密集模式沉积，则一种或多种纤维将在固化前合并以形成更大的微结构(例如，10-100微米厚或更厚)。在一些实施方式中，这些微结构可以缠绕两个或多个纤维层和/或来自一支架的两个或多个不同部件的部分(例如纤维)，从而增加支架的机械完整性。在一些实施方式中，当在支架合成过程的一个或多个阶段(例如，用来连接两个或多个层和/或部件的阶段)形成这种微结构时(例如，通过如本文所述的静电纺丝形成)，可以对所述微结构的表面进行处理(例如，进行刻蚀、或用如本文所述的可溶性颗粒制成多孔)以提供适合用于细胞化的表面。
在一些实施方式中，两个或多个结构组件(例如，环)之间、单个连续结构组件的结构件(例如，弧形构件)之间、和/或编织支撑材料之间的柔性支架材料的量(例如，松弛)可以用于确定合成支架的机械性能(例如抗拉强度、延伸率、转动、压缩、活动范围、弯曲度、阻力、柔量(compliance)、自由度、弹性或任何其他机械性质、或其组合)。
在某些实施方式中，支架10还可以包括一细胞鞘，其源自在孵育期间接种在支架外表面上的细胞。所述细胞鞘附着于支架的外表面并与其重叠。可以设想的是，存在于细胞鞘中的大部分细胞将被连接到所述外表面的最外层表面，并且将跨越本文限定的孔，以形成连续的或大体上连续的表面。
在某些实施方式中，所述细胞鞘可具有足以为所述鞘层提供结构完整性的厚度。在某些实施方式中，所述细胞鞘将由与支架外表面接触的多个细胞组成，所述多个细胞足以引导再生细胞与鞘接触以产生覆盖所述鞘但不与其融合的组织壁。在某些实施方式中，所述鞘可以由平均厚度在1和100个细胞之间的膜(lining)组成。某些实施方式中，所述膜可以具有10至100个之间、10至30个之间、20至30个之间、20至40个之间、20至50个之间、10至20个之间、30至50个之间、30至60个之间、40至60个之间、40至70之间、70至90之间的细胞厚度。
具有相关细胞鞘的支架10提供了可移动的可插入装置，其可以放置在合适的胃肠道切除部位。具有与之相接触的相关细胞鞘的支架10可被运送到期望的切除部位进行植入。在某些实施方式中，支架10被构造成可在切除器官适当再生之后从植入部位移除。在某些实施方式中，所述移除的支架将包括与其连接的一些或全部的细胞鞘。
本申请还公开了诸如胃肠道器官的管状器官的再生方法的各种实施方式。在某些实施方式中，方法100包括切除步骤，所述切除步骤包括切除受试对象中的管状器官的一部分，如参考数字110所示。待切除的器官可以为因疾病损伤、创伤或先天条件而受损或损害的胃肠道的管状器官。在某些实施方式中，合适器官的非限制性例子包括食管、直肠等中的一种。在某些实施方式中，合适的器官包括食管、小肠、结肠和直肠中的至少一种。
可以通过任何合适的外科手术来实现切除，并且产生切除后的器官部分，其在切除后保持与胃肠道连接并保留在受试对象内。在某些实施方式中，切除操作可以产生合适的切除边缘。
在切除完成后，将合成支架植入到切除部位，如参考数字120所示。在某些实施方式中，植入可以包括将保留在受试对象内的切除器官的相应端部连接到合成支架的相应端部的步骤，这样所述合成支架和所述切除器官可以在相应部件之间实现合适的连接。这可以通过一种或多种缝合线、生物有机组织胶等来实现。
在某些实施方式中，所植入的合成支架可以是管状构件，其具有外聚合物表面和覆盖外聚合物表面的至少一部分的细胞化鞘层。已经讨论了合成支架的各种实施方式并且可以在本文公开的方法中使用和利用合成支架的各种实施方式。在某些实施方式中，所述合成支架将包括第一端、与第一端相对的第二端，位于第一端和第二端之间的外部聚合物表面以及覆盖外部聚合物表面的至少一部分的细胞化鞘层。在某些实施方式中，所述植入步骤可以是使至少一部分的细胞化鞘层与所述切除后的器官部分的至少一个切除边缘直接接触的步骤。
在某些实施方式中，本文公开的方法还包括如下步骤：将所述合成支架在所述切除部位充分保持一段时间，以沿着所述合成支架实现引导的组织生长，如参考数字130所示。在某些实施方式中，所述引导的组织生长源自保留在受试对象体内的所述切除后的器官部分中存在的组织，并与其接触。在某些实施方式中，所述引导的组织生长将与所述切除后的器官的相关区域相邻。在某些实施方式中，所述引导的组织生长将呈现出分化组织。在某些实施方式中，在细胞鞘层外部的位置处，所述引导的组织生长与细胞鞘层的外表面平行。在某些实施方式中，所述引导的组织生长源自保留在受试对象体内的所述切除后的器官部分中存在的组织，并与其接触，且将与所述切除后的器官的相关区域相邻。所述引导的组织生长将呈现出分化的组织生长，并且可以在细胞鞘层外部的位置处与细胞鞘层的外表面平行。
在已经实现所述引导的组织生长后，本文所公开的方法100可以包括移除合成支架的步骤，如参考数字140所示。在某些实施方式中，所述移除步骤以使所述引导的组织生长与保留在所述受试对象中的管状器官的切除后部分保持接触的方式进行。在某些实施方式中，所述移除过程可以包括从所述引导的组织生长的内部内窥镜地移除合成支架。
在某些实施方式中，所述合成支架可全部或部分地由生物可吸收聚合物材料构建。在这种情况下，本文所公开的方法可以包括以下步骤：保持所述合成支架与所述切除边缘之间接触足够的一段时间间隔(intervals)，以沿着所述合成支架实现引导的组织生长，使得至少一部分的所述合成支架在所述切除部位处被融合(absorbed)足够的一段时间，以沿着所述合成支架实现引导的组织生长。在支架完全由生物可吸收材料组成的某些实施方式中，该支架将被构造为在引导的组织生长期间维持结构完整性。在某些实施方式中，在所述合成支架在选定区域是由生物可吸收材料组成的情况下，可以设想的是，在实现所述引导的组织生长后，可以同合适的步骤除去支架的剩余部分。
可以通过合适的手段监测所述引导的组织生长。在某些实施方式中，可以在内窥镜下监测组织生长。
在本文所述公开的方法的某些实施方式中，所述方法还可以包括以下步骤：将细胞材料引入到合成支架的聚合物表面上并允许细胞材料生长以形成细胞鞘层的步骤，所述引入步骤和所述使细胞材料生长步骤发生在所述切除步骤之前。
在某些实施方式中，在本文公开的方法中所使用的合成支架是一外表面包含纺丝聚合物纤维的管状构件。在某些实施方式中，所述纺丝纤维可以通过诸如本公开中描述的那些适合的方法进行静电纺丝得到。在某些实施方式中，所述细胞化的鞘层跨越位于外部的静电纺丝纤维的至少一部分。所述细胞化的鞘层可以由细胞材料组成，所述细胞材料包括间充质细胞、干细胞、多能细胞(pluripotentcells)中的一种。所述细胞材料可以从受试对象自体衍生或可以异体衍生。
不受任何理论的束缚，据信，植入诸如本文中公开的各种合成支架，特别是接种有覆盖的细胞鞘的合成支架，促进了与植入的合成支架的位置接触或其邻近的受试对象组织的生长、再生和分化。生长的再生组织由合成支架和相关鞘引导，以产生管状细胞主体，该细胞主体整体连接至剩余管状器官的切除端，并向外扩张以封装合成支架和相关的细胞鞘层。据信，所述支架和所述相关细胞鞘层可以促进或刺激所述切除组织的再生生长，同时使组织排斥反应最小化。我们还认为，所述细胞鞘层的存在可以在生长和分化过程中减少或最小化再生组织对鞘层的渗透。在某些实施方式中，组织再生从各个端部向中间进行。一旦再生组织就位，该合成支架就可以被移除。在某些实施方式中，一经移除该合成支架后，再生的组织结构将缺乏内上皮层。如图11a、11b和11c所示，在移除支架后，分别于支架移除的术后2个月和术后3个月，已观察到内上皮层再生。
为了进一步理解本公开，请参考以下的实施例。列入这些实施例是为了说明的目的，并且将被认为是对本公开和权利要求书中阐述的发明内容的说明。
实施例
实施例ⅰ：食管支架
如图1a所示，制备包含三层材料的合成食管支架。通过静电雾化法将第一层聚氨酯(pu)沉积到金属芯轴上，然后将编织材料沉积在第一pu层上。然后通过静电纺丝法沉积形成第二pu层。然后将形成的支架从芯轴上取下。每个支架定义了一管状结构，该管状结构具有包括三个层(内部静电雾化层、外部静电纺丝层和夹在内部静电雾化层和外部静电纺丝层之间的编织物层)的壁。通过扫描电子显微镜(sem)测定该支架的物理尺寸。平均支架壁厚约为500微米。图1b中示出了壁的一横截面的非限制性sem视图。图1c中示出了管状支架的一横截面的非限制性视图。该图显示横截面大致为“d”形。这可以通过使用具有“d”形横截面的芯轴获得。
外部电纺丝层为限定有孔的聚合物纤维层。外层中的平均纤维直径约为3-6微米。平均孔径约为15-20微米，中值孔径约为25-45微米。
可以将支架连接到能够在生物反应器腔室内的液体介质浴中旋转的支撑件上。旋转机构可以包括磁力传动器，其允许支撑件连同连接的支架围绕其纵向轴在液体浴内旋转。
通过将细胞溶液沉积在支架外表面上，可以将支架接种上细胞(例如mscs或其他干细胞)。然后通过将支架在生物反应器腔室内的液体培养基浴中旋转大约一周，将接种的支架在支持细胞生长的液体培养基中孵育。得到的支架包括与支架的外表面重叠的细胞鞘。在某些实施方式中，该细胞鞘可具有足以为鞘层提供结构完整性的厚度。在某些实施方式中，该细胞鞘将由与支架外表面接触的多个细胞组成，所述多个细胞足以引导再生细胞与鞘接触以产生覆盖所述鞘但不与其融合的组织壁。在某些实施方式中，所述鞘可以由平均厚度在1和100个细胞之间的膜(lining)组成。某些实施方式中，所述膜可以具有10至100个之间、10至30个之间、20至30个之间、20至40个之间、20至50个之间、10至20个之间、30至50个之间、30至60个之间、40至60个之间、40至70之间、70至90之间的细胞厚度。
可以将具有接种的细胞鞘的支架10植入到切除部位，并可以放置在适当位置。可以设想，存在于鞘中的种子细胞(seededcells)能在植入后继续生长。在这种情况下，存在于鞘中的种子细胞将维持及支撑与植入部位处再生的组织分开并串联的结构。
然后将相应的支架植入到猪的食管部位。移除大约5cm的食管部分，并用支架部分替换，所述支架部分被缝合到受试对象中剩余食管组织的端部。
内窥镜监测食管组织的再生数周。
食管是一种长肌肉的管子，其具有颈部、胸部和腹部部分。图2是示出了人体中的食管(esophagus)的横截面的图。在成年人中，食管可以长18厘米至25厘米。食管壁由上部的横纹肌(striatedmuscle)、下部的平滑肌(smoothmuscle)以及中部的横纹肌和平滑肌两者的混合物组成。因此，在本文的一些实施方式中提供了多层合成支架，该多层合成支架可以促进对应天然食管组织层、具有两层或更多层的食管组织的修复和再生。
图3示出了将食管支架植入到猪中1-2周后，天然食管组织和再生食管组织的染色横截面。该横截面显示了基本上所有食管组织层(包括不同的肌肉层和腺体层)的再生。对再生组织的进一步分析显示，支架本身并未融合到再生的食管壁。支架仍然存在于食管内，但支架似乎充当了刺激食管再生的引导，而不是成为再生食管的一个组成部分。
实施例ii：食管植入
如图1a所示，制备包含三层材料的合成食管支架，该合成食管支架带有聚碳酸酯-聚氨酯的外静电纺丝层，其由溶解在六氟异丙醇((hfip，dupont,威尔明顿，特拉华州，美国)中的12％w/v的聚碳酸酯型聚氨酯溶液沉积而成。所使用的静电纺丝装置是购自荷兰，海尔德罗普(netherlands)的imetechnologies公司。静电纺丝纤维被收集在旋转速度为800rpm的目标铝芯轴上，并被放置在距注射器尖端22毫米处以沉积各向同性纤维，产生平均壁厚为500微米的支架。将支架在真空中干燥除去残留溶剂。然后通过低压等离子体系统(dienertetra150-lf-pc-d)、用2次顺向循环的乙烯和氧气气体对该支架进行等离子体处理。对支架进行伽玛灭菌(思泰瑞公司(steris)，诺斯伯勒，麻省)。所采用的伽玛线的剂量范围是25-35kgy。
所形成的管状物为由静电纺丝聚氨酯组成的聚合物支架，所述聚合物支架的均一外径(od)为22mm，长度为11cm。
采用扫描电子显微镜(zeiss-evoma10)来分析静电纺丝显微的形貌。采用溅射镀膜机(cressington-208hr,tedpella,inc,雷丁市，加州)在压力为8x10-2mbar、电势为300v下对支架样品进行溅射镀铂和钯膜两分钟。用重力测量法来计算孔隙度。孔隙度ε是根据纤维毡的表观密度ρapp、聚合物的体积密度ρpu来定义，其中，ε＝1-ρapp/ρpu。表观支架密度ρapp以在10毫米干盘上的质量体积比来度量:ρapp＝mass/vpu。利用水银孔隙度系统(micromeriticsautoporeiv)进行孔径测试。根据astmd638指南，利用1kn测压元件对安装在机电负载框架(instron5943装置)上的10毫米×40毫米样品进行拉伸试验。所有样品的测试参数是相同的，数据采集速率为100hz、标距长度(gaugelength)为30mm、测试速度为1毫米/秒。如图7a所示，提高放大倍数的扫描电子显微镜照片显示了静电纺丝合成支架的各向同性纤维排列。纤维的光滑表面及各向同性性质保证了支架在各个方向上的强度和弹性都是均匀的。
在三个植入前和三个植入后的支架上进行单轴力学载荷的拉伸试验(图7b)，均显示出类似的体内载荷值结果。六个样品在体内载荷下的一致性表明，该支架在制造和体内植入后具有很低的可变性(图7b、图7c)。六个支架的平均(±sd)拉伸应变(tensilestrain)范围在119.5±1.61mm与124.5±3.44mm之间。在断裂拉伸应变方面，样品在植入前的拉伸应变达到397.38％±5.52％，植入后达到408.61％±17.64％。400％以上的应变值表明了该制备工艺的可靠性和相对的体内稳定性。支架植入前后的断裂拉伸应力(tensilestressatfailure)分别在7.25±0.59mpa和4.43±0.77mpa。因此，样品植入前的杨氏模量(young’smodulus)比样品植入后的杨氏模量大，尽管这两组在体内应变方面的弹性相当(图7b、图7c)。断裂载荷(theloadatfailure)与杨氏模量的趋势相同，即，植入前的断裂载荷值大于植入后的断裂载荷值。
将8只猪在开放脂肪活检后分离出自体猪脂肪间充质干细胞(amscs)，并进行特征分析。在无菌、开放的取自侧腹壁的脂肪组织活检前，对8只尤卡坦小型猪(yucatanmini-pigs)进行全身麻醉和氯己定(chlorhexidine)备皮。在白线(lineaalba)旁制造了一个5厘米的切口，并用电灼术止血。分离出约30-50g的脂肪组织，并转移到50ml锥形管，该锥形管中含有α-最小必需培养基(mem)/glutamax培养基(赛默飞世尔科技公司，沃尔瑟姆，麻省)和1％的青霉素/链霉素(赛默飞世尔科技公司)。
从每只麻醉的尤卡坦小型猪(体重50-60kg)中切除20-60g的腹部脂肪组织。将该组织样品在α-最小必需培养基(mem)/glutamax培养基(赛默飞世尔科技公司)和1％青霉素/链霉素(赛默飞世尔科技公司)中冲洗3次。对冲洗后的组织进行修整，以去除淋巴结和血管，并切碎成小于5毫米的碎片。将该组织碎片于37℃、5％co2下在消化缓冲液(300iu/mlii型胶原酶、0.1％牛血清白蛋白(7.5％，第五组份(fractionv))、1％青霉素/链霉素、α-mem/glutamax)中解离55分钟。在完全生长培养基(stemxvivo培养基(r&dsystems,明尼阿波利斯，尼苏达州)和1％青霉素/链霉素)中终止解离后，将细胞在1500rpm下离心15分钟。将细胞团重悬于5ml生长培养基中，并经70μm的过滤器进行过滤。将细胞滤液在1500rpm下离心15分钟，将细胞团重悬于5ml的生长培养基中，并根据组织重量来接种细胞(3g离体脂肪组织/每个含20ml生长培养基的t75烧瓶)。
用不含钙或镁的pbs(赛默飞世尔科技公司)洗涤细胞2次，并用tryple(赛默飞世尔科技公司)解离细胞。用生长培养基终止解离，并将细胞在1000rpm下离心5分钟。将细胞团重悬于用pbs稀释的1％牛血清白蛋白中。将含1百万个细胞的等分在抗体中于4℃的黑暗条件下孵育30分钟(见补充表1)。将标记的细胞在缓冲液中洗涤3次，必要时在4℃的黑暗条件下使用二抗(加利福尼亚州，卡尔斯巴德，生命技术公司)30分钟。再进行3次洗涤后，将细胞悬液置于96-孔板中，以进行流式细胞(guavaeasycyteht,emdmillipore,比尔里卡，麻省)分析。基于生存能力的测量，对代表活细胞的事件进行正向散射和侧散射值的门运算(viacount,emdmillipore)。采用荧光补偿事件对未染色样品和同型对照的抗体染色的样品进行细胞类型分析。将获得的数据导出，并使用独立的软件(flowjoversion10,flowjo,llc,ashland,俄勒冈州)进行分析。
为评估菌落形成，按如上所述的方法分离出脂肪细胞，捣碎成单个细胞悬液，并稀释到10细胞/ml的生长培养基。向96孔板(康宁公司，康宁市，纽约州)的每孔中加入100μl的该细胞悬液，第二天目视检查细胞数。5-7天后，可见细胞菌落，且每3天更换一次培养基直至该菌落至少含有50个细胞。对存在菌落的孔进行计数，并表示成其与总孔数的百分比。
分离出的脂肪细胞的多能性是通过它们受化学诱导形成脂肪和成骨的能力来测定。将细胞分别接种于6孔组织培养板中，在完全生长培养基中培养，并允许细胞分别生长至用于细胞脂肪分化的60％汇合度或用于细胞成骨分化的100％汇合度。在达到汇合度时，将培养基替换成脂肪分化培养基或成骨分化培养基(ccm007,r&dsystems,明尼阿波利斯，尼苏达州)。每2天更换一次培养基，直至培养14天。对培养在成脂分化培养基中的细胞进行油红o(americanmastertech，洛蒂，加州)染色以鉴定脂肪，对培养在成骨分化培养基中的细胞进行茜素红(emdmillipore)染色以鉴定钙沉积。
在接种时和接种2天、5天和7天后，在生物反应器的条件培养基中测定葡萄糖和乳酸的浓度(istat,雅培，普林斯顿，新泽西州)。
对细胞上清液进行分析以确定猪细胞因子和生长因子的产生，可在luminex200平台上通过多重分析法分析，或在明尼苏达大学细胞因子参考实验室，按照制造商的指示，通过采用市售试剂盒进行elisa分析。13丛(plex)的猪专用珠板(emdmillipore)用于测定猪vegf、gm-csf、il-1ra、il-6和il-8水平。从各板产生的标准曲线中插入数值，可采用适用于luminex平台的伯乐(bioplex)软件(伯乐公司(biorad)，赫拉克勒斯，加州)，或者采用适用于在biorad550读板器上读取的elisa板的酶标仪管理软件来产生标准曲线。对所有样品进行重复测试。
将细胞在pbs中洗涤，并在室温下用10％福尔马林固定15分钟。在含0.1％的tritonx-100的pbs(pbs-t)中轻轻洗涤细胞3次，并将细胞在稀释于pbs-t中的10％正常山羊血清(vector)中室温孵育1小时。将兔抗巢蛋白抗体(biolegend，1:100)稀释在10％正常山羊血清和pbs-t中，于4℃下过夜孵育。将细胞在pbs-t中漂洗两次，并将其在荧光标记的羊抗兔抗体(alexafluor594，赛默飞世尔科技公司)中室温孵育1小时。漂洗细胞2次，并用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)进行复染。
在37℃下复染48小时后，将细胞在含钙和镁的磷酸盐缓冲液(赛默飞世尔科技公司)中洗涤2次，并用新鲜的生长培养替换。之后，每2天更换一次培养基，直至烧瓶达到70％—80％汇合度。在传代时，将细胞解离(tryple，赛默飞世尔科技公司)，计数(countess，赛默飞世尔科技公司)，并将其以200000个细胞/瓶的量重新接种到t175烧瓶中。
将每个11cm长的支架放置在生物反应器中，并用在补充有0.1875％的碳酸氢钠、mem(lonza)和0.01m盐酸中的1.19mg/ml的牛胶原蛋白(organogenesis)的生长培养基中的3200万个细胞进行接种(生存能力>70％，台盼蓝排染法，countess，赛默飞世尔科技公司)。将细胞在37℃、5％co2下孵育5分钟，然后向该生物反应器中缓慢加入200ml的生长培养基。将生物反应器在支架植入前孵育7-8天。每2天更换培养介质，并进行如下文描述的各种分析。
将猪amscs接种到已表征过的支架上，随后置于生物反应器中进行孵育。然后将接种的支架植入到以下食管切除后的尤卡坦小型猪中，直至3周后移除支架(图6)，并采用用于阳性染色的已知的msc标记物抗猪-cd44、cd73、cd90、cd105和cd146抗体，及用于阴性染色的cd14、cd45、cd106、cd271和slaclassiidr进行重复染色。超过95％的培养细胞被巢蛋白和αsma阳性染色，这表明在培养过程中保持了干细胞特性。多能性是通过化学诱导猪msc分离菌分别形成脂肪细胞和成骨细胞的能力来测定。将这些amscs进行常规扩增，并对第1至第5代进行表征，它们表现出一致的表型和功能特征。
将第2代的猪amscs接种到聚合物支架上，并在生物反应器中于37℃下孵育7天(+/-1天)。采用酶联免疫吸附法(elisa)测定细胞因子和生长因子的数量，以确定培养在支架上的接种amscs是否分泌可能有助于血管生成和免疫调节的因子。测出条件培养基中的细胞分泌物血管内皮生长因子(vegf)、粒-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、白细胞介素(il)-6、il-8和il-1ra仅在中等以上水平(图4a)。然而，对其他的细胞因子tnf-α、il-1α、il-1β、inf-γ、il-10、il-12、il-18、血小板衍生生长因子(pdgf)、调节活化正常t细胞表达和趋化因子(rantes)进行了测定，但未检测出。
在7天的培养时间结束时，对接种的移植物的切片进行穿刺活检(punchbiopsies)，以评估细胞的健康状况和对支架的渗透情况。通过采用钙黄绿素(活细胞)和溴化乙锭(死细胞)的免疫荧光染色法来评估细胞健康状况。采用用以细胞鉴定的溴化乙锭来评估该支架的细胞渗透性。通过活检标本的钙黄绿素染色的主导现象(predominance)表明了附着在支架上的活细胞种群。在支架活检的横截面上，大多数细胞附着在支架表面。尽管有一些证据表明了在支架内的细胞增殖和生长。在生物反应器孵育过程中，每48小时测量一次移植物的代谢活性，以测定葡萄糖摄取量和乳酸生成量。条件培养基的测量一致表明，随着时间的推移葡萄糖水平减少和乳酸水平增加，这是持续代谢的细胞生长的两个指标。此外，将在生物反应器中7天内的细胞扩增情况用总dna含量进行量化，发现总dna含量在生物反应器细胞接种过程中增加了几倍。培养7天后支架上细胞表型的进一步鉴定显示，细胞持续表达α-平滑肌肌动蛋白(αsma)和巢蛋白。
在对动物进行气管内插管和全身麻醉诱导后，将动物以左侧卧位放置。剪去毛发，用氯己定或聚维酮碘进行备皮，并对动物进行无菌覆盖。在每个动物的第四肋间高度上进行标准右侧开胸手术，并进入胸腔。通过使用双腔气管导管来实现单肺通气。周向移动位于中胸段(右肺门后方)的一个4-4.5厘米的食管段，将其切除以产生6cm的缺损(近端和远端的组织收缩)。然后采用聚对二氧环己酮(pds，美国强生爱惜康公司，萨默维尔，新泽西州)可吸收缝合线将接种的支架(6cm长)植入并吻合到食管近端和远端。在植入后，在直接内窥镜指导下(storzvideogastroscopesilverscope9.3mmx110cm，图特林根，德国)置入市售食管支撑架(wallflexm00516740，波士顿科学公司)。在内窥镜可视化和手术可视化下进行支架置入。用可吸收缝线将食管支架固定于正常食管组织，处于在近端支撑架和远端支撑架处。
术后动物是通过胃造瘘术灌食(gastrostomyfeeding)来辅助支持，并经饲管保持流质饮食2周，捣碎的饮食再2周，然后允许其吃固体食物的经口饮食，之后继续进行研究。
植入支架约21天后，内窥镜下取回该支架，采用amsc灌注的富血小板血浆(prp)凝胶以提高新生食管导管的愈合过程。在采用prp之后，将一个新的全覆盖食管支撑架(wallflextm，12cm长x23mm外径，波士顿科学公司)置于植入区周围，以防止狭窄的形成并在再生过程中保持解剖结构。每隔两周进行动物镇静，及食管吻合和食管支架交换的评估，以使得直接可视化食管再生进展。后续进行内窥镜(storzvideogastroscopesilverscope9.3mmx110cm，图特林根，德国)观察。
还通过内窥镜检查来评估再生进展。在支架拆除后，内窥镜观察植入区近3-4周；示出了2个代表性动物(图10和图11)。植入3-4周后，仅部分完成了粘膜层(mucosallayer)的再生。然而，在2层融合前，粘膜层的近端和远端形成初始脊，及完整的粘膜再生(mucosalregeneration)指示了食管愈合过程随时间推移继续进行。食管连贯性和完整性的早期重建，及从切除部分两个对边的粘膜下层(submucosa)的随后生长在所有八种动物中都是一致的；2只动物可维持至术后8个月和9个月，且这2只动物分别在2个月、3个月内没有食管支撑架而无狭窄迹象，且它们有持久的口服摄入量及显著的体重增加。
为了确定再生和原生的食管组织形态的组织学相似性。术后2.5个月从代表性的猪食管中取出组织样本，并对包括手术部位和邻近的远端(distal)和近端(proximal)的组织进行组织学检查(图13a，虚线框表示组织学分析标本)。苏木精-伊红(图13b和图13d)染色的和马松(masson)三色法染色(图13c和图13e)的组织切片的代表图片显示了组织完整的多层食管上皮细胞(esophagealepithelia)、粘膜下层(submucosa)及正常内肌层(normalinnermuscularlayer)形态。
图14描述了再生区域的代表性免疫组织化学分析，其描述了在植入如本文所述的细胞化支架2.5个月后，猪食管组织的组织学分析。图14a描述了切除后的食管(近左端缝合)的宏观图像。将组织样本切除以包括手术部位，并用内窥镜监测组织样本及相邻的远端和近端组织(虚线框)以用来组织学检查。图14b-图14e为苏木精-伊红(图14b和图14d)染色和马松三色法染色(图14c和图14e)的组织切片的代表图片。代表性免疫组织化学分析证明了ki67的免疫反应性(图14f)，这暗示了粘膜细胞和粘膜下层细胞cd31(图14g)、cd3ε(图14h)、αsma(图14i)、转凝蛋白(transgelin)/sm22α(图14j)的继续增殖，及手术部位处的组织中横纹肌肌球蛋白重链(striatedmyosinheavychain，striatedmhc)(图14k)的相对缺失。比例尺：f-k＝200μm。ki67在2.5个月的免疫反应性(图14f)，暗示了粘膜细胞和粘膜下层细胞、cd31(图14g)、cd3ε(图14h)、αsma(图14i)、转凝蛋白/sm22α(图14j)的继续扩增，及手术部位处的组织中横纹肌肌球蛋白重链(图14k)的相对缺失。αsma、sm22α的主导现象及与肌球蛋白重链的相对缺失表明：平滑肌增殖先于骨骼肌生长。
接种有自体衍生的间充质干细胞(amscs)的合成基质，导致切除后的食管的充分纵向再生及最小的黏膜溃疡(mucosalulceration)或穿孔(perforation)(表1)。在移除植入物后，所有的动物自2-9周经历了100％的充分纵向再生，6只动物中有1只经历了粘膜溃疡或穿孔。在研究过程中没有动物经历过泄漏(leak)。
表1
实施例iii–其他胃肠道植入
可以替换局限于直肠的胃肠道区域来实施实施例i和实施例ii所述的过程。结果类似于先前概述的结果。
这里已经描述了关于本发明的方面的几种实施方式，可以理解的是，本领域技术人员将容易地进行各种改变、变形和改进。这些改变、修改和改进也视为本公开的一部分，且涵盖在本发明的精神和保护范围内。因此，前述的说明书和附图仅仅是示例。
本说明书和权利要求书中所用的词“一个”及“一”，应理解为“至少一个”，除非明确指明相反的意思。
本说明书和权利要求书中所使用的短语“和/或”，应理解为连接在一起的两个元素中的“一个或两个”，即，在某些情况下两种元素是结合地存在，在其他情况下是分别存在。除“和/或”从句明确指出的元素外，还可选择性地存在其他元素，无论它们是否与明确指出的这些元素相关或无关，除非明确指明相反的意思。因此，作为一个非限制性的例子，“a和/或b”，当与开放式语言(如“包含”)结合使用时，在一实施方式中可指“有a无b”(可选地包括除b以外的元素)，在另一实施方式中可指“有b无a”(可选地包括除a以外的元素)，在又一实施方式中可指“a和b”(可选地包括除a、b以外的元素)等。
本说明书和权利要求书中所使用的“或”，应理解为具有与上面定义的“和/或”相同的含义。例如，当与一组中的项(item)区分时，“或”或“和/或”应被解释为包含，即，包含若干元素或元素组中的至少一个，但也包括一个以上，且可选地包括其他未列出的项。只有明确指出相反意思的术语，例如“只有一个”或“确切的一个”，或者当在权利要求中使用时的“包括”，将指确切地包括若干元素或元素组中的一个元素。一般来说，本文所使用的术语“或”在排它性术语(例如“或”、“…中的一个”、“仅…中的一个”或“只有…中的一个”)之前时，其仅被解释为表示专有的替代品(即，一个或另一个格式，但不能两个都有)。当在权利要求书中使用“基本由…所组成”，应当具有专利法领域所使用的一般性含义。
本说明书和权利要求书中所使用的、关于一个或多个元素的组的短语“至少一个”，应当理解为从元素组中的任何一个或多个元素中所选择的至少一个元素，但不一定包括元素组中具体列出的每一个元素，且不排除元素组中元素的任何组合。除元素组中明确指出的元素外，该定义还允许可选地存在与那些明确指出的元素相关或无关的其他元素。因此，作为一个非限制性的例子，“a和b的至少一个”(或等同于“a或b中的至少一个”、或等同于“a和/或b中的至少一个”)，在一实施方式中可指“至少一个，可选地包括不止一个a而无b(可选地包括除b以外的元素)”；在另一实施方式中可指“至少一个，可选地包括不止一个b而无a(可选地包括除a以外的元素)”；在又一实施方式中可指“至少一个a(可选地包括不止一个a)和至少一个b(可选地包括不止一个b)”(可选地包括除a、b以外的元素)等。
在权利要求书中及上述说明书中，所有的过渡性短语，例如“包括”、“包含”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“容纳有”等，应当被理解成是开放式的，即，是指“包括但不限于”。如美国专利局专利审查程序手册第2111.03条所阐述的，只有过渡性短语“由…组成”和“基本由…组成”应分别被理解成封闭或半封闭的过渡短语。
权利要求书中用于修饰声称元素(claimelement)的序数词(诸如“第一”、“第二”、“第三”等)的使用，本身并不暗示任何优先权、优势、或一个声称元素相对于另一个声称元素的次序、或执行一方法的时间顺序，但仅仅用作来区分具有一确切名字的一声称元素与具有相同名称的另一个声称元素的标签。
虽然已经结合某些实施方式描述了本公开，但可以理解的是，本公开并不限于所公开的实施方式，相反，本公开旨在涵盖在所附权利要求的范围内的各种改进和等效变形，所附权利要求的范围应得到最广泛的解释，以便包括法律允许下的所有这些改进和等效结构。